Ausgewählte Techniken der Laboratoriumsmedizin

52.1 Immunchemische Techniken

Lothar Thomas

52.1.1 Antigen-Antikörperreaktion

Das Prinzip immunologischer Nachweistechniken ist die Antigen-Antikörperreaktion. Antigen (Ag) und Antikörper (AK) gehen in wässriger Lösung eine spezifische, reversible Assoziationsreaktion zum Antigen-Antikörper Komplex (Immunkomplex) ein, unter Beibehaltung ihrer Struktur.

Die bipolaren Zentren der Assoziationsreaktionen von Antigen und Antikörper sind in den Bindungsplätzen der variablen Domäne des Immunglobulins und den Immundeterminanten (Epitopen) des Antigenmoleküls lokalisiert.

52.1.1.1 Epitop und korrespondierender Antikörper

Epitop

Das Epitop ist die antigene Determinante bzw. Kontaktfläche des Antigens, das sich an die Bindungsstelle des Antikörpers anheftet. Es handelt es sich um eine räumliche Struktur von etwa 30 Aminosäuren, aber kristallographische Analysen der Röntgenstruktur haben ergeben, dass im Maximum von nur bis zu 17 Aminosäuren in die direkte Bindung mit dem Antikörper involviert sind /1/.

Korrespondierender Antikörper

Immunglobuline bzw. Antikörper sind Glykoproteine von Y-förmiger Struktur und bestehen aus vier Polypeptidketten, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die beiden schweren Ketten (H-Ketten) und die beiden leichten Ketten (L-Ketten) sind jeweils identisch. Vom Antikörper wird durch Pepsin das F(ab)₂-Fragment von der Fc-Region abgespalten und durch Papainbehandlung entstehen die Einzelnen Fab-Fragmente.

Siehe Abb. 52.1-1 – Struktur eines Immunglobulins und Spaltung durch Papain und Pepsin.

Die H- und L- Ketten des Antikörpermoleküls enthalten Untereinheiten, auch als Domänen bezeichnet, von denen einige gleich sind (konstante Domänen) und andere verschieden (variable Domänen). Drei variable Domänen der L-Kette und drei variable Domänen der H-Kette jedes Arms des Y-förmigen Moleküls bilden die Antigenbindungsstelle mit die Complementary determining regions (CDRs). Die CDRs bestimmen die spezifische Chemie, die Natur und die Gestalt des zu bindenden Epitops /1, 2/. Die Kontaktfläche des Antikörpers, an die sich das Epitop anlagert wird als Paratop bezeichnet. Das Paratop ist Bestandteil der Oberflächenstruktur der Antigenbindungsstelle, die als Idiotyp bezeichnet wird. Das Paratop besteht aus sechs Schleifen hypervariabler Sequenz von 50–60 Aminosäuren.

Siehe Abb. 52.1-2 – Das Immunglobulinmolekül hat eine Anzahl von Idiotypen, deren Gesamtheit als Isotyp bezeichnet wird.

Die Spezifität der Antigen-Antikörperreaktion beruht auf:

• Der Komplementarität der Oberflächen von Paratop und Epitop.
• Sie ist in der Regel so übereinstimmend, dass Vertiefungen des einen durch Ausbuchtungen des anderen ausgefüllt werden /1, 2/. Die Bindungen von Epitop und Paratop in den CDRs umfassen van der Waal’sche Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen zwischen polaren Gruppen und Ionenpaar-Bindungen zwischen unterschiedlich geladenen Seitenketten.

Idiotyp

Der Idiotyp umfasst die Summe aller Idiotope auf einem Antikörper.

Anti-idiotypische Spezifität: Ein anti-idiotypischer Antikörper ist gegen die hypervariable Region der Antigenbindungsstelle eines Immunglobulinmoleküls gerichtet.

Anti-isotypische Spezifität

Ein anti-isotypischer Antikörper ist gegen eine konstante Region des Immunglobulinmoleküls gerichtet.

52.1.2 Komponenten des Immunoassays

Komponenten des Immunoassays sind das Antigen und der Antikörper. In vitro können das Antigen oder der korrespondierende Antikörper nachgewiesen werden. Der Nachweis des Antikörpers im Untersuchungsmaterial, z.B. Patientenserum, setzt die Zugabe des entsprechenden Antigens zum Testsystem voraus. Antigene können nur bestimmt werden, wenn das Testsystem den korrespondierende Antikörper enthält.

Zur Herstellung der spezifischen Antikörper muss das Antigen ein Immunogen sein oder so verändert werden, dass es immunogen wirkt.

52.1.2.1 Immunogen

Das Immunogen ist eine Substanz, die eine Immunantwort im Organismus bewirkt. In den Immunoassays ist das Immunogen entweder mit dem Analyten identisch oder es handelt sich um eine Substanz, die gleiche charakteristische Merkmale wie der Analyt hat.

Zwischen dem Immunogen und dem Antigen bestehen Unterschiede. Das Antigen bindet an einen spezifischen Antikörper. Während alle Immunogene auch Antigene sind, wirken nicht alle Antigene immunogen. Die in den Immunoassays als Reagenz eingesetzten Antigene sind gereinigte Immunogene, die so aufbereitet sind, dass keine Zerstörung von Teilantigenen oder der physikalischen Antigenstruktur von Relevanz für die Spezifität des Immunoassays sind.

52.1.2.2 Antikörper

Die Funktion des Antikörpers besteht darin, die Spezifität des Immunoassays für den Analyten zu sichern und dessen Quantifizierung zu ermöglichen. Die im Immunoassay verwendeten Antikörper können polyklonal, monoklonal, gemischt monoklonal oder kombiniert polyklonal-monoklonal sein. Gewöhnlich garantiert eine hohe Sensitivität und Spezifität des Antikörpers eine den Anforderungen gerechte Nachweisempfindlichkeit des Immunoassays. Gelegentlich kann jedoch eine hohe Affinität mit einer verminderten Spezifität einhergehen, deshalb müssen für einen entsprechenden Immunoassay die erforderlichen Kriterien für eine zuverlässige Analytik genau festgelegt werden.

Generell gibt es zwei Methoden der Herstellung von Antikörpern /3/:

• Die Immunisierung von Tieren mit dem Immunogen, gegen das man Antikörper erhalten will. Gewöhnlich wird ein auf polyklonaler Antikörpersynthese beruhendes Antiserum gewonnen, das Antikörper unterschiedlicher Spezifität, Avidität, Valenz und Bindungskinetik gegen verschiedene Epitope des Antigens enthält.
• Die in vitro-Hybridisierung von Antikörper sezernierenden B-Zellen aus der Milz einer Antigen sensitivierten Maus mit einer Myelomzelle und nachfolgender Klonierung und kontinuierliche Züchtung in der Zellkultur. Die gebildeten monoklonalen Antikörper sind im Idealfall gegen ein Epitop des Antigens gerichtet und von identischer Spezifität, Avidität und Valenz bei gleicher Bindungskinetik.

Polyklonaler Antikörper

Polyklonale Antikörper werden aufgrund der Immunisierung von Tieren mit dem gewünschten Immunogen (immunogenes Antigen) immunisiert. Gewöhnlich wird ein Antiserum erhalten, das auf einer polyklonalen Antikörperbildung basiert und eine Palette von Antikörpern unterschiedlicher Sensitivität, Spezifitär, Avidität, Valenz und Bindungskinetik mit verschiedenen Epitopen des Immunogens hat. Der Antikörper mit der optimalen Charakteristik für den Immunoassay wird ausgewählt.

Monoklonale Antikörper (mAk)

MAk gehören einer Immunglobulin (Ig)-Klasse, einem Ig-Typ und einer Antikörperspezifität an. Alle Moleküle haben identische physikalisch chemische Eigenschaften. MAk haben eine sehr beschränkte strukturelle Diversität und sind homogen im Vergleich zu polyklonalen Antikörpern.

In Mäusen oder Zellkulturen sind mAk theoretisch gegen jedes Antigen produzierbar. Das Prinzip und den Ablauf der mAk-Bildung zeigt Abb. 52.1-3 – Prinzip der Produktion monoklonaler Antikörper.

Abhängig von dem Anwendungszweck sind mAk nicht immer von Vorteil im Vergleich zu mittels Affinitätschromatographie gereinigten polyklonalen Antikörpern. So haben mAk gewöhnlich eine niedrigere Affinität und Avidität als polyklonale Antikörper.

Die Erkennung nur eines Epitops kann nachteilig sein:

• Für die Spezies weite oder Genus weite Erkennung von Antigenen infektiöser Erreger.
• Bei Methoden der Immunpräzipitation, wenn die antigene Dichte gering ist.
• Wenn das Antigen auch von z.B. anderen Erregern einer Infektion exprimiert wird, somit resultiert eine Unspezifität.

Die Hersteller von Immunoassays begegenen dieser Problematik durch die Anwendung eines Cocktails von mAk differenter Epitopspezifität.

Produktion von mAk: Antigen sensibilisierte B-Lymphozyten mit der Information zur spezifischen Antikörperbildung werden mit Plasmazellen eines Myeloms fusioniert. Die Myelomzellen werden durch Induktion eines Myeloms in der Maus durch Mineralölinjektion erzeugt. Daraus wird eine unsterbliche Plasmazelllinie kultiviert. Die fusionierte Zelle, auch als Hybridzelle bezeichnet, vermag als Ig-Fabrik Antikörper einer Klasse und eines Typs mit identischen Eigenschaften zu bilden /3, 4/.

In die fusionierte Zelle wird die Information der Bildung von Antikörpern von einer B-Zelle mitgebracht, die aus der Milz der Maus stammt, welche zuvor mit dem relevanten Antigen immunisiert wurde. Antigen sensibilisierte B-Zellen sind in vitro nur begrenzte Tage lebensfähig.

Die aus speziellen Myelomzelllinien von Mäusen stammende Plasmazelle liefert als Fusionspartner die Eigenschaften der der Immunglobulinsynthese und der Unsterblichkeit.

Nach der Fusion werden die Zellen in HAT-Nährmedium (HAT, Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) kultiviert. Im HAT-Medium werden die schnell wachsenden, nicht fusionierten Elternzellen von den langsam wachsenden Hybridzellen durch Absterbenlassen der Elternzellen (Antigen-sensibilisierte B-Zellen, Plasmazellen) abgetrennt. Die Antigen sensibilisierten B-Zellen sterben von allein in wenigen Tagen ab.

Das Absterben der Plasmazellen erfolgt durch Hemmung ihrer Purinsynthese durch den Folsäureantagonisten Aminopterin. Da anstatt normaler Plasmazellen Myelomzell-Mutanten als Fusionspartner der Antigen-sensibilisierten B-Zelle eingesetzt werden, denen die Alternativwege der Purinsynthese über die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) und die Thymidinkinase fehlen, ist die Purinsynthese dieser Zellen vollständig blockiert.

Die Hybridzellen vermögen Purine zu synthetisieren, da ja die Antigen sensibilisierte B-Zelle als Fusionspartner einen intakten HGPRT-Alternativweg mitgebracht hat.

Nach Kultivierung der Hybridzellen über Wochen werden sie auf ihre Ig-Bildung geprüft und in einem Selektionschritt so aufgeteilt, dass theoretisch nur eine Hybridzelle in der weiteren Kultivierung sich unter Bildung eines Zellklons (Klonierungsschritt) vermehren kann.

Als letzter Arbeitsschritt werden die von den Klonen gebildeten Antikörper bezüglich ihrer Eigenschaften auf das definierte Antigen untersucht und der Klon, der Antikörper mit optimalen Eigenschaften liefert, für die Großproduktion von Antikörpern ausgewählt. Diese erfolgt entweder in der in-vitro Massenkultur oder im Ascites von Versuchstieren. Eine Hybridzelle produziert etwa 50 ng Immunglobulin täglich.

52.1.3 Immunchemische Definitionen

Die nachfolgenden Definitionen entsprechen dem Vokabular aus Lit. /5/.

Affinität

Die einfachste Immunreaktion ist die eines singulären Antigens (Epitop) mit seiner korrespondierenden Bindungsstelle (Paratop) auf dem Fab-Fragment eines monomeren Antikörpermoleküls. Die Bindungsstärke zwischen beiden Reaktanden (die primäre Interaktion) ist das Nettoergebnis von anziehenden und abstoßenden Kräften, die beide Moleküle aufeinander ausüben und wird als Antikörperaffinität oder intrinsische Affinität bezeichnet. Da es sich um ein thermodynamisches Geschehen handelt, wird es durch eine Gleichgewichtskonstante (K) beschrieben:

K = AgAk/Ag × Ak

Hoch affine Antikörper dissoziieren nur schwer von ihrem AgAk-Komplex und benötigen dazu eine hohe Energie.

Die Messung der Antikörperaffinität kann idealerweise nur zwischen monoklonalen Antikörpern und Epitopen erfolgen. Werden komplexe Antigene und polyklonale Antiseren verwendet, kann nur die mittlere Antikörperavidität bestimmt werden.

Antikörper

Spezifisches Ig, das von zur Plasmazelle transformierten B-Zelle als Antwort auf den Kontakt der B-Zelle mit einem Immunogen gebildet wird. Die Synthese des Ig erfolgt durch eine Plasmazellfamilie (Klon).

Antigen

Antigene stimulieren die Bildung von Antikörpern und binden an diese.

Assay

Quantitativer Test zur Bestimmung der Menge, der Aktivität oder Kraft eines Bestandteils oder einer Eigenschaft.

Avidität

Nettoaffinität aller Bindungsstellen aller Antikörper in einem Antiserum unter spezifizierten physikochemischen Bedingungen.

Bindungskapazität

Die Bindungskapazität beschreibt die Kapazität eines Rezeptors, z.B. eines IgM-Antikörpers, zur Bindung von Liganden, z.B. eines Antigens.

Cut-off-Wert (Grenzwert)

Der quantitativ gemessene Wert eines Analyten, der angewendet wird zur Entscheidung, ob ein Ergebnis oberhalb oder unterhalb eines klinischen oder analytischen Entscheidungswerts liegt.

Epitop

Die chemische Gruppierung eines Antigens, an das ein Antikörper binden kann.

Fluorophor

Substanz, die fluoreszierendes Licht aussendet, wenn sie durch elektromagnetische Strahlung angeregt wird.

Heteroantikörper

Heteroantikörper reagieren mit Antigenen von einer anderen Tierspezies. So werden z.B. bei der Epstein-Barr-Virusinfektion Antikörper gegen virale Antigene gebildet, die zusätzlich noch mit Epitopen auf Schaferythrozyten kreuzreagieren und eine Hämagglutination bewirken (Paul und Bunell-Reaktion).

Heterospezifität

Eigenschaft eines Antiserums mit Reaktivität gegenüber verschiedenen Antigenen.

Heterogener Immunoassay

Immunoassay, der zur Trennung des freien Antigens von dem als Immunkomplex gebundenen Antigen der physikalischen Trennung vor der quantitativen Messung bedarf.

Homogener Immunoassay

Immunoassay, bei dem der Analyt (in der Probe) und das immunchemischen Reagenz (Antikörperkonjugat im Testreagenz) gemischt werden und bei dem kein Waschschritt erforderlich ist, bevor die gebundene Fraktion (Analyt gebunden an das Antikörperkonjugat) gemessen wird. Voraussetzung ist, dass der Analyt nach Bindung an das Antikörperkonjugat ein gut messbares Dose-response-Signal erzeugt zur Unterscheidung der gebundenen von der ungebundenen Fraktion.

Immunkomplex (Antigen-Antikörper-Komplex)

Antigene reagieren mit Antikörpern in wässriger Lösung unter Bildung von Immunkomplexen.

Die Bildung des Immunkomplexes nimmt ab:

• Mit fallenden pH (pH < 7).
• Durch Anstieg der Ionenstärke (sehr schnelle Reaktion in Ionen armer wässriger Lösung).
• Mit steigender Temperatur.

Die Größe der Immunkomplexe und ihre Löslichkeit ist abhängig vom Mengenverhältnis Antigen zu Antikörper im Reaktionsansatz. Im Überschuss von Antikörper oder Antigen ist der Immunkomplex löslich und kleiner als bei -Äquivalenz von Antigen und Antikörper. Im Äquivalenzbereich ist der gebildete Immunkomplex groß, unlöslich und präzipitiert.

Siehe Abb. 52.1-4 – Immunkomplexbildung bei unterschiedlichen Mengenverhältnissen von Antigen und spezifischem Antikörper.

Bei den Verfahren der Immunnephelometrie und der Immunturbidimetrie zur Bestimmung unbekannter Antigenkonzentrationen in freier Lösung wird im mäßigen Antikörperüberschuss gearbeitet. Es bilden sich dann noch lösliche Immunkomplexe in der Größe bis 0,5 μm, was einem Molekulargewicht bis 100.000 kDa entspricht. Ein solcher Komplex enthält etwa je 200 Antigenmoleküle und Antikörpermoleküle.

Immunpotenz

Charakteristik eines Antikörpers in einer Immunreaktion. Die Potenz resultiert aus der Avidität des Antikörpers und seiner Konzentration. Die Potenz eines Antigens in einer Immunreaktion resultiert aus seiner Konzentration.

Kalibrator

Auf ein standardisiertes Referenzmaterial abgeglichene Lösung, die zur Kalibration eines Assays benutzt wird.

Kompetitiver Assay

Ein Assay, der auf der konkurrierenden Reaktion des markierten und nicht-markierten Analyten um einen Bindeprotein oder Rezeptor beruht.

Kreuzreaktivität

Die Reaktion eines Antikörpers mit einem Antigen, das verschieden von demjenigen ist, das die Antikörperbildung bewirkt hat. Die Ursachen sind gemeinsame, identische oder ähnliche antigene Determinanten.

Label

Es handelt sich um eine Signal gebende Substanz zur Markierung eines Antigens oder eines Antikörpers um eine Immunreaktion sichtbar zu machen. Als Label (Markierung) wird Radioaktivität, ein Luminophor, Fluorophor oder ein Enzym verwendet.

Ligand

Der Ligand ist eine Substanz oder Teil einer Substanz, die sich an einen Rezeptor, Antikörper oder ein anderes Bindeprotein bindet.

Luminophor

Molekül, das lumineszierendes Licht in Form von Photonen nach adäquater Anregung aussendet.

Postzonen-Effekt

Erhöhte Löslichkeit von Immunkomplexen, die aus einem erheblichen Überschuss von Antigen im Vergleich zur Konzentration des Antikörpers resultiert.

Prozonen-Effekt

Ist das Ergebnis einer suboptimalen Reaktion von Antigen und Antikörper. Sie resultiert aus einem Überschuss von Antigen oder Antikörper oder aber einer der Reaktionspartner, ist inkomplett oder blockiert eine optimale Reaktion.

Spezifität

Die Spezifität beschreibt die Qualität eines Antiserums, mit definierten Antigenen zu reagieren. Bei einem Immunoassay ist die Spezifität ein Kriterium, in welchem Ausmaß der Assay nur mit dem spezifizierten Analyten und nicht mit anderen Substanzen der Probe reagiert.

Spezifische Aktivität

Maß der Ereignisse pro Masseneinheit oder Zeiteinheit.

Tracer

Markierter Analyt zur Messung der Dose-response in einem Immunoassay.

52.1.4 Immunchemische Verfahren

Der in vitro-Nachweis von Antigenen oder Antikörpern ist nur möglich, wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar oder messbar gemacht wird. Die Auswahl der Nachweistechnik ist abhängig von den Eigenschaften des Antigens (Größe, Anzahl und Struktur der antigenen Determinanten), den Eigenschaften des korrespondierenden Antikörpers (Avidität, Spezifität) und der Konzentration des zu bestimmenden Analyten.

Nach folgenden prinzipiellen Techniken werden Antigene oder Antikörper bestimmt:

• Direkter Nachweis.
• Indirekter Nachweis.
• Nachweis auf Grund der Markierung eines der beiden Reaktionspartner.

52.1.4.1 Direkter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern

Immunchemische Verfahren zum Nachweis einer variablen Antikörperkonzentration arbeiten mit einer definierten Antigenmenge, Verfahren zum Nachweis einer variablen Antigenkonzentration mit einer definierten Antikörpermenge. Maßgebend dafür, ob die gebildeten Immunkomplexe in löslicher oder in präzipitierter Form nachgewiesen werden können, ist neben der Konzentration des zu bestimmenden Partners das Mengenverhältnis von Antigen zu Antikörper. Im Bereich des Antikörperüberschusses werden lösliche und kleine Immunkomplexe gebildet. Ihre Konzentration, gemessen z.B. als Streulichtsignal (Immunnephelometrie) oder Absorption (Immunturbidimetrie), ist proportional der Antigenkonzentration.

Siehe Abb. 52.1-5 – Präzipitationskurve nach Heidelberger und Kendall.

Mit zunehmender Antigenkonzentration wird der Äquivalenzbereich erreicht, es bilden sich unlösliche, große präzipitierende Immunkomplexe. Bei allen Techniken der Immunpräzipitation, z.B. radiale Immundiffusion oder Immunfixations-Elektrophorese, sind die Antigen-Antikörper-Systeme so eingestellt, dass im Äquivalenzbereich gearbeitet wird.

Beim Antigenüberschuss liegen vorwiegend lösliche Immunkomplexe vor. Die Konzentration der Immunkomplexe nimmt mit steigender Konzentration des Antigens zu, das Messsignal (Streulicht, Absorption) oder die Präzipitatmenge nimmt ab und täuscht eine zu niedrige Antigenkonzentration vor. Es besteht ein Postzonen-Effekt.

Zum Erhalt eines Signals, das der Antigenmenge proportionalen ist, muss das Untersuchungsgut so verdünnt werden, dass die Antigenkonzentration im Bereich des Antikörperüberschusses liegt. Das entspricht dem aufsteigenden Schenkel der Kurve nach Heidelberger und Kendall (Abb. 52.1-5 – Präzipitationskurve nach Heidelberger und Kendall).

Verfahren mit direktem Antigen- oder Antikörpernachweis sind Präzipitationstechniken, z.B. radiale Immundiffusion, Immunelektrophorese und in flüssiger Phase messende Techniken wie die Immunnephelometrie und die Immunturbidimetrie.

52.1.4.2 Indirekter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern

Dem hoch empfindlichen Nachweis eines spezifischen Antikörpers oder des Antigens eines präzipitierenden Antigen-Antikörper-Systems sind Grenzen der Nachweisempfindlichkeit durch die Sichtbarmachung des Immunpräzipitats gesetzt. Werden jedoch die Antigene oder Antikörper an Träger gekoppelt und dadurch eine Multivalenz erzeugt, wird die Antigen-Antikörper-Reaktion als Agglutination erkennbar (Abb. 52.1-6 – Antikörper-haltiges Serum agglutiniert Antigen-tragende Latexpartikel).

Verfahren mit Trägern für Antigene oder Antikörper sind die Latex verstärkte Agglutination, indirekte (passive) Hämagglutination, der Hämagglutinations-Hemmtest und die Komplement-Bindungsreaktion.

Nachweis von Antigen oder Antikörper durch Markierung eines Reaktionspartners

Diese Verfahren werden zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in niedriger Konzentration angewendet. Antigen oder Antikörper sind markiert mit:

• Einem Fluorophor (Immunfluoreszenz-Technik).
• Radioaktivität (Radioimmunoassay).
• Einem Enzym (Enzymimmunoassay).
• Einem lumineszierenden Stoff (Lumineszenzimmunoassay).

52.1.5 Direkte Antigen- oder Antikörper-Bestimmung

Zu den Verfahren der direkten Bestimmung zählen die Agglutination korpuskulärer Antigene durch Antikörper /6/ und die Immunpräzipitation.

52.1.5.1 Direkte Agglutination

Der Hämagglutinations-Test zur Blutgruppenbestimmung und der Bakterien-Agglutinations Test (Widal-Reaktion) sind direkte Agglutinationstechniken.

Blutgruppenbestimmung

Prinzip: Siehe Beitrag 27.5.2.4.3 – Diagnostische Tests.

Bakterienagglutination

Nachweis von Antikörpern (Widal-Reaktion).

Prinzip: Abgetötete oder inaktivierte Aufschwemmungen von Bakterien werden als Antigen eingesetzt und mit einer Verdünnungsreihe des Patientenserums inkubiert. Agglutination weist auf die Präsenz des korrespondierenden Antikörpers im Patientenserum.

Nachweis von Antigenen (Gruber-Reaktion).

Prinzip: Zur Klassifizierung und Typisierung von Bakterien werden Reinkulturen mit entsprechenden Klassen- und Typen-spezifischen Antiseren inkubiert.

52.1.5.2 Immunpräzipitation

Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, dass bei vorgegebener Antikörpermenge das Antigen durch Diffusion im Gel oder der Folie soweit verdünnt wird, bis eine Antigen-Antikörper-Äquivalenz vorliegt, bei der die Präzipitatbildung erfolgt.

52.1.5.2.1 Radiale Immundiffusion

Prinzip: Die Durchführung erfolgt auf Platten. Sie sind mit einem Gel beschichtet, das korrespondierende Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen enthält. Die Probe wird in kreisrunde Auftragepositionen gegeben. Die Diffusion der Probenantigene erfolgt radial in das Gel /7, 8/.

Bei der Auswertung nach Mancini lässt man die Diffusion bis zur vollständigen Präzipitation des Antigens ablaufen. Nach der Heidelberger-Kurve entstehen in der näheren Umgebung der Auftragestelle zunächst kleine, lösliche Immunkomplexe, die mit zunehmendem Diffusionsradius zu größeren unlöslichen Komplexen umgeformt werden. Am schärfsten Präzipitatradius ist der Äquivalenzpunkt erreicht und die Diffusion des Antigens durch vollständige Präzipitation beendet. Die Antigenkonzentration ist proportional dem Quadrat des Durchmessers des Präzipitatrings.

Bei der Auswertung nach Fahey wird die von der Konzentration abhängige Diffusionsgeschwindigkeit des Antigens zur Auswertung herangezogen, die Reaktionszeit ist deshalb gegenüber der Mancini-Technik verkürzt. Die Antigenkonzentration ist proportional dem Durchmesser des Präzipitatrings.

Der Antigengehalt wird bei beiden Verfahren über eine Eichgerade aus mitgeführten Standardverdünnungen ermittelt oder direkt über Faktoren bei standardisierten Platten.

52.1.5.2.2 Immunelektrophorese

Prinzip: Zwei Verfahren sind kombiniert, die Serumprotein-Elektrophorese und die Immunpräzipitation /9, 10/. Als Träger werden Agarosegel oder die Zelluloseazetatfolie eingesetzt, als Trennmedium gängige Elektrophorese-Puffer des pH von etwa 8,5. Im ersten Schritt erfolgt die Trennung der Patientenprobe und eines Referenzserums parallel zueinander in Richtung Anode. Nachfolgend wird zwischen beide Trennungen in Trennrichtung ein Antiserumtrog geschnitten bzw. geformt und mit Antiserum gefüllt. Der Träger wird 16–24 h in einer feuchten Kammer stehen gelassen. In dieser Zeit diffundieren die Antikörper senkrecht zur Trennrichtung, die aufgetrennten Proteine in Richtung Antiserumrinne. Dort, wo sich Antigene und korrespondierende Antikörper treffen, bilden sich im Äquivalenzbereich scharfe Präzipitationslinien. Bei Verwendung von Antihumanserum sind über 30 Serumproteine darstellbar. Auf Grund der Position, Form und Stärke der Präzipitationslinien können die einzelnen Proteine identifiziert und ihre Konzentration grob beurteilt werden.

Indikation zur Immunelektrophorese ist der Verdacht auf die Bildung monoklonaler Ig oder Ig-Bruchstücke. Sie gehören einer Ig-Klasse und/oder einem Ig-Typ an und liegen im Überschuss vor. Polyklonal gebildete Ig sind nach der elektrophoretischen Auftrennung homogen in der γ-Globulinfraktion verteilt. Das in der Diffusionsphase sich ausbildende Immunpräzipitat ist gleichförmig gekrümmt. Monoklonale Antikörper oder Antikörperbruchstücke bilden in der γ-Globulinfraktion eine lokale Verstärkung (M-Gradient). In der Diffusionsphase verschiebt sich der Äquivalenzbereich in Richtung Antiserumrinne, das entstehende Immunpräzipitat zeigt dementsprechend eine Ausbauchung. Dies ist ein Zeichen der Präsenz monoklonaler Antikörper.

52.1.5.2.3 Immunfixations-Elektrophorese

Prinzip: Das Probenmaterial (Serum, Harn) eines Patienten wird auf einer Agarosegelplatte als Träger bei einem pH von etwa 8,5 in Richtung Anode in mehreren parallelen Schritten elektrophoretisch aufgetrennt /11/.

Die Identifizierung von Ig vermittels Präzipitatbildung erfolgt durch Auflegen von mit Antiseren getränkten Zelluloseazetatstreifen auf die Trennspuren. Pro Probe werden gewöhnlich fünf Antisera verwendet, und zwar Anti-Ig/γ-Kette, Anti-Ig/α-Kette, Anti-Ig/μ-Kette, Anti-Ig/L-Kappa, Anti-Ig/L-Lambda.

Nach Präzipitatbildung (innerhalb 1 h) werden nicht als Immunkomplexe präzipitierte Proteine ausgewaschen und die Immunpräzipitate mit einem Proteinfarbstoff angefärbt.

Bewertungskriterien sind folgende Muster:

• Homogene Bande(n) im diffusen Immunpräzipitat: Sie sprechen für das Vorliegen einer monoklonalen oder oligoklonalen Gammopathie.
• Diffuse Immunpräzipitate: Sie weisen auf die Präsenz einer polyklonalen Gammopathie hin.

52.1.5.2.4 Elektroimmundiffusion

Prinzip: Es handelt sich um eine eindimensionale elektrophoretische Trennung von Proteinen in einem Antiserum haltigen Agarosegel. Das nachzuweisende Protein der Probe wird durch die korrespondierenden Antikörper im Gel im Äquivalenzbereich in Form einer Rakete präzipitiert (Raketen-Elektrophorese). Die Länge der Rakete ist proportional der Konzentration des Antigens /12/.

52.1.5.2.5 Zweidimensionale Immunelektrophorese

Prinzip: Die Proteine der Probe werden in einem ersten Elektrophoreseschritt im Agarosegel aufgetrennt. Mit einer zweiten, im rechten Winkel zur ersten Trennung durchgeführten Elektrophorese werden die aufgetrennten Proteine in ein Antiserum haltiges Gel elektrophoretisiert, das korrespondierende Antikörper zu mehreren Proteinen enthält. Im Äquivalenzbereich kommt es zur Immunpräzipitation unter Ausbildung von Gipfeln, deren Lage von der Mobilität des Proteins in der ersten Dimension und deren Fläche von der Konzentration bestimmt wird /13/.

52.1.5.3 Antigen- oder Antikörperbestimmung als lösliche Immunkomplexe

In Lösung befindliche Antigen-Antikörper-Komplexe absorbieren und streuen Licht. Im Testansatz vorgegeben ist eine definierte Menge spezifischer Antikörper. Quantitativ gemessen wird die Antigenkonzentration in flüssiger Phase bei Antikörper Überschuss, also im aufsteigenden Teil der Kurve nach Heidelberger und Kendall /14/. Die Nachweisempfindlichkeit dieser Tests, die bei 10 mg/l liegt, kann um den Faktor 100 erhöht werden, wenn die spezifischen Antikörper an Latex-Partikel gebunden sind (Latex-verstärkte Assays).

52.1.5.3.1 Immunnephelometrie

Prinzip: Werden eine Antigen haltige Probe und spezifisches Antiserum in eine Messküvette gegeben, bilden sich Antigen-Antikörper-Komplexe. Durch die Küvette geschickte Strahlen, z.B. eines Helium-Neon-Lasers, werden an den Immunkomplexen gestreut und das Streulicht über ein Linsensystem auf einen Photodetektor fokussiert. Das elektrische Signal des Photodetektors ist proportional der Streulichtintensität. Über das Streulichtsignal kann anhand einer Kalibrationskurve die Konzentration des Antigens ermittelt werden. Bei der kinetisch-nephelometrischen Antigenbestimmung wird in kurzen Abständen die Streulichtänderung gemessen, bei der Endpunktmethode lässt man eine definierte Zeit, z.B. 15 oder 30 Minuten reagieren. Durch erneute Antigen- oder Antikörperzugabe kann geprüft werden, ob im Anstieg der Heidelberger-Kurve gemessen wurde. Dies ist der Fall, wenn bei Antigenzugabe eine Zunahme des Messsignals erfolgt und bei Antikörperzugabe das Messsignal gleich bleibt.

52.1.5.3.2 Immunturbidimetrie

Prinzip: Setzt man in einer Messküvette einer Antigen-haltigen Probe spezifisches Antiserum im Überschuss zu, so entstehen lösliche Immunkomplexe. Diese führen zu einer Trübungsänderung des Ansatzes, die spektrophotometrisch bei 334 oder 340 nm gemessen werden kann. Die Zunahme der Absorption in einer festgesetzten Zeit ist ein Maß für die Konzentration des Antigens in der Probe (Endpunktbestimmung). Durch den Zusatz eines Akzelerators zum Ansatz wird die Antigen-Antikörper-Reaktion beschleunigt, so dass auch eine kinetische Bestimmung nach dem Fixed-time Prinzip möglich ist.

52.1.6 Indirekte Antigen- oder Antikörper-Bestimmung

Diese Verfahren werden eingesetzt, wenn:

• Die Antigen-Antikörper-Reaktion die Bildung großer Immunkomplexe nicht ermöglicht und somit eine sichtbare Agglutination im Testansatz nicht erreicht werden kann.
• Eine höhere Nachweisempfindlichkeit erforderlich ist als bei den zuvor genannten Tests.

52.1.6.1 Latex verstärkte Agglutination

Prinzip: Der Reaktionspartner, z.B. ein spezifischer Antikörper, der nachzuweisenden Substanz ist an Latexpartikel gebunden /15/.

Latex-Agglutinationstests gibt es als

• Objektträgertests zur qualitativen Bestimmung und
• turbidimetrische und nephelometrische Tests zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern.

52.1.6.2 Indirekte (passive) Hämagglutination

Prinzip: Der Reaktionspartner der nachzuweisenden Substanz ist an Erythrozyten adsorbiert /6/. Ist die gesuchte Substanz nicht vorhanden, findet keine Hämagglutination statt, die Erythrozyten sedimentieren punkt- oder ringförmig. Die diffuse Agglutination in Form einer Matte spricht für eine positive Reaktion. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Titrierung (Verdünnung in festen Verhältnissen mit Inkubationspuffer) der Serumprobe.

52.1.6.3 Agglutinations-Hemmtests

Direkter Hämagglutinations-Hemmtest

Prinzip: Gewisse Viren, insbesondere Rötelnviren, bilden Agglutinine, die Erythrozyten, z.B. vom Huhn, in vitro agglutinieren. Sind im Patientenserum Antikörper gegen Virusagglutinine vorhanden, wird die Agglutination unterbunden.

Indirekter (passiver) Hämagglutinations-Hemmtest

Prinzip: Stabilisierte Antigen beschichtete Erythrozyten und korrespondierende Antikörper werden als Testsystem eingesetzt. Enthält das zugesetzte Untersuchungsmaterial nicht das dem Antikörper entsprechende Antigen, erfolgt eine Agglutination der Erythrozyten (negativer Befund). Ist das Antigen im Untersuchungsmaterial vorhanden, besetzt es die Antikörper, die Hämagglutination bleibt aus (Ring- oder Knopfbildung = positiver Befund).

52.1.6.4 Komplement-Bindungsreaktion (KBR) 

Prinzip: Antigen-Antikörper-Komplexe binden und aktivieren Komplement /16/. Das Komplementsystem löst das Antigen des Antigen-Antikörper-Komplexes auf. Die KBR wird zum Nachweis von Antikörpern im Untersuchungsmaterial (Serum, Liquor cerebrospinalis) eingesetzt. Dem inaktivierten (Komplement-freien) Patientenserum wird das dem nachzuweisenden Antikörper entsprechende Antigen und eine definierte Menge Komplement zugesetzt. Sind im Patientenserum die gesuchten Antikörper vorhanden, bindet Komplement an diese und wird ganz oder teilweise verbraucht. Nachfolgend als Indikatorsystem zugegebene Immunkomplexe, bestehend aus Antikörper-beladenen Erythrozyten, werden nicht hämolysiert und sedimentieren (positive Reaktion). Die Komplement-vermittelte Hämolyse des Indikatorsystems läuft ab, wenn das Patientenserum die gesuchten Antikörper nicht enthält (negative Reaktion).

Falsch-positive Ergebnisse können bei der KBR durch antigene Substanzen bedingt sein. Es handelt sich um Zellkulturantigene bei der Virusanzüchtung, die das wahre Antigen kontaminieren und mit dem Antikörper im Patientenserum einen Immunkomplex bilden, der Komplement bindet. Auf Grund der positiven Reaktion eines Kontrollantigens (nicht-infiziertes Zellkulturmaterial) wird ein solches Ergebnis erkannt.

Problematischer sind falsch-positive Ergebnisse durch Immunkomplexbildung in vivo, z.B. durch präformierte Immunkomplexe, Rheumafaktoren und aggregiertes Immunglobulin. Die als anti-komplementäre Aktivität oder auch als Serumeigenhemmung bezeichnete Reaktion wird durch das positive Ergebnis der Serumkontrolle (Patientenserum ohne Antigenzusatz) erkannt.

52.1.7 Antikörperaviditäts-Messung

Bei Infektionen mit humoraler Immunantwort nimmt der Anteil der Antikörper mit hoher Avidität mit der Zeit nach Immunisierung zu. Dieser Effekt wird auch als Reifung der Immunantwort bezeichnet.

So kommt es in der Frühphase einer Infektion, wenn große Antigenmengen präsent sind, vornehmlich zur Stimulierung niedrig avider Antikörperrezeptor-tragender B-Zellen und zur Produktion einer niedrigaviden polyreaktiven Antikörperpopulation.

Mit fortschreitender Zeit fällt die Antigenkonzentration ab, was zur Selektion von hochaviden Antikörper-bildenden B-Zellklonen mit der zusätzlichen Bildung von hoch aviden Antikörpern führt. Der Selektionsprozess ist eng mit der Bildung von Gedächtnis B-Zellen verknüpft, so dass eine reaktivierte oder Zweitinfektion mit sofortiger Bildung hoch avider Antikörper einhergeht /17/.

Siehe Abb. 52.1-7 – Änderung der Antikörperaktivität im Verlauf einer Infektion.

Primärinfektionen haben einen niedrigen Anteil hoch avider und einen hohen Anteil niedrig avider Antikörper. So wird z.B. bei Rötelninfektion erst 200 Tage nach Primärinfektion ein etwa gleicher Anteil hoch- und niedrig avider Antikörper gemessen. Reaktivierte oder Zweitinfektionen können von Primärinfektionen auf Grund ihres Anteils hoch avider Antikörper (gewöhnlich > 50 %) abgegrenzt werden.

Prinzip der Bestimmung des Aviditäts-Index: Die Stabilität der Antigen-Antikörperbindung im Enzymimmunoassay oder dem indirekten Immunfluoreszenz-Test wird gemessen. Angewendet wird vorwiegend das Elutionsprinzip. Den niedrig aviden und hoch aviden Antikörpern der Probe wird ermöglicht, an ein Festphase-gebundenes Antigen zu binden. Im nachfolgenden Waschschritt, mit z.B. 6 mol/l Harnstoff, bleiben nur die hoch aviden Antikörper gebunden. Analytisch werden zwei Ansätze mit der gleichen Probe durchgeführt. Ein Ansatz wird mit normalem Puffer gewaschen, hoch- und niedrig avide Antikörper bleiben Festphase-gebunden und werden bestimmt. Der zweite Ansatz wird mit Harnstoff gewaschen, nur die hoch aviden Antikörper bleiben Festphase-gebunden und werden bestimmt. Der prozentuale Anteil der hoch aviden an den insgesamt gebundenen Antikörpern wird berechnet und als Aviditätsindex angegeben. Abhängig von der Infektion spricht ein Aviditätsindex > 30 % (50–70 %) für eine reaktivierte oder Zweitinfektion.

52.1.8 Immunfluoreszenz-Tests

Die Immunfluoreszenz-Tests sind eine Kombination von histologischer und immunologischer Technik. Zielsetzung ist der Nachweis von Antigenen in Geweben, isolierten Zellen, Mikroorganismen oder von Antikörpern im Serum gegen Antigene von Geweben oder Zellen. Unterschieden werden /18, 19/:

• Direkter Immunfluoreszenz-Test (IFT); das zu untersuchende Antigen liegt auf einem Objektträger Struktur gebunden in Gewebe oder Zellen vor und wird mit Hilfe des spezifischen Antikörpers, der mit einem Fluorochrom markiert ist, dargestellt.
• Indirekter Immunfluoreszenz-Test (IIFT); nachgewiesen werden Antikörper einer Probe, indem diese mit dem spezifischen, Objektträger-fixierten Antigen einen Immunkomplex bilden. Der Immunkomplex wird nachfolgend mit Fluorochrom-markiertem Antihumanserum dargestellt.
• Die mikroskopische Darstellung der Immunkomplexe erfolgt durch eine Anregungsstrahlung definierter Wellenlänge, die eine Emission längerwelligen gut sichtbaren Lichts bewirkt.

Direkter Immunfluoreszenz-Test (IFT)

Prinzip: Zum Nachweis von Antigen von Geweben und zellständiger Antigene werden Gewebsschnitte oder Zellausstriche mit spezifischen Fluorochrom markierten Antikörpern überschichtet. Als Fluorochrome finden Fluoreszeinisothiocyanat oder Rhodamin Anwendung. Überschüssiges Antikörperkonjugat wird abgewaschen und die Fluoreszenz der Zell- oder Gewebestruktur beurteilt.

Indirekter Immunfluoreszenz-Test (IIFT)

Prinzip: Das Probenmaterial, meist Serum, wird mit einem Festphasen-fixierten Antigen, häufig Gewebsschnitte oder Zellausstriche, inkubiert. Enthält die Probe Gewebe spezifische Antikörper, so werden diese an das fixierte Antigen gebunden. Der Nachweis der Antikörperbindung erfolgt mittels eines Sekundärantikörpers der Fluorochrom markiert ist. Die Auswertung geschieht mit einem Fluoreszenzmikroskop. Werden spezifische Antikörper der Probe gebunden, ergeben sich typische Strukturmuster. Als Titer gilt die höchste Serumverdünnung mit deutlicher Fluoreszenz.

52.1.9 Immunoassays

Immunoassays sind Liganden-Bindungsassays. Diese Verfahren wenden spezifische Bindeproteine an um den Analyten (Liganden) zu binden /20/. Das Bindeprotein kann ein Rezeptor, ein Protein wie das Vitamin B₁₂-bindende Protein oder ein Antikörper sein. Handelt es sich um einen Antikörper, spricht man von einem Immunoassay.

Immunoassays sind überwiegend quantitative Methoden, die z.B. im Röhrchen oder in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte ablaufen. Generell ist ein Reaktionspartner des Reagenzes im Test mit dem zu bestimmenden Analyten gleich ist (Antigen oder Antikörper) mit einer Markierung (Label) versehen und konkurriert mit der Analyten um einen Bindungsplatz.Auf diese Weise kann nach Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion die in Bindung der vorliegende Menge des markierten Reaktionspartners gemessen werden und die Wirkung des Analyten bestimmt werden. Ist die Konzentration des Analyten hoch bindet wenig, ist sie niedrig bindet viel markierter Reaktionspartner. Abhängig von der Art der Markierung des Reaktionspartners werden die Tests in Radio-, Enzym-, Fluoreszenz- und Lumineszenz-Immunoassay eingeteilt /20, 21/.

Unterschieden werden folgende Testprinzipien:

• Kompetitive und nicht-kompetitive Assays.
• Assays, bei denen entweder das Antigen oder der Antikörper markiert ist. Ersteres ist gewöhnlich der Fall bei den kompetitiven Immunoassays, letzteres bei den immunometrischen Assays.
• Homogene und heterogene Immunoassays. Bei ersteren erfolgt keine Trennung des in Antikörperbindung befindlichen Antigens vom freien Antigen. Beim heterogenen Assay wird nach Inkubation das ungebundene (freie) Antigen von im Antikörperbindung befindlichen Antigen durch einen Separationsschritt getrennt bevor die Messung erfolgt.

52.1.9.1 Prinzipien kompetitiver und nicht kompetitiver Immunoassays

Kompetitives Verfahren

Beim klassischen heterogenen Immunoassay ist die limitiete Menge des zur Verfügung stehenden Antikörpers unzureichend alle Menge an Antigen (Analyt) der Probe zu binden /20, 21/. Der markierte Antigen (Tracer) und der Analyt kompetieren um eine begrenzte Anzahl von Antikörpern. Da der Antikörper die die gleiche Aviditär für den Tracer und den Analyten hat, verhält sich die Bindung des Antikörpers an den Tracer umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten. Dann werden freier und Antikörper-gebundener Tracer abgetrennt und die Menge des Antikörper-gebundenen Tracers bestimmt. Der Anteil des Tracers in Antikörper gebundener Form ist invers bezogen auf die Menge des ungebundenen Tracers. Ist der Tracer mit Radioaktivität markiert (Radioimmunoassay) so wird eine Dosis-Response Kurve generiert durch Bildung des Verhältnisses der Radioaktivität die in Abwesenheit des Analyten (B₀) und in dessen Anwesenheit (B) vorliegt /22/. Je höher die Konzentration des Analyten, desto niedriger ist die Ratio B/ B₀. Siehe Abb. 52.1-8 – Simultaner, kompetitiver Immunoassay.

Nicht-kompetitives Verfahren

Ein Beispiel für nicht-kompetitive Verfahren ist der zweiseitige (sandwich) immunometrische Assay /20, 21/. Allem Antigen der Probe wird ermöglicht an Festphase gebundene Antikörper zu binden. Im nächsten Schritt wird ein Überschuss an markiertem Antikörper zum Ansatz gegeben, der an eine Stelle des Festphase gebunden Antigens bindet und dieses markiert. Nicht gebundener markierter Antikörper wird verworfen und der Anteil der an die feste Phase gebundenen markierten Antikörper bestimmt. Dieser entspricht der Konzentration des Analyten der Probe.

52.1.9.2 Homogener Immunoassay

Beim homogenen Immunoassay wird das Ausmaß der Antigen-Antikörper-Reaktion ohne physikalische Trennung der freien von der Antikörper-gebundenen Form bestimmt. Der Ausdruck homogner Assay wird für Immunoassays angewendet, bei denen ein Partner (Antigen ode Antikörper) markiert ist, z.B. mit einem Enzym oder mit Fluoreszenz. Die Assays sind so konzipiert, dass freies Antigen oder Antikörper-gebundenes Antigen gemessen werden, wenn die Reagenzien schrittweise hinzugegeben werden.

Es gibt unterschiedliche Verfahren /20/:

• Immunoassays, die darauf beruhen, dass der Analyt identisch ist mit einem Antigen das, z.B. mit einem Enzym markiert ist. Eine Änderung der Enzymaktivität des Antigen-Enzymkomplexes tritt auf, wenn ein Antikörper an den Antigen-Enzymkomplex bindet. Der zu bestimmende Analyt der Probe konkurriert mit dem Antigen-Enzymkomplex um die Bindung an hinzugefügte Antikörper. Gewöhnlich hat die nicht an Antikörper gebundene Form des Antigen-Enzymkomplexes eine höhere Enzymaktivität als die Antikörper gebundene Form. Jede Änderung der Konzentration des Analyten hat eine Auswirkung auf die Aktivität des Antigen-Enzymkomplexes. Nach der Zugabe von Substrat ist dessen Umsatz proportional der Konzentration des Analyts.
• Immunoassays, die darauf beruhen, dass der Analyt identisch ist mit einem markierten Antigen das, z.B. mit einem Modulator oder der prosthetischen Gruppe eines Enzyms markiert ist. Analyt und markiertes Antigen konkurrieren um im Reagenz befindliche Antikörper. Bei der Bindung der Antikörper wird der Modulator oder die prosthetische Gruppe gehemmt und das Enzym verliert an Aktivität. Durch Zugabe des Analyten der Patientenprobe werden Antikörper gebunden und die hemmende Wirkung auf das Enzym nimmt ab. Die gemessene Enzymaktivität verhält sich proportional zur Menge des Analyten in der Patientenprobe.
• Immunoassays, die auf dem Prinzip des reactant labeled antigen beruhen. Im Assay enthalten sind ein Enzym, ein Antigen gebundenes Substrat des Enzyms und Antikörper. Im Assay konkurrieren der Analyt der Probe und Antigen gebundenes Substrat um Antikörper. Das Enzym kann sein Substrat umsetzen, wenn es in freier Form, also nicht an Antikörper gebunden vorliegt. Ist das der Fall, läuft die enzymatische Reaktion rasch ab. Ist die Analytkonzentration in der Probe hoch, liegt viel freies Substrat vor und die gemessene Enzymaktivität verhält sich proportional zur Konzentration des Analyten in der Patientenprobe.
• Die Bestimmung von Steroiden erfolgt direkt ohne Extraktionsverfahren auf bestimmten Analyzerplattformen. Zur Kalibration der Assays werden sekundäre Kalibratoren verwendet. In einer Studie /47/ wurde die festgelegte Konzentration der Kalibratoren von Testosteron, Östradiol und Progesteron von vier Testherstellern mittels der Tandem-Massenspektrometrie überprüft. Bei den Nicht-Null-Kalibratoren stimmten bei Testosteron 43 % der Werte nicht mit der Tandem-Massenspektrometrie überein und 29 % lagen sogar außerhalb der 20 % Grenze. Für Progesteron und Östradiol waren die Ergebnisse ähnlich den von Testosteron. Die Autoren vermuten, dass die fehlerhaften Ergebnisse ein Problem der Immunoassays sind.

52.1.9.3 Heterogener Immunoassay

Beim heterogenen Immunoassay ist einer der Partner der Immunreaktion an eine feste Phase (Röhrchenwand) gebunden. Unterschieden werden kompetitive Assays von nicht-kompetitiven Assays.

Kompetitive Assays

Die Antikörper liegen nur in begrenzter Menge an eine feste Phase gebunden vor. Der Analyt (ein Antigen) und ein in konstanter Menge zugegebenes Enzym-markiertes Antigen konkurrieren um die spezifischen Antikörper. Je höher die Konzentration des Analyten, desto weniger Enzym-markiertes Antigen wird gebunden und die Intensität der Farbreaktion nach Substratzugabe ist umgekehrt proportional der Analytkonzentration der Probe. Im englischen Sprachgebrauch werden diese Assays auch als Reagent-limited assays bezeichnet.

Nicht-kompetitive Assays

Fängerantikörper liegen im Überschuss an eine feste Phase gebunden vor. Jeder Analyt der Probe bindet an diese Antikörper unter Ausbildung eines Festphase-gebundenen Immunkomplexes. Durch Zugabe eines markierten Zweitantikörpers werden die Immunkomplexe unter Bildung eines Sandwichs markiert. Dieser Assay-Typ wird im englischen Sprachgebrauch auch, je nach Verfahren, als Reagent-excess assay, Two-site immunoassay oder Two-site (sandwich) immunoassay bezeichnet.

Abhängig von der Zahl der Inkubationsschritte werden unterschieden:

• Zweischritt-Verfahren: Nach der Bindung des Analyten an den Fängerantikörper erfolgt ein Trenn- und Waschschritt zur Entfernung ungebundener Probenbestandteile. Danach wird in einem weiteren Inkubationsschritt markierter Zweitantikörper (Signalantikörper) hinzugegeben. Er bindet an ein weiteres Epitop des an den Fängerantikörper gebundenen Analyten unter Ausbildung eines Sandwichs, der das Antigen von beiden Seiten umschließt. Das gemessene Signal des gebundenen Signalantikörpers ist proportional der Konzentration des Analyten.
• Einschritt-Verfahren: Die Reagenzien werden schritt- weise dem Bestimmungsansatz zugegeben und nur ein Inkubationsschritt durchgeführt. Fängerantikörper und Signalantikörper binden an verschiedene Epitope des Analyten.

52.1.9.4 Gängige Typen des heterogenen Immunoassays

Enzyme-linked Immunoassay

Enzymimmunoassays mit einem Enzym als Marker sind vorwiegend Zweischritt-Assays (Abb. 52.1-9 –Prinzip des ELISA).

In einigen Fällen verliert der Fänger (capture)-Antikörper seine Bindungskapazität durch sterische Behinderung nach Bindung an eine feste Phase. Um das zu verhindern wird die feste Phase mit einem Spezies-spezifischen Antikörper überzogen, der den Fängerantikörper immobilisiert aber seine Funktion nicht behindert.

Antibody capture assay

Diese Form des Immunoassays wir vorwiegend zur Bestimmung von Antikörpern angewendet, z.B. von Virusantikörpern. Siehe Abb. 52.1-10 –Antibody capture assay.

μ-capture Assay

Bei diesem Immunoassay werden Spezies spezifische IgG-Antikörper, die gegen das Fc-Fragment des IgM-Moleküls gerichtet sind, als Fängerantikörper an eine feste Phase gebunden (Abb. 52.1-11 – μ-capture assay).

Enzym-markierter (labeled) Antigenassay (ELA)

Gleiches Testprinzip wie der μ-capture Assay, mit der Ausnahme, dass Enzym-markiertes Antigen zur Markierung des gebundenen Analyten eingesetzt wird (Abb. 52.1-12 –Enzymel abeled antigen assay (ELA).

52.1.9.5 Trennschritte bei Immunoassays

Heterogene Verfahren erfordern die Trennung des freien vom Antikörper-gebundenen Liganden (Tab. 52.1-1 – Trenntechniken).

Streptavidin-Biotin-Technologie

Die direkte Bindung von Antigen oder Antikörper an eine Festphase kann zum Verlust von Sensitivität und Spezifität eines Immunoassays führen. Die Streptavidin-Biotin-Technologie ist ein System zur indirekten Fixierung von Antigen oder Antikörper auf die Festphase.

Als Festphase dient das Streptavidin-beschichtete Röhrchen. Streptavidin hat Fängerfunktion und bindet den biotinylierten Antikörper bzw. das biotinylierte Antigen. Streptavidin ist ein tetrameres Protein mit dem MG von 60 kDa, das vier biotinylierte Antigene oder Antikörper binden kann.

Siehe Abb. 52.1-13 – Streptavidin-Biotin Signalsystem.

52.1.9.6 Markierung von Immunoassays

Die Markierung des Liganden, auch als Label oder Tracer bezeichnet, erfolgt durch Radioaktivität, Enzyme, Fluorophore und lumineszierende Substanzen /23, 24/.

Radioaktiver Label

Es wird vorwiegend ¹²⁵J verwendet, ein γ-Strahler mit einer Halbwertszeit von 60 Tagen. Die spezifische Radioaktivität des ¹²⁵J-markierten Liganden soll so bemessen sein, dass mehrere Tausend Counts per minute (cpm) pro Ansatz gezählt werden. 1 Curie sind 3,7 × 10¹⁰ Becquerel (Bq) und entspricht 3,7 × 10¹⁰ Zerfällen pro Sekunde.

Enzymatischer Label

Immunoassays mit Enzym-markiertem Label werden als Enzymimmunoassays (EIA) bezeichnet. Markiert ist das Antigen oder der Antikörper. EIA, bei denen die Trenntechnik eine feste Phase ist, werden als Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) bezeichnet. Enzyme, die häufig zur Markierung verwendet werden, sind die alkalische Phosphatase, die Meerrettichperoxidase und die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Nach Zugabe des spezifischen Substrats wird dieses vom jeweiligen Enzym in ein Produkt umgewandelt, dessen Bildung kinetisch oder durch Endpunktmessung ermittelt wird.

Fluoreszenz-Label

Immunoassays mit einem Fluorophor-markierten Label werden als Fluoreszenzimmunoassay (FIA) bezeichnet. Fluorophore sind Moleküle, die Energie absorbieren und in einem Zeitraum von etwa 10^–8 sec als Photon wieder abgeben. Erfolgt die Energiezufuhr in Form von Strahlung, wird diese mit einer Wellenlängenverschiebung von etwa 30–50 nm wieder abgegeben. Ein häufig verwendeter Fluoreszenzfarbstoff ist 4-Methylumbelliferonphosphat, das durch die alkalische Phosphatase zu dem Fluorophor 4-Methylumbelliferon dephosphoryliert wird.

Lumineszenz-Label

Das Antigen oder der Antikörper ist markiert mit einer lumineszierenden Substanz. Es handelt sich um Moleküle, die nach Energiezufuhr Strahlung aussenden.

Folgende Lumineszenzen werden unterschieden:

• Chemilumineszenz: Sie wird erzeugt von Substanzen, die durch chemische Oxidation Licht abgeben, z.B. Luminol, Acridiniumester, Oxalate. Für den Start der Chemilumineszenz-Reaktion sind Katalysatoren notwendig, z.B. Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid (Abb. 52.1-14 – Signalsystem: Lichtbildung durch eine luminogene Substanz).
• Biolumineszenz: Licht wird durch ein lumineszentes System erzeugt, dem eine Energie liefernde enzymatische Reaktion vorgeschaltet ist. Zur Lumineszenz wird das Luziferin-Luziferase-System eingesetzt (Abb. 52.1-14). Luziferin wird durch Katalyse der Luziferase zu einem angeregten Komplex oxidiert, der unter Lichtemission zerfällt. Als Energie-liefernde Reaktion sind z.B. vorgeschaltet die ATP-liefernde Pyruvatkinase-Reaktion, wenn das Luziferin-Luziferase-System aus Glühwürmchen eingesetzt wird oder oxidative Reaktionen, wenn das NAD(P)H-abhängige Luziferin-Luziferase-System aus Pilzen, Algen oder Bakterien zur Anwendung kommt.

Mit dem Lumineszenz-Immunoassay können Substanzen niedrigen und hohen Molekulargewichts mit einer dem Radioimmunoassay vergleichbaren analytischen Sensitivität bestimmt werden.

52.1.9.7 Nachweisempfindlichkeit von Immunoassays

Die Detektion einer markierten Substanz ist abhängig von:

• Der Anzahl der Signale, die pro Zeiteinheit von einer definierten Menge markierter Moleküle generiert werden (spezifische Aktivität).
• Dem Verhältnis gemessener Signale zu generierten Signalen (Zähl- oder Messausbeute).
• Der Intensität des Hintergrundsignals, vor dem das spezifische Signal gemessen wird (Signal-Rauschen-Verhältnis).

Luminophore und Fluorophore können auf Grund ihrer höheren spezifischen Aktivität empfindlicher als der radioaktive Marker ¹²⁵J nachgewiesen werden. Ein Vergleich der Nachweisempfindlichkeiten immunchemischer Verfahren ist nur möglich, wenn wichtige Faktoren der Assays, z.B. Eigenschaften des Antikörpers oder die Trennverfahren konstant gehalten werden.

Siehe auch Tab. 52.1-2 – Nachweisgrenze des Analyten für das jeweilige immunchemische Messverfahren.

52.1.9.8 Interferenzen bei Immunoassays

Interferenzen sind Abweichungen des gemessenen vom wahren Wert in einem Analysenverfahren und werden durch die Wirkung einer Substanz hervorgerufen. Die International Federation of Clinical Chemistry hat die Interferenz wie folgt definiert: Analytical interference is the systematic error of measurement caused by a sample component, which does not, by itself, produce a signal in the measuring system /25/.

Die Interferenz kann Analyt abhängig oder unabhängig vom Analyten sein, sie kann das Messergebnis erhöhen (positive Interferenz) oder erniedrigen (negative Interferenz) /26/. Bei Immunoassays beruht die positive Interferenz auf einem Mangel an Spezifität. Die Häufigkeit von Interferenzen bei Immunoassays wird mit 4 % angegeben und eine Reduzierung auf 0,1 %, bei Reduzierung des Fc-Fragments vom Capture-Antikörper /27/.

Zirkulierende humane Antikörper mit einer Reaktivität auf tierisches Protein, insbesondere humane anti-Maus-Antikörper (HAMA) und heterophile Antikörper, sind die häufigsten Ursachen der Interferenzen von Immunoassays. Immunologische Verfahren, die am meisten gestört werden, sind die Two-site (sandwich) immunoassays.

Zur Prüfung der Störung auf heterophile Antikörper wurden in einer Studie /26/ die Seren von 10 Patienten mit Rheumafaktor-assoziierten Erkrankungen auf 74 Analyte mit Immunoassays untersucht. Von 3.445 Resultaten waren 8,5 % falsch-positiv. Davon waren 21 % geeignet, eine falsche Diagnose zu stellen und 39 % hätten zu falschen klinischen Handlungen geführt. In der Hälfte der Fälle wurden die falschen Ergebnisse durch die Zugabe von Blockingreagenz beseitigt.

Zur Untersuchung auf HAMA wurde in einer Studie /27/ CEA in 11.261 Proben mit Two-site (sandwich) immunoassays bestimmt. In 4 % der Proben wurde eine Interferenz festgestellt. Durch Zugabe von denaturiertem Immunglobulin der Maus oder durch Entfernung eines Teils des Fc-Fragments vom Fängerantikörper wurde die Häufigkeit der Interferenz auf 0,1 % gesenkt.

Trotz dieser scheinbar hohen Inzidenz von heterophilen Antikörpern und HAMA wird ein vorheriges Screening von Proben vor Durchführung eines Immunoassays nicht empfohlen. Es gibt bisher keine Methode, die zuverlässig die häufigsten Interferenzen bei allen Immunoassays erfasst /28/. Die bevorzugte Zielsetzung bei Feststellung eines auffälligen Ergebnisses muss die Rücksprache des Laborarztes mit dem behandelnden Arzt sein.

52.1.9.9 Erkennung einer Interferenz

Eine Interferenz kann auf verschiedenen Wegen erkannt und abgeklärt werden /27, 28/:

• Vergleich des aktuellen Resultats mit dem Vorwert.
• Gespräch mit dem Kliniker und Prüfung, ob das Resultat dem klinischen Zustand des Patienten entspricht.
• Vergleich des Resultats mit anderen klinischen Befunden oder Laborresultaten, die Organerkrankung oder klinische Symptomatik betreffend, z.B. ob eine inverse Beziehung zwischen einem abweichenden FT4-Wert und dem TSH besteht.
• Vergleich mit einem alternativen Verfahren.
• Untersuchung, ob die Stöchiometrie stimmt, durch Durchführung serieller Verdünnungen. Eine mangelnde Verdünnungslinearität weist auf eine Interferenz hin.
• Untersuchung der Probe auf anti-Maus-Antikörper.
• Vorbehandlung der Probe mit blockierenden Antikörpern zur Prüfung auf anti-Tier-Antikörper.

Interferenzen können bedingt sein durch:

• Präanalytische Bedingungen. Sie betreffen häufig eine nicht korrekte Probennahme oder eine nicht korrekte Probe. Serum ist das Untersuchungsgut der ersten Wahl. Oft ist auch Lithiumheparinat-Plasma anwendbar, aber viele Immunoassays sind nicht oder nur ungenügend für dieses Untersuchungsgut evaluiert.
• Matrixeffekte. Sie sind definiert als die Summe der Wirkungen aller qualitativen und quantitativen Komponenten im System, ausgenommen derjenigen des Analyten. Das betrifft Plasmaproteine, heterophile Antikörper, Rheumafaktoren und anti-Maus-Antikörper. Mangelnde Spezifität des Tests. Diese führt zur Kreuzreaktivität durch Substanzen, die eine ähnliche Struktur wie der Analyt haben.
• Störungen durch andere Plasmakomponenten. Sie verursachen eine unspezifische Interferenz des Immunoassays wie Digoxin-ähnliche Substanzen oder die hohe Konzentration freier Fettsäuren bei Bestimmung der freien Schilddrüsenhormone. Siehe Abb. 52.1-15 –Falsche positive IgM-Antikörperbestimmung durch den Rheumafaktor und Abb. 52.1-16 –Antikörperinterferenz bei kompetitiven Immunoassays.
• Kreuzreagierende Substanzen (Abb. 52.1-17 –Autoantikörperinterferenz bei zweiseitigen Immunoassays).
• Hook effect. Sehr hohe Antigenkonzentrationen führen zu falsch-niedrigen Resultaten.
• Mechanische Störungen. Kryoglobuline und monoklonale Immunglobuline stören viele Schritte eines Immunoassays, von der Probenpipettierung über den Inkubationsschritt bis zur Trennung des freien vom Antikörper-gebundenen markierten Antigens.
• Biotin, auch als Vitamin B7 oder Vitamin H bezeichnet, ein wasserlösliches Vitamin des Vitamin B-Komplexes wird täglich in unterschiedlichen Mengen 0,03–10 mg Tag aufgenommen. Biotin interferiert mit Streptavidin-Biotin Immunoassays, da hohe Dosen von Biotin um Bindungsstellen am Streptavidin konkurrieren. Bei Assays im Sandwichformat führt exogen zugeführtes Biotin zu falsch niedrigen Ergebnissen. Bei kompetitiven Assays ist die Konzentration des Analyten umgekehrt proportional zur Signalintensität. Es resultiert ein falsch erhöhtes Resultat /29/.

Siehe:

• Tab. 52.1-3 – Prinzip von Immunoassay-Verfahren
• Tab. 52.1-4 – Interferenzen bei Immunoassays.

52.1.10 Single molecule protein detection assay (SIMOA)

Simoa ist ein digitalisierter auf Perlchen basierter ELISA, aber die Diffusion der Markermoleküle (Fluoreszenz) beim Signalschritt ist auf 40 fl Näpfchen beschränkt. Durch die Restriktion der Fluoreszenz auf ein solch kleines Volumen wird jede einzelne Enzymmarkierung erkannt.

Der wesentliche Unterschied zwischen dem Simoa und einem konventionellen Immunoassay liegt in dem Vermögen des Simoa jedes einzelne Fluoreszenzmolekül in Femtoliter kleinen Näpfchen einzufangen und alle Vertiefungen digital zu erfassen /46/.

Der Simoa ist ein Zweischritt-Sandwich-Immunoassay /49/:

• Im ersten Schritt wird die Probe mit Nfl überzogenen paramagnetischen Fängerperlchen und biotinylierten Detektorantikörpern in einer Kuvette inkubiert. Die Fängerperlchen werden mittels eines Magneten gesammelt und gewaschen.
• Im zweiten Schritt werden die Fängerperlchen mit einem Konjugat aus Streptavidin-β-Galactosidase inkubiert. Nach einem weiteren Waschgang werden die Fängerperlchen in einer Lösung aus Resorufin β-D-Galactopyranosid-Substrat (RGP) resuspendiert. Es entsteht Fluoreszenz.
• Die Digitalisierung der Fluoreszenz erfolgt, wenn die Fängerperlchen auf eine Simoarray disc übertragen werden. Dazu werden die einzelnen Fängerperlchen in ihren Näpfchen versiegelt. Wurde Nfl aus der Probe gebunden hydrolysiert das RGP Substrat in ein Fluoreszenzprodukt, welches das Messignal ist.

Die Konzentration von Nfl (Neuro filament light chains) in einer unbekannten Probe wird vermittels einer Standardkurve erhalten.

52.1.11 Blotting-Techniken

Unter Blotting wird der Transfer elektrophoretisch getrennter Substanzen auf eine feste Matrix, z.B. eine Zelluloseazetatfolie, verstanden /30/.

Der Vorteil der Blotting-Technologie ist:

• Auf der festen Matrix wird eine identische Kopie des Musters der elektrophoretisch getrennten Substanzen reproduziert, aber in immobilisierter Form.
• Nach dem Transfer der Substanzen auf die feste Matrix können vielfältige Nachweisreaktionen zur Identifizierung der Substanzen durchgeführt werden, die im Trenngel nicht oder nur schwer möglich sind.

Nomenklatorisch und historisch werden drei Blotting-Verfahren unterschieden:

• Western blotting: Wird auch als Protein-Blotting bezeichnet. Ein elektrophoretisch aufgetrenntes Proteinmuster wird auf eine feste Phase transferiert.
• Southern blotting: Elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente werden auf eine feste Phase, meist Nitrozellulosemembran, durch Kapillarkräfte transferiert.
• Northern blotting: Ist eine Modifikation des Southern blotting. Kleine DNA-Fragmente, die nur ungenügend an Nitrozellulose binden, werden an Diazobenzyloxymethyl-haltiges Papier gebunden.

Die Blotting-Technologie wird zum Finger printing eingesetzt. Unter diesem Begriff versteht man die Zerlegung einer Substanz, z.B. DNA, in Bruchstücke und die anschließende zweidimensionale elektrophoretische und chromatographische Trennung zum Zweck der Identifizierung. Diagnostische Bedeutung hat besonders das DNA-Fingerprinting, und zwar zum Nachweis von Gendefekten (Erbkrankheiten), für Spuren kundliche Untersuchungen (Rechtsmedizin), in der pränatalen Diagnostik und zum Vaterschaftsnachweis.

Biotin Interferenz

Die Diagnostikahersteller verwenden unterschiedliche Bindungskomponenten für Reagenzantikörper in ihren Immunoassays. Einer davon ist die Interaktion von Biotin (auch als Vitamin B7 oder B8 bekannt) mit Streptavidin (siehe Abb. 52.1-13 – Streptavidin-Biotin System). Die physiologische Konzentration von Biotin im Plasma ist 0,4–1,2 μg/l, aber sehr hoch nach Einnahme von Biotin. Jedoch besteht bei den Immunoassays eine Konkurrenz zwischen dem Biotin im Plasma und den biotinylierten Fängerantikörpern des Immunoassays. Konsequenter Weise kommt es zu falsch negativen oder falsch positiven Resultaten in nicht-kompetitiven und kompetitiven Immunoassays /48/. Ein Prinzip das Problem die Biotin-Interferenz zu umgehen ist die Anwendung von Antikörpern gegen Biotin im Immunoasssay, die das im Plasma vorhandene Biotin neutralisieren. In einer Studie /48/ wurde gezeigt, dass einige Immunoassays eines Diagnostikaherstellers noch ungenügend neutralisierende Antikörper enthalten, die Biotin im Konzentrationsbereich von 1.200–3.500 μg/l neutralisieren. Es werden aber auch noch Immunoassays angeboten, bei denen Biotinkonzentrationen im Plasma bis zu 1.200 μg/l als Interferenz wirken.

52.1.11.1 Immunoblot

Ein wichtiges Verfahren in der Molekulargenetik ist die Blotting-Technik nach Southern, bei der elektrophoretisch getrennte DNA auf Nitrozellulosestreifen fixiert und verwendet wird komplementäre Sequenzen in einer zu untersuchenden Probe durch Hypridisierung zu untersuchen. Eine Adaption des Southern Blots ist die kovalente Anheftung von fraktionierter DNA an Diazobenzyloxymethyl behandeltes Papier zur Untersuchung der Probe auf komplementäre DNA-Sequenzen (Northern Blotting) /30/.

52.1.11.2 Western Blotting

Protein Blotting ist der Tranfer von elektrophoretisch auf einem Träger getrennter Proteine /31, 32/. Das Ziel des Transfers ist in der Regel die Bindung von Makromolekülen, in der Regel Antikörper, an die Träger fixierten Proteine zu binden. Da in der überwiegenden Zahl der Fälle der Ligand ein Antikörper ist, spricht man vom Immuno- oder vom Western-Blotting. Das Protein Blotting ist eine Immunreaktion deren Duchführung in mehreren Schritten abläuft (Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Transfer der Antigene, Antikörperdetektion auf Membranstreifen auf denen die Antigene fixiert sind) und wird oft angewendet zur Diagnostik von Antikörpern in Körperflüssigkeiten /31, 32/.

Das Protein Blotting besteht aus drei Reaktionsschritten:

• Elektrophoretische Trennung eines Proteingemisches in Einzelproteinfraktionen. Trenntechniken sind vorwiegend die hochauflösende ein- oder zweidimensionale Flachgel-Elektrophorese oder die Isoelektrofokussierung. Trägermedien sind Agarose oder Polyacrylamid. Die Puffer können SDS (Sodium dodecyl sulfate) oder Harnstoff enthalten.
• Transfer der aufgetrennten Proteine auf einen sekundären Träger vermittels einer Blotting-Apparatur. Der sekundäre Träger muss die Proteine immobilisieren, so dass keine Diffusion erfolgen kann. Als sekundäre Träger werden Nitrozellulosestreifen oder mit Diazobenzyloxymethyl vorbehandeltes Papier verwendet. Letzteres bindet die Proteine kovalent. Der Transfer der Proteine vom primären (elektrophoretischen) Träger auf den sekundären Träger, auch als Blotting bezeichnet, kann erfolgen durch einfache oder unterstützende Diffusion (Vakuum, Überdruck), durch Kapillardruck oder elektrophoretisch (Elektroblotting). Das Elektroblotting ist das effizienteste und am weitesten verbreitete Verfahren. Nach Transfer der Proteine werden durch Blockierungssubstanzen unspezifische Bindungsstellen des sekundären Trägers blockiert.
• Inkubation mit der Probe
• Sichtbarmachung der Proteinfraktionen auf dem sekundären Träger. Das geschieht global durch eine Immunreaktion unter Verwendung spezifischer Antikörper. Die gebildeten Immunkomplexe werden dann durch den Einsatz eines Enzym-konjugierten Zweitantikörpers (Konjugat) und Substratlösung in einer Farbreaktion sichtbar gemacht. Beurteilt wird das entstandene Bandenmuster.

Siehe Abb. 52.1-18 – Prinzip des Immunoblotting.

Literatur

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52.2 Durchflusszytometrie in der klinischen Labordiagnostik

Gregor Rothe, Stefan Barlage, Evelyn Orsу, Gerd Schmitz

Die Flowzytometrie ist ein Verfahren zur Differenzierung und Zählung von Zellen in Suspension auf Basis ihrer Fluoreszenz nach Bindung markierter Antikörper und ihrer Eigenschaft der Lichtstreuung /1/.

52.2.1 Prinzip der flowzytometrischen Messung

Der Aufbau eines Durchflusszytometers, bestehend aus einer optischen Einheit, einem flüssigkeitsbasierten Transportsystem sowie einer Signaldetektionseinheit, ist in Abb. 52.2-1 – Schematische Darstellung eines Durchflusszytometers dargestellt. Die optische Einheit besteht aus einer Lichtquelle, meist in Form des Lasers, einem Linsensystem zur Fokussierung des Laserstrahls sowie einer Flusszelle, innerhalb derer die zu analysierenden Partikel auf den Laserstrahl treffen. Hierzu werden die Zellen oder Partikel innerhalb eines Flüssigkeitsstrahls fokussiert (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung) und zum Kreuzungspunkt zwischen Laser und Flüssigkeitsstrom transportiert. Beim Durchtritt durch den Laserstrahl entstehen Streulichtsignale, deren Signalintensität der Vorwärtslichtstreuung in Relation zur Zellgröße und deren Seitlichtstreuung in Relation zur Granularität der Partikel steht. Weiterhin werden Fluoreszenzsignale angeregt, welche ebenfalls im rechten Winkel zum einfallenden Laserstrahl detektiert werden.

Die selektive Analyse eines spezifischen Fluoreszenzsignals wird durch ein System von Spiegeln und Filtern erreicht, welches die Abbildung spezifischer Wellenlängenbereiche auf einzelne Detektoren ermöglicht.

Die zur Fluoreszenzdetektion eingesetzten Photomultiplier-Röhren (PMT) verstärken das Signal und konvertieren die optischen Signale in elektrische Impulse. Die Entscheidung zwischen linearer oder logarithmischer Verstärkung hängt von der Dynamik des Messbereichs ab, der sich bei Immunfluoreszenzmessungen über mehrere Dekaden erstrecken kann und somit eine logarithmische Verstärkung erfordert.

Messungen von DNA werden mit linearer Verstärkung durchgeführt. Die elektrischen Impulse werden durch Analog-Digital-Wandler digitalisiert und in Korrelation zur Signalintensität einer bestimmten Kanalzahl zugeordnet, deren Wert je nach Auflösung z.B. zwischen 0 und 1.023 oder 1 und 4.096 liegt. Diese Daten werden in Form von Listendateien (List-Mode) gespeichert und können in der Datenanalyse für jede erfasste Zelle ausgewertet werden.

Zur Darstellung der Verteilung von Häufigkeiten der Signalintensitäten über eine Zellpopulation hinweg kommen einparametrische Histogramme zum Einsatz (Abb. 52.2-2 – Darstellung der Zellanalytik mittels Durchflusszytometrie). Die graphische Darstellung von zwei Parametern in x/y-Diagrammen ergibt sogenannte Dot plots. Hierbei werden einzelne Zellen durch Punkte entsprechend ihrer zugehörigen Signale innerhalb eines zweidimensionalen Diagrammes dargestellt, so dass sich homogene Zellpopulationen als Punktwolken darstellen.

Heterogene Probenmaterialien führen zu komplexen Dot plot-Darstellungen mit vielen, z.T. überlappenden Punktwolken, so dass die Auswertung einzelner Populationen durch Software-unterstützte Erfassung einzelner Populationen notwendig ist. Software mit weitgehend automatisierten Stategien der Auswertung ist für eine Reihe von Applikationen erhältlich.

Der Aufbau moderner Durchflusszytometer ermöglicht den simultanen Einsatz mehrerer Fluoreszenzmarkierungen und somit eine multiparametrische Analyse. Es werden Überlappungen in den Emissionsspektren der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe durch Kompensationsmaßnahmen ausgeglichen. Da als Lichtquellen zur Anregung monochromatische Laser eingesetzt werden, kann nur eine begrenzte Zahl an Fluorochromen mit korrespondierenden Anregungswellenlängen angeregt werden. Deshalb sind vielfach auch Doppellaseranregungen in Routinegeräten vorzufinden.

In jedem Fall sind die einzusetzenden Fluorochrome entsprechend der verfügbaren Anregungswellenlänge auszuwählen /1, 2/.

52.2.2 Anwendungen

Die Phänotypisierung von Blut- und Knochenmarkzellen stellt die häufigste Anwendung der Durchflusszytometrie im klinischen Labor dar.

52.2.2.1 Immunphänotypisierung

Immunfluoreszenztechniken gestatten die Analyse der Expression zellulärer Antigene durch Markierung mit Fluorochrom-markierten Antikörpern. Eine Auswahl für die Diagnostik relevanter Antikörper findet sich in Tab. 52.2-1 – Auswahl diagnostisch relevanter Antigene. Hierbei handelt es sich um monoklonale Antikörper, die aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften in internationalen Workshops einzelnen Antikörperclustern (CD, Cluster of differentiation) zugewiesen wurden /3/. Polyklonale Präparationen von Antikörper werden auf Grund ihrer höheren Kreuzreaktivität nur noch in Einzelfällen, wie zur Detektion von zellständigem Immunglobulin auf B-Zellen oder dem Nachweis gebundener Rezeptorliganden, eingesetzt. Durch Kombination von Antikörpern lassen sich Leukozyten auf Grund der charakteristischen Antigenexpression unterscheiden. Somit ermöglicht die Durchflusszytometrie die Erstellung eines immunologischen Differentialblutbildes, welches durch die Möglichkeiten zur Unterscheidung von T- und B-Lymphozyten sowie NK-Zellen oder weiterer T-Zellpopulationen die Aussagen klassischer Hämatologieanalysatoren übertrifft. Zur Definition einzelner Zellpopulationen werden Eigenschaften der Lichtstreuung in Kombination mit den Daten zur Antigenexpression bzw. zur Expressionsdichte einzelner Antigene beurteilt. Eine Zusammenfassung der Expressionsdaten für ausgewählte Antigene auf Zellpopulationen des peripheren Blutes ist dargestellt in Tab. 52.2-2 – Antigenexpressionsmuster differenzierter Leukozytenpopulationen sowie der Normoblasten.

Die Durchflusszytometrie ist eine wertvolle Erweiterung der hämatologischen Diagnostik durch:

• Die Erfassung immunologisch definierter Populationen von Lymphozyten.
• Eine gute Präzision und Reproduzierbarkeit auf Grund der Auswertung hoher Zellzahlen.
• Die gute Abgrenzbarkeit und Differenzierung von unreifen und abnormen Zellen.
• Den Einsatz in der Stufendiagnostik unklarer Befunde, resultierend aus der morphologischen oder automatisierten Blutbilddiagnostik.

Ein weiterer Schwerpunkt des diagnostischen Einsatzes der Durchflusszytometrie ist die Analytik bei Leukämien, Lymphomen sowie myelodysplastischen Erkrankungen /4, 5/. In nahezu allen Fällen sind eindeutige Zuweisungen der Blastenpopulation zur myeloischen oder lymphatischen Reihe möglich. Auch werden in Kenntnis der Muster der Antigenexpression bei physiologischen Vorläuferzellen pathologische Antigenmuster erkannt. Inbesondere, wenn diese sich durch aberrante (Koexpression eines Linien fremden Antigens) oder asynchrone Expression eines Antigens (Expression eines Antigens abweichend vom vorliegenden Differenzierungsstadium) auszeichnen. Die teilweise charakteristischen Antigenmuster maligner Zellen dienen der Klassifizierung der Erkrankung und zur Detektion residualer Zellen im Rahmen der Verlaufskontrolle.

Neben der Analyse von Blut- und Knochenmarkproben kann die Immunphänotypisierung auch in der Untersuchung von Punktionsflüssigkeiten (Liquor cerebrospinalis, Ascites, Pleurapunktat), Spülflüssigkeiten (bronchoalveolare Lavage, BAL) sowie von Gewebeproben eingesetzt werden. Bei letzteren muss jedoch zuvor eine Zellvereinzelung erreicht werden.

52.2.2.2 Bestimmung absoluter Zellzahlen

Die Bestimmung absoluter Zellkonzentrationen erfolgte bislang vielfach durch Verrechnung prozentualer Anteile einzelner Zellpopulationen mit der Gesamtkonzentrationen von Zellen, die mit Hilfe von Hämatologieanalysatoren oder anderen Zellzahlanalysatoren bestimmt wurde. Exaktere Messungen können jedoch direkt am Durchflusszytometer erhalten werden mittels:

• Volumen kalibrierter Messung oder, da diese Technik in den meisten kommerziellen Durchflusszytometern nicht realisiert wurde.
• Durch Zugabe einer definierten Zahl von Mikropartikeln, anhand derer auf die Konzentration einzelner Populationen von Zellen in der gleichen Probe zurück gerechnet werden kann.

Analysen, die auf die exakte Bestimmung der Konzentration einzelner Zellpopulationen abzielen, wie z.B. die Analyse von CD4⁺T-Zellen oder CD34⁺-Blutstammzellen, sollten daher mittels dieser sogenannten Single-platform Techniken durchgeführt werden /6/.

Mikropartikel-basierte Testsysteme

Mikropartikel basierte Testsysteme bieten die Möglichkeit, an der Oberfläche fluoreszenter Partikel Reaktionen in Form von Antigen-Antikörper-Reaktionen, Enzym-Substrat-Reaktionen oder Hybridisierung von Nukleinsäure ablaufen zu lassen und zu quantifizieren. Durch die Verwendung von Mikropartikeln mit unterschiedlicher Fluoreszenzintensität oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften auf Grund unterschiedlicher Anteile zweier Farbstoffe können am Durchflusszytometer eine Vielzahl von Partikelpopulationen voneinander abgegrenzt werden. Bei unterschiedlicher Beschichtung der einzelnen Partikelpopulationen werden unterschiedliche Analyte simultan in einer Probe gemessen. Testsysteme zur Analyse von Zytokinen und Hormonen sowie aus dem Bereich der Infektionsserologie stehen kommerziell zur Verfügung, sind jedoch teilweise an Hersteller-spezifische Durchflusszytometer gebunden /7/.

52.2.3 Untersuchungsmaterial und Präanalytik

Voraussetzung zur Analyse einzelner Zellen ist das Vorliegen einer Suspension von Einzelzellen, so dass antikoagulierte proben von Vollblut bzw. Knochenmark benötigt werden. Die Wahl des Antikoagulans bestimmt sich durch die Art der Analyse. Während EDTA antikoagulierte Blutproben häufig für Immunphänotypisierungen verwendet werden, sind für funktionelle Testungen zumeist Ca²⁺haltige Medien notwendig, so dass vor allem Heparin antikoagulierte Proben verwendet werden.

Analysen der Funktion von Thrombozyten werden aus Citrat antikoaguliertem Vollblut durchgeführt. Aufgrund der multiparametrischen Analytik entfällt zumeist die Anreicherung von Zellpopulationen, z.B. über Dichtegradientenzentrifugation, da die relevante Population auf Grund spezifischer Marker detektiert werden kann /8/. Weiterhin kommen zellhaltige Punktate (Liquor cerebrospinalis) sowie Spülflüssigkeiten (BAL) zur Analyse. Zellen aus Gewebeproben müssen vor der Aufarbeitung vereinzelt werden.

Der Transport von Blutproben erfolgt bei Raumtemperatur, ebenso die Lagerung. Für Probenmaterialien mit geringer Stabilität der Zellen, wie z.B. Liquor oder Punktatmaterial, sollte die Probe jedoch gekühlt transportiert und gelagert werden. Funktionelle Testungen erfordern den umgehenden Probentransport in das Labor und eine rasche Aufarbeitung und Analyse.

Für Immunphänotypisierungen wird die Tag gleiche Bearbeitung angestrebt während eine längere Lagerung oder der Postversand von Probenmaterialien zu Einschränkungen der Aussagekraft der Teste führen können, die für die jeweils spezifischen Analysen ermittelt werden müssen.

Immunphänotypisierungen zur Diagnostik von Leukämien und Lymphomen sowie Analysen der T-Zellsubpopulationen können ohne wesentlichen Qualitätsverlust innerhalb von 24 h durchgeführt werden /8/.

Einen neuen Ansatzpunkt liefert die fixationsfreie Stabilisierung von Zellen, die eine Durchführung auch von komplexen Immunphänotypisierungen an bis zu einer Woche alten Proben erlauben.

Probleme bei der Immunphänotypisierung von Zellen können sich durch verschiedenste Faktoren ergeben:

• Zu hohe Konzentrationen von Antikörpern können zu vermehrter unspezifischer Färbung führen, zu geringe Konzentration zu einer nicht quantitativen Markierung der vorhandenen Epitope. Eine Austitration der Antikörper unter Verwendung von Zellen mit maximaler Expression der Antigene ist daher zu empfehlen.
• Waschschritte können, insbesondere nach Fixation von Zellen oder bei Verwendung von Protein armen Puffern, zu selektivem Zellverlust führen. Verwendung wenig adhärenter Probenröhrchen, fixationsfreie Verfahren der Erythrozytenlyse sowie die Zugabe von Protein oder Calcium Chelatoren zur Waschlösung können im Einzelfall zu einem geringeren Zellverlust führen.
• Der störende Einfluss einer hohen Autofluoreszenz der Zellen kann durch Verwendung von Farbstoffen mit längerwelligem Emissionsspektrum (z.B. APC) oder durch Quenching der Autofluoreszenz mit Kristallviolett vermindert werden.
• Unspezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren kann durch Vorinkubation der Zellen mit einem Überschuss von unspezifischen Immunglobulinen oder Inkubation in Serum oder Vollblut eingeschränkt werden.
• Carry over von gefärbten Proben in nachfolgende Proben kann abnorme Zellpopulationen vortäuschen und durch Vergleich der jeweiligen „dot plots“ mit den entsprechenden Bildern der vorherigen Probe erkannt werden.
• Mikropartikel, die bei der quantitativen Bestimmung von Zellen zur direkten Zellzählung zugesetzt werden, können bei geringen Proteinkonzentrationen aggregieren und hierdurch zu falschen Zählergebnissen führen. Bei der Verwendung an verdünnten Probenmaterialien, wie z.B. aus Aphereseprodukten, ist deshalb eine Verwendung von Pufferlösungen mit ausreichend hohem Proteingehalt erforderlich.

52.2.4 Anwendungen in der klinischen Diagnostik

Beispiele klinischer Anwendungen der Durchflusszytometrie zeigt Tab. 52.2-3 – Anwendungen der Durchflusszytometrie in der klinischen Diagnostik.

52.2.5 Einflussgrößen und Störfaktoren

Bei der Interpretation von Daten der Durchflusszytometrie sind in Abhängigkeit der jeweiligen Tests Einflussgrößen und Störfaktoren zu berücksichtigen /8/.

Körperlage bei der Blutentnahme

Korpuskuläre Bestandteile weisen 5–10 % niedrigere Werte bei Abnahme der Probe im Liegen auf, was bei quantitativen Bestimmungen von Zellpopulationen berücksichtigt werden muss.

Tageszeit

Für viele Werte besteht eine zirkadiane Rhythmik.

Lebensalter

Die Verteilung der Populationen von Lymphozyten im peripheren Blut ist vom Alter abhängig.

Weiterhin sind in Abhängigkeit vom jeweiligen Test verschiedenste Faktoren wie Lebensgewohnheiten, z.B. Nikotinabusus bei der Analyse der bronchoalveolären Lavage, oder Medikationen, z.B. Maskierung von Epitopen durch therapeutisch eingesetzte Antikörper, zu berücksichtigen.

Probleme bei der Immunphänotypisierung

Das Spektrum der Probleme ist breit, folgende sind wichtig:

• Die erhöhte Konzentration von Antikörpern erhöht unspezifische Farbreaktionen, eine zu niedrige Antikörperkonzentration verhindert die Sichtbarmachung eines Epitops. Eine Antikörpertitration ist deshalb wichtig.
• Waschschritte sind erforderlich nach Anfärbung der Zellen, können aber auch zu einem Zellverlust führen.
• Eine hohe Autofluoreszenz kann verhindert werden durch Verwendung von Farbstoffen mit einem Emissionsspektrum bei höherer Wellenlänge oder durch Löschung der Autofluoreszenz mit Kristallviolett.
• Die unspezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren wird verhindert durch Präinkubation der Zellen mit unspezifischen Antikörpern.
• Eine Verschleppung kann in der nachfolgend analysierten Probe eine Extrafraktion bewirken.
• Mikropartikel, die verwendet werden um die Zellzahl zu messen, können bei niedriger Proteinkonzentration aggregieren und eine falsche Zellzahl vortäuschen. Es sollen deshalb Puffer mit ausreichender Konzentration an Protein Anwendung finden.

Qualitätskontrolle

Auch für die Durchflusszytometrie sind nach Verfügbarkeit interne und externe Qualitätskontrollen durchzuführen, die neben der Überprüfung der Geräteleistung im Idealfall auch Prozesskontrollen beinhalten, die geeignet sind, Fehler in der Probenaufarbeitung aufzudecken. Hierzu stehen neben fluoreszenten Mikropartikeln zur Überprüfung der Geräteeinstellungen für einige Anwendungen zelluläre Kontrollmaterialien zur Verfügung, die z.B. eine Kontrolle der Probenaufarbeitung zur Analyse CD4⁺T-Lymphozyten ermöglichen. Ringversuche werden zu einer Reihe von Parametern wie der Lymphozytentypisierung, der Leukämie- und Lymphomdiagnostik, der Retikulozytenanalytik, oder der CD34-Stammzellanalytik angeboten.

Interne Plausibilitätskontrollen sind bei mehrparametrischen Messungen möglich, soweit die Antigenexpressionmuster der in der Probe enthaltenen Populationen bekannt sind. In der Analyse von Blutproben sollte:

• Die Zahl der CD19 und CD20 exprimierenden Zellen (B-Lymphozyten) in etwa gleich sein.
• Die Summe aus CD4⁺/CD3⁺T-Zellen und CD8⁺/CD3⁺ T-Zellen sollte in etwa der Anzahl CD3-positiver T-Zellen entsprechen.
• Die Anteile von T-, B- und NK-Zellen sollten sich in der Summe zu 100 % addieren (Lymphozytenpopulation).

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52.3 Amplifikationstechniken

Jürgen Geisel

Amplifikationstechniken in der Nukleinsäurediagnostik bieten ein breites Spektrum an Methoden, die für den gezielten Nachweis von Nukleinsäuren entwickelt wurden. Die herausragende Amplifikationstechnik ist zur Zeit die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), aber auch die aufgeführten alternativen Techniken finden in kommerziellen Testkits ihre Anwendung. Ausgehend von ihrem methodischen Ansatz muss einerseits zwischen einer Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuresequenz, z.B. PCR, und der Signalamplifikation ohne vorherige DNA-Amplifikation, z.B. branched DNA-Technik, unterschieden werden. Die methodischen Entwicklungen von Amplifikationstechniken verlaufen rasant, wobei Ansätze zur quantitativen Bestimmung einer Ziel-DNA- oder Ziel-RNA-Sequenz immer bedeutender werden und gleichzeitig der Trend sich in Richtung geschlossener Amplifikationsformate zur Vermeidung von Kontaminationen bewegt.

52.3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenraktion (PCR, Polymerase chain reaction) hat die Nukleinsäure-Diagnostik innerhalb weniger Jahre revolutioniert. Durch die PCR konnte eines der wichtigsten Probleme in der Genetik, die Amplifikation kleinster Mengen von DNA, gelöst werden. Die PCR wurde 1983 von Kary B. Mullis konzipiert und im Jahre 1985 erstmals publiziert /1/. Der Grundgedanke von Mullis war DNA ausgehend von Oligonukleotiden, im weiteren Primer genannt, durch ein Enzym, die DNA-Polymerase, in mehreren Zyklen zu vervielfältigen.

Das ursprüngliche Verfahren war sehr ineffizient und störanfällig. Die DNA-Polymerase hat ihr Optimum der Temperatur bei 37 °C und wurde in jedem Zyklus durch die Denaturierung der DNA bei etwa 95 °C zerstört. Erst der Einsatz von DNA-Polymerasen, isoliert aus thermophilen Bakterien, die in heißen Quellen leben, vereinfachte erheblich die Amplifikationsreaktion. Thermus aquaticus ist der prominenteste Mikroorganismus aus dem die thermophilen Polymerasen gewonnen werden und führte zur Namensgebung dieser Polymerasen, Taq-Polymerasen /2/. In den folgenden Jahren erfuhr die PCR eine weltweite Ausbreitung und eröffnete das Zeitalter der Genomik. Es bleibt hinzuzufügen, dass bereits 6 Jahre nach Publikation der Methode, 1991, die Firma Roche für die damalige gigantische Summe von 300 Millionen Dollar eine exklusive Lizenz von der Firma Cetus, dem ehemaligen Arbeitgeber von Mullis, erworben hatte. Dies hat zur Folge, dass die kommerzielle Verwendung der Technik zunächst einem weltweiten Patentschutz unterlag. Der Patentschutz endete 2005 in den USA und 2006 in Europa, so dass die Standard-PCR-Technik heute allgemein zu nutzen ist. Es bleibt jedoch zu berücksichtigen, dass sich der Patentschutz auf zahlreiche Folgeapplikationen erstreckt, die eine freie Nutzung einschränken. Ihrem Erfinder hat die PCR in Rekordzeit die wichtigsten wissenschaftlichen Auszeichnungen beschert, die bereits 1993 im Nobelpreis der Chemie gipfelten.

52.3.1.1 Prinzip der PCR

Die PCR wird eingesetzt, um kurze, genau definierte Teile eines definierten DNA-Strangs zu amplifizieren. Häufig sind die Fragmente nur wenige 100 Basenpaare (bp) lang, mit bestimmten Techniken können aber auch Fragmente bis zu 40 Kbp (40.000 bp) vervielfältigt werden.

Für eine Standard-PCR sind folgende grundlegende Komponenten notwendig /3, 4/:

• Ausgangs-DNA, die den zu amplifizierenden Abschnitt enthält.
• Zwei Primer, die den Anfang und das Ende des zu amplifizierenden Abschnittes markieren.
• DNA-Polymerase, die zugesetzten Nukleotide komplementär zum Ausgangsstrang einbaut. Als DNA-Polymerase wird die thermostabile Taq-Polymerase eingesetzt. Während des Kopiervorgangs baut die Taq-Polymerase etwa alle 500 bp ein nicht komplementäres Nukleotid ein. Für Standardansätze spielt dies in der Regel keine Rolle. Stören jedoch diese Einbaufehler sind thermostabile Polymerasen mit Korrekturmechanismus, wie z.B. Pwo oder Pfu, einzusetzen.
• Nukleotide dienen als Bausteine zur Synthese des komplementären DNA-Strangs.
• Pufferlösung, die für die geeignete Reaktionsbedingung der DNA-Polymerase sorgt.

Der Standard-PCR-Prozess besteht aus einer Serie von etwa 30 wiederkehrenden Zyklen, zusammengesetzt aus jeweils drei Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation (Abb. 52.3-1 – Prinzip der PCR). Die PCR findet in Thermocyclern statt, die rasch und präzise die in jedem Schritt gewünschte Temperatur ansteuern. Theoretisch gesehen wird in jedem Zyklus die DNA verdoppelt, die DNA-Menge steigt also exponentiell an. Bei 30 Zyklen erhält man somit eine Milliarde (2³⁰) Kopien. Der tatsächliche Wert liegt jedoch deutlich unterhalb dieses theoretischen Werts, da die PCR mit zunehmender Zykluszahl ineffizienter wird.

Denaturierung: Durch Erhitzen doppelsträngiger DNA auf etwa 95 °C werden die Wasserstoff-Brückenbindungen, welche die komplementären DNA-Stränge zusammenhalten, reversibel aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird häufig die DNA für 3 min bei 95 °C erhitzt, in den späteren Zyklen sind bereits 30 sec ausreichend.

Annealing: Durch Herabsetzen der Temperatur lagern sich die Primer an die komplementären Bindungsstellen der Ausgangs-DNA oder der bereits amplifizierten Fragmente an. Die Temperatur der Anlagerung (Annealingtemperatur) ist abhängig von der Sequenz und der Länge des Primers. Als Annealingtemperatur wird normalerweise eine Temperatur gewählt, die 5 °C unterhalb des Schmelzpunktes des Primers liegt. Da häufig Primer mit einer Länge von 20 bp eingesetzt werden, ergibt sich eine Annealingtemperatur von etwa 55 °C. Grundsätzlich gilt jedoch, dass die optimale Annealingtemperatur für jede PCR experimentell ermittelt werden sollte.

Elongation: Die Temperatur wird jetzt auf 72 °C erhöht. Dies ist die ideale Arbeitstemperatur der thermostabilen DNA-Polymerase. Ausgehend von den Primern baut die DNA-Polymerase den komplementären DNA-Strang auf.

52.3.1.2 PCR-Optimierung

Kann mit der Standard-PCR nicht das gewünschte Ergebnis erzielt werden, können Optimierungsschritte notwendig werden. Dabei bieten insbesondere folgende Reaktionskomponenten bzw. Reaktionsbedingungen Ansätze der Optimierung /5/:

DNA Template: Theoretisch reicht ein Templatemolekül für die Amplifikation aus. Um unter Routinebedingungen dauerhaft eine erfolgreiche PCR durchzuführen, sind wenigsten 10.000 Templatemoleküle notwendig. Dies entspricht etwa 30 ng an menschlicher genomischer DNA. Eine Überprüfung der Reinheit der DNA sollte zusätzlich erfolgen (Optische Dichte 1,8 bis 2,2).

PCR Puffer: Vom Hersteller der Polymerase wird der Puffer in der Regel mit geliefert. Eine Optimierung des Puffers erübrigt sich daher in allen Anwendungen.

MgCl₂: Mg²⁺ beeinflusst das Annealing des Primers, Trennung der DNA Stränge bei der Denaturierung, Produktspezifität, Bildung von Primerdimeren und die Fehlerrate. Zusätzlich benötigt die Polymerase Mg²⁺ um die Aktivität zu entfalten. Viele Komponenten der PCR enthalten EDTA, so dass das zugesetzte Mg²⁺ abgefangen wird. In den PCR Applikationen wird eine Standardkonzentration von 2 mmol/l eingesetzt. Zur Steigerung der Ausbeute bzw. Spezifität ist in Einzelfällen eine Optimierung der Mg²⁺ Konzentration erforderlich. Generell gilt, je höher die Mg²⁺ Konzentration umso intensiver das PCR Produkt bei gleichzeitiger Abnahme der Spezifität.

Zusätze: Zusätze können vor allem bei der Amplifikation Basen GC-reichen (komplementäre Basen Guanosin-Cytosin) Sequenzen erforderlich werden, um die Spezifität zu steigern. Dimethylsulfoxid (DMSO) (5 bis 10 %), Betain (N,N,N-Trimethylglycin) (1M) und Formamid (bis 5 % v/v) sind dabei häufig verwendete Zusätze. Glycerin (10–15 % v/v), PEG 6000 (5–15 % w/v), Twen^®20 (0,1–2,5 % v/v) kommen zum Einsatz um die Reaktion zu beschleunigen.

Nukleotide: Üblicherweise wird eine Standardkonzentration von 200 μM je Nukleotid eingesetzt. Es bleibt jedoch zu berücksichtigen, dass die Qualität bei unterschiedlichen Herstellern variieren kann, so dass eine Testung erforderlich werden kann.

Annealingtemperatur: Die Annealingtemperatur der Primer ist für die Ausbeute und Spezifität von großer Bedeutung. Heute sind unterschiedliche Formeln im Einsatz um die Schmelztemperatur (https://de.wikipedia.org/wiki/Primer) zu berechnen. Die Schmelztemperatur gibt Auskunft über die Temperatur bei der 50 % des Primers nicht mehr an das Template bindet. Die Annealingtemperatur ist daher 5 bis 10 °C niedriger anzusetzen. Trotz aller Berechnungen ist eine Austestung in der Praxis vielfach unvermeidbar. Die Austestung kann durch im Markt befindliche Gradienten-PCR-Geräte einfach realisiert werden.

Die PCR-Optimierung ist durch kommerzielle Systeme vielfach einfacher geworden. Es gibt Firmen, die ein ganzes Panel unterschiedlicher Kits für PCR-Anwendungen anbieten. Neben Standard-PCR Kits gibt es Kits, optimiert für PCR-Fragmente von bis zu 40 Kbp und Multiplex-PCR-Ansätzen. Bei immer wiederkehrenden unspezifischen Banden kann eine HotStar Polymerase eingesetzt werden. Durch einen initialen Aktivierungsschritt bei 95 °C wird die Taq Polymerase erst aktiviert. Unspezisches Primer-Annealing und Primerdimere werden dadurch vermieden.

52.3.1.3 Besondere PCR-Arbeitsverfahren

52.3.1.3.1 Reverse Transkription PCR (RT-PCR)

RNA kann nicht direkt durch die PCR amplifiziert werden, deshalb muss RNA vorab in DNA umgeschrieben werden. In vivo wird üblicherweise DNA in mRNA umgeschrieben. Der umgekehrte Prozess, die Umschreibung von mRNA in DNA, wird deshalb als reverse Transkription bezeichnet. Anwendung findet die reverse Transkription vor allem in der Diagnostik von RNA-Viren, wie zum Beispiel dem Human immunodeficiency virus (HIV) und dem Hepatitis C-Virus (HCV), und der Analyse der Genexpression. Die reverse Transkription erfolgt der PCR vorgeschaltet durch den Einsatz der sogenannten Reversen Transkriptasen (RTasen). Zur Verfügung stehen drei Reverse Transkriptasen, die sich hinsichtlich ihrer optimalen Reaktionstemperatur und der Länge des umgeschriebenen RNA-Abschnittes unterscheiden /6/:

• AMV (Avian-Myeloblastosis-Virus)-RTase, optimale Temperatur 42–60 °C, Fragmentlänge < 6.000 Basen.
• MMLV (Moloney-Murine-Leukemia-Virus)-RTase, optimale Temperatur 37 °C, Fragmentlänge < 20.000 Basen.
• Tth-DNA-Polymerase, optimale Temperatur 68–80 °C, Fragmentlänge < 1.000 Basen.

Abhängig von der jeweiligen Anwendung ist die geeignete RTase auszuwählen. Der reverse Schritt der Transkription erfolgt von einem Primer komplementär zur Ziel-RNA-Sequenz oder häufig bei mRNA von einem universal einzusetzenden Oligo (dT)-Primer mit einer Länge von 15–20 Basen. Wichtig für den praktischen Einsatz der reversen Transkription ist die Unterscheidung zwischen einer Einschritt- und Zweischritt-Reaktion.

Bei der Zweischritt-Reaktion ist der Schritt der reversen Transkription von dem Schritt der Amplifikations getrennt. Häufig werden dabei noch unterschiedliche Puffersysteme, optimiert auf das jeweilig verwendete Enzym, eingesetzt.

Bei der Einschritt-Reaktion läuft die reverse Transkription der Amplifikation zwar zeitlich vorgeschaltet, jedoch sind alle Komponenten für beide Reaktionen vereint im Ansatz. In der genetischen Diagnostik wird die Einschritt-Reaktion bevorzugt, da durch Wegfall des zweiten Schritts der Ablauf vereinfacht und das Risiko für Kontaminationen durch Wegfall der Öffnung der Reaktionsgefäße reduziert wird. Bei wissenschaftlichen Fragestellungen wird hingegen häufig die Zweischritt-Technik eingesetzt. Von besonderem Vorteil ist dabei, dass ausgehend von der im ersten Schritt durch reverse Transkription erzeugten DNA, mehrere zum Teil unterschiedliche Amplifikationen durchgeführt werden können.

52.3.1.3.2 Nested-PCR

Durch die nested PCR (geschachtelte PCR) kann sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität der PCR weiter erhöht werden. Bei der nested-PCR sind zwei PCR-Reaktionen nacheinander geschaltet. Ein Aliquot der ersten Amplifikation dient als Matrize für die zweite PCR. Die Primer der zweiten PCR hybridisieren innerhalb des ersten Amplifikates, wodurch jetzt ein kürzeres Fragment resultiert. Aufgrund der hohen Sensitivität birgt die nested PCR ein erhöhtes Risiko der Kontamination. Spezielle Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollreaktionen müssen daher zum Einsatz kommen.

52.3.1.3.3 Bisulfit-PCR

Methylcytosin ist die sogenannte fünfte Base im menschlichen Genom. In Ansätzen der Standard-PCR und in der Sequenzierung kann das Methylcytosin nicht identifiziert werden. Die Identifizierung und Quantifizierung des Methylcytosin rückt in jüngerer Zeit in den Mittelpunkt, da die Methylierung Aussagen über die Promoteraktivität einzelner Gene erlaubt. Methylierungs-basierte Biomarker werden zum Tumorscreening angeboten. Ein kommerzieller Test weist hypermethylierte Tumor-DNA im Septin 9 Gen im Blut als Hinweis für ein kolorektales Karzinom nach /7/.

Grundlage der genetschen Tests ist vielfach eine Vorbehandlung der DNA mit Bisulfit. Bei der Bisulfit-Behandlung von einzelsträngiger DNA wird Cytosin zur RNA-Base Uracil deaminiert. In der nachfolgenden PCR wird Uracil als Thymidin amplifiziert. Im Gegensatz zum unmethylierten Cytosin bleibt das Methylcytosin vor dieser Konversion geschützt. Aus dem Verhältnis von Cytosin zu Thymidin kann an der analysierten Position der Methylierungsgrad abgeleitet werden.

Die DNA-Methylierungsanalyse mittels der Methode der Pyrosequenzierung ist dargestellt in Abb. 52.3-2 – Prinzip der Bisulfit-PCR. Die Nukleotide werden in der Reihenfolge der Templatesequenz zum Reaktionsansatz pipettiert. Durch die Zugabe eines Cytosins und Thymidins an Position der möglichen Methylierungposition kann auf den Grad der Methylierung zurückgeschlossen werden.

52.3.1.3.4 Multiplex-PCR

Die Multiplex-PCR ist eine PCR-Variante, bei der gleichzeitig mehr als ein Gen-Locus in derselben Reaktion amplifiziert wird. Durch die Multiplex PCR eröffnet sich eine schnelle und sensitive Methode für Forschung und Diagnostik. Die Etablierung einer Multiplex-PCR ist deutlich aufwendiger im Vergleich zur Amplifikation nur eines Genortes. Es ist unbedingt darauf zu achten, dass alle Loci gleich effizient amplifiziert werden. Auf dem Gebiert der Sepsisdiagnostik sind mehrere kommerzielle Testsysteme verfügbar /8/. Die Tests weisen über 20 unterschiedliche Erreger nach und decken so mehr als 90 % der Fälle von Sepsis auf.

52.3.2 Formen der PCR

Zwei Hauptformen der PCR werden unterschieden. Wird die PCR nur eingesetzt, um bestimmte DNA-Abschnitte zu vervielfältigen, spricht man von einer qualitativen PCR. Möchte man zusätzlich Informationen über die zu Grunde liegende Menge einer Ausgangs-DNA erhalten, ist dies durch die quantitative PCR zu erreichen /9/.

52.3.2.1 Qualitative PCR

Die qualitative PCR folgt in der Regel dem Standardprotokoll. In vielen Fällen werden bestimmte Gene vervielfältigt, um zum Beispiel Krankheits relevante Veränderungen nachzuweisen. Die erste mittels PCR diagnostizierte Erkrankung war die Sichelzellanämie in der Mitte der 1980er Jahre. In der Gerichtsmedizin wurde die qualitative PCR ebenfalls früh zur Identifizierung von Personen eingesetzt. Ein wichtiges Einsatzgebiet der qualitativen PCR ist auch der Nachweis von Krankheitserregern. Die PCR erlaubt auf Grund ihrer hohen Empfindlichkeit eine frühere Erkennung einer Infektion im Vergleich zur Bestimmung mit Kultur oder Antikörpern.

Nach der PCR wird das Produkt in vielen Fällen anhand der Größe charakterisiert. Die weiteste Verbreitung hat die einfach zu handhabende und kostengünstige Agarosegel-Elektrophorese gefunden. Im Agarosegel wird die DNA durch Ethidiumbromid dargestellt. Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in die DNA interkaliert und so die Darstellung der DNA im UV-Licht ermöglicht /10/. Ist eine höhere Größenauftrennung des PCR-Produkts notwendig, so erfolgt die Auftrennung in Polyacrylamidgelen oder durch Kapillarelektrophorese.

Nach erfolgter PCR werden häufig zusätzlich zur Detektion von Mutationen Restriktionsenzyme eingesetzt. Diese schneiden DNA an typischen Stellen, die durch eine Basensequenz von 4–6 Nukleotiden vorgegeben sind. Durch Punktmutationen können zusätzliche Schnittstellen entstehen, aber auch vorhandene wegfallen. Anhand des Fragmentmusters im Trenngel kann auf das Vorhandensein einer Mutation geschlossen werden. Siehe Abb. 52.3-3 – Charakterisierung von PCR-Fragmenten im Agarosegel.

Die zunehmende Verbreitung der genetischen Diagnostik hat zu einer Vereinfachung der methodischen Abläufe geführt. Abhängig vom Hersteller der Geräte und Reagenzien wird dies auf unterschiedlichem Wege erreicht. Gemeinsam ist jedoch allen Ansätzen der Aufbau von homogenen genetischen Tests. Die PCR erfolgt in dem gleichen Reaktionsgefäß wie die Detektion. Eine aufwendige Detektion der PCR-Fragmente, z.B. durch Agarosegel-Elektrophorese, wird dadurch überflüssig. Risiken wie Kontaminationen werden vermieden, da die Amplifikation und Detektion im geschlossenen Reaktionsgefäß erfolgt.

Durch den Einsatz von Mutations spezifischen Gensonden ist neben der reinen Detektion der Fragmente auch eine allelische Unterscheidung möglich. Zwei unterschiedliche Methoden mit den dazugehörigen Analysegeräten haben eine weite Verbreitung gefunden. Im ersten methodischen Ansatz werden zwei Primer und zwei Gensonden in der PCR eingesetzt. Die zwei äußeren Primer sorgen für die Amplifikation, mit den zwei inneren Gensonden, die jeweils mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, erfolgt die Darstellung des PCR-Fragmentes und die Allelunterscheidung.

Das zu Grunde liegende Messprinzip ist die Fluorescence resonance energy transfer-Technologie (FRET). Sind die beiden Fluoreszenzfarbstoffe, wobei die eine Gensonde an ihrem 5'-Ende und die andere an ihrem 3'-Ende markiert ist, in unmittelbarer Nachbarschaft, wird die Anregungsenergie des ersten auf das zweite Fluorophor übertragen. Das zweite Fluorophor emittiert dann Licht einer bestimmten Wellenlänge, das für die Messung berücksichtigt wird. Die inneren Gensonden sind komplementär zum Wildtyp-Allel, entsprechend liegt der Schmelzpunkt relativ hoch. Liegt die Mutation vor, ist die Fluoreszenz-markierte Gensonde nicht mehr vollständig komplementär und der Schmelzpunkt sinkt entsprechend ab. Die Analyse des Schmelzpunktes wird zur Alleldiskriminierung eingesetzt (Abb. 52.3-4 – Schmelzpunktanalyse zur Alleldiskriminierung der Faktor V-Leiden-Mutation) /11/.

Bei dem zweiten methodischen Ansatz handelt es sich um das TaqMan^TM-System. Die PCR erfolgt mit zwei Primern und die Detektion mit einer im Fragment lokalisierten Gensonde. Charakteristischerweise trägt die Gensonde an ihrem 5'-Ende ein Fluorophor und am 3'-Ende ein Quencher-Molekül. Quencher sind Moleküle, welche die Fluoreszenz von Farbstoffen in ihrer Nähe abfangen. Durch die 5' → 3'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase wird das Fluorophor von dem Quencher der Gensonde getrennt und nach Anregung kann Licht in der erwarteten Wellenlänge emittiert werden. Zur Detektion von Nukleotidaustauschen werden zwei Gensonden mit einem unterschiedlichen Fluorophor ausgestattet, eins charakteristisch für das Wildtyp-Allel, das andere komplementär zur Mutation. Die Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase ist nur aktiv, wenn eine 100 %ige Komplementarität zwischen Fragment und Gensonde besteht. Die Gensonde, komplementär zum Wildtyp-Allel, setzt also nur Licht einer bestimmten Wellenlänge frei, wenn tatsächlich das Wildtyp-Allel vorliegt. Im Falle der Heterozygotie ist das Fluoreszenzsignal entsprechend um die Hälfte reduziert. Liegt nur die Mutation vor, entsteht kein Fluoreszenzsignal. Die Gensonde für die Mutation verhält sich analog, nur hier kommt es zu einem Fluoreszenzsignal, wenn die Mutation vorliegt /12/.

52.3.2.2 Quantitative PCR

Die quantitative PCR gibt Auskunft, ob ein bestimmter DNA-Abschnitt in der Probe enthalten ist und bestimmt zugleich dessen Menge /9/. Anwendung findet die quantitative PCR vor allem in der medizinischen Diagnostik und in der Grundlagenforschung. Grundlage der quantitativen PCR ist die Verdopplung der Reaktionsprodukte in jedem Zyklus, so dass ein Rückschluss auf die vorliegende Menge an Ausgangsmolekülen möglich ist. Die tatsächliche Effizienz der PCR liegt jedoch unter diesem theoretischen Wert. Vor allem in den ersten Zyklen und am Ende der PCR ist die Rate der Vervielfältigung nicht optimal. Ein Rückschluss von der vorliegenden DNA-Menge am Ende einer PCR auf die ursprünglich vorliegenden Moleküle ist somit nicht möglich.

Ansätze zur quantitativen PCR wurden in vielfältiger Weise beschrieben. Als gültiger Standard der quantitativen PCR ist die Echtzeit (Real-time)-PCR zu betrachten /13/. Die dabei eingesetzten PCR-Geräte sind mit einer Fluoreszenzoptik ausgestattet und können so die Menge der gebildeten DNA in jedem Zyklus erfassen. Die amplifizierte DNA wird dabei durch spezielle Fluoreszenz-markierte Sonden markiert oder die Ausbeute an Doppelstrang DNA wird als Gesamtes durch einen Fluoreszenzfarbstoff, z.B. SYBRGreen, erfasst. Somit erfassen Fluoreszenz-markierte Sonden nur gezielt die gewünschte Zielsequenz, durch einen interkalierenden DNA-Farbstoff wird hingegen jegliche Doppelstrang-DNA, möglicherweise auch unspezifische Amplifikationen, dargestellt. In der quantitativen PCR sind deshalb Fluoreszenz-markierte Sonden zu bevorzugen, da tatsächlich nur der gewünschte DNA-Abschnitt zur Darstellung kommt.

Die Quantifizierung des PCR-Produkts kann absolut oder relativ erfolgen. Geschieht die Quantifizierung absolut, ist ein Bezug auf eine Probe mit bekannter Anzahl von Zielmolekülen notwendig. Bei der relativen Quantifizierung wird die Zielsequenz auf ein in den Zellen stabil exprimiertes Gen (Housekeeping gene) bezogen. In der Diagnostik von Infektionserkrankungen gewinnt die quantitative PCR zunehmend an Bedeutung (Abb. 52.3-5 – Real-time-PCR in der quantitativen Analyse). Die relative Quantifizierung wird vornehmlich zur Analyse von zellulären Genexpressionsmustern eingesetzt.

52.3.2.3 Vermeidung von Kontamination

Die hohe Empfindlichkeit der PCR, theoretisch genügt ein DNA-Molekül, führt gleichzeitig zu Risiken der Kontamination mit bereits amplifizierten DNA-Abschnitten. Falsch-positive Testergebnisse können die Folge von Kontaminationen sein. Die Vermeidung von Kontaminationen stellt eine der größten Herausforderungen an jedes genetische Labor dar. Die Trennung zwischen einem Prä- und Post-PCR-Arbeitsplatz wird generell empfohlen. Im Prä-PCR-Bereich erfolgt die Probenaufbereitung und der PCR-Ansatz, im Post-PCR-Bereich findet die Amplifikation und Detektion der PCR-Produkte statt. Wie bereits erwähnt mindern Real-time-PCR-Geräte das Risiko der Kontamination, da die PCR und Detektion im gleichen und dabei geschlossenen Gefäß erfolgen kann. Verbreitung findet auch der Einsatz der Uracil-N-Glycosidase (UNG) zur Zerstörung von bereits amplifizierten Genabschnitten /14/. Voraussetzung ist der Austausch von dTTP durch dUTP im PCR-Ansatz. Grundsätzlich wird vor der eigentlichen PCR der Ansatz mit der Uracil-N-Glycosidase inkubiert. Alle DNA-Stränge, die dUTP enthalten, werden abgebaut. Da die Ausgangs-DNA kein dUTP enthält, bleibt diese unverändert und nur Kontaminationsprodukte aus früheren Amplifikationen werden zerstört. Im ersten Denaturierungschritt bei 95 °C wird die hitzelabile Uracil-N-Glycosidase vollständig inaktiviert.

52.3.2.4 Einsatzgebiete der PCR

Erkennung von Erbkrankheiten

Über 10.000 genetisch bedingte Erkrankungen sind bekannt /15/. Für etwa 600 verschiedene Erbkrankheiten existieren Gentests. Die genetischen Störungen umfassen ganze Chromosomen oder Abschnitte, aber viel häufiger nur einzelne Nukleotide. Sind die Nukleotidaustausche im Gen charakterisiert, können gezielt die entsprechenden Genabschnitte durch PCR amplifiziert und die Mutation durch geeignete Methoden nachgewiesen werden. Die Einfachheit der Durchführung führt gleichzeitig zu einer Inflation des Angebots an genetischen Tests. Bei monogenetischen Erkrankungen mit hoher Penetranz ist die Zuordnung des genetischen Befunds zur Erkrankung gut belegt, bei komplexen Erkrankungen ist diese Zuordnung nicht mehr durch eine einfache ja/nein-Beantwortung möglich.

Pharmakogenetik

Die Pharmokogenetik beschäftigt sich mit genetischen Varianten, die Einfluss auf die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Wirkungen eines Arzneimittels nehmen und somit verantwortlich sind für interindividuelle Unterschiede in der Wirkung. In vielen Fällen handelt es sich bei den genetischen Varianten um phänotypisch relevante Nukleotidaustausche /16/.

Liegt die Häufigkeit dieser genetischen Varianten über 1 % spricht man von einem Single nucleotide polymorphism (SNP). Grundlage der SNP-Diagnostik ist die PCR. Im Interesse der genetischen Diagnostik sind zur Zeit vor allem die Varianten der Cytochrom-P-450-Enzyme, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6. In jedem der Enzyme liegen unterschiedliche genetische Varianten mit klinischer Relevanz vor. Zur pharmakogenetischen Abklärung gehört somit immer ein Panel unterschiedlicher Mutationen. In einem seit 2004 verfügbaren CYP-P-450 DNA-Chip-Test werden gleichzeitig 31 genetische Varianten in den Enzymen CYP2C19 und CYP2D6 untersucht.

Onkologie

Die genetische Diagnostik in der Onkologie verfolgt mehrere Ziele. Standen bisher vor allem erbliche Krankheiten mit Krebsdisposition im Vordergrund, gewinnen Fragestellungen zur Prognose und zur Therapiesteuerung zunehmend an Bedeutung.

Patienten mit Mutationen im Gen KRAS besitzen eine schlechtere Prognose bei kolorektalen Karzinomen und nicht kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Gleichzeitig zeigen die Patienten eine fehlende Ansprechrate auf eine Anti-EGFR Therapie (Therapie mit Antikörpern gegen epitheliale Karzinome). Da eine Vielzahl genetischer Varianten, die sich auch in unterschiedlichen Genen befinden können, Einfluss auf die Prognose und die individuelle Therapie nehmen, wird es notwendig, eine große Anzahl dieser Varianten effizient zu analysieren. Aus diesem Grund kommen für den breiten Nachweis von genetischen Veränderungen zunehmend DNA-Chips zum Einsatz.

Ein relativ neues diagnostisches Feld in der Onkologie ist die Analyse der Promotor-Methylierung /17/. Bei der in vivo ablaufenden Methylierungsreaktion wird eine Methylgruppe an Cytosin gebunden. Durch die Promotor-Methylierung kann die Expression dieser Gene unterdrückt werden.

In der Onkologie besitzt vor allem die Abschaltung von Tumorsuppressorgenen eine wichtige Rolle. Durch Behandlung von DNA mit Bisulfit wird nicht methyliertes Cytosin in Uracil überführt. Durch PCR können anschließend die entsprechenden Promotorabschnitte der Suppressorgene amplifiziert und der Umfang der Methylierung quantifiziert werden.

Forensische DNA-Analytik

Haupteinsatzgebiet der forensischen DNA-Analytik ist der genetische Fingerabdruck, bei dem vor allem die Identifizierung einer Person im Vordergrund steht und die Ermittlung einer biologischen Verwandtschaft. Standen bis Mitte der 1990er Jahre die Analyse polymorpher Erythrozytenmembran-Systeme, Proteinsysteme, Enzymsysteme sowie das HLA-System im Vordergrund, hat die DNA-Technologie in Verbindung mit der PCR diesen Anwendungsbereich revolutioniert /18/.

Grundlage der forensischen DNA-Analytik ist die Vervielfältigung von repetitiven DNA-Abschnitten mit hoher Variabilität in Länge und Anzahl. Die Länge und Anzahl dieser repetitiven DNA-Abschnitte, auch Short tandem repeats (STR) oder Mikrosatelliten genannt, variieren sehr stark.

In der forensischen Genetik werden überwiegend Tetranukleotid-Wiederholungseinheiten mit durchschnittlich 10–20 Wiederholungssequenzen eingesetzt. Die Länge der PCR-Produkte wird anschließend in hoch auflösenden Polyacrylamidgelen durch Elektrophorese oder vielfach durch Kapillarelektrophorese in DNA-Sequenzierautomaten bestimmt.

Die genetische forensische Analyse folgt strengen Vorgaben und Regeln in Deutschland. In der Abstammungsanalyse fordert die Bundesärztekammer die Amplifikation von mindestens zwölf Short tandem repeats-Markern von mindestens zehn unterschiedlichen Chromosomen. Der molekulargenetischen Spurenkunde liegen die in der DNA-Analyse-Datei ausgewählten acht STR-Marker zu Grunde. Seit 1998 werden in Deutschland DNA-Profile von Tatortspuren, von Tatverdächtigen und bereits verurteilten Straftätern mit diesen acht STR-Markern analysiert und gespeichert. Die hohe Zahl von 570.000 angelegten Datensätzen von Personen und 142.000 von Tatortspuren bis zum Juni 2008 verdeutlicht die intensive Nutzung genetischer Techniken in der forensischen Medizin.

Infektionskrankheiten

In der Diagnostik von Infektionserkrankungen durch molekularbiologische Methoden gewinnt der Bereich der Viruserkrankungen stark an Bedeutung. Steht der alleinige Erregernachweis im Vordergrund, genügt die qualitative PCR. Seit 1999 ist z.B. die Testung auf das Hepatitis C-Virus und seit 2004 die Testung auf das HI-Virus Typ 1 (HIV-1) für alle Blutspender verbindlich vorgeschrieben.

Siehe:

• Kapitel 42 – Bakterielle Infektionen
• Kapitel 43 – Virale Infektionen.

Quantitative PCR-Techniken kommen zum Einsatz, wenn die Bestimmung der Erregerzahl von Bedeutung ist. Vor allem bei Virusinfektionen mit chronischem Verlauf besitzt die Bestimmung der Erregerzahl eine hohe Relevanz /19/. Die Anzahl der Erreger vermittelt einen besseren Eindruck über das Fortschreiten einer Erkrankung als der klinische Verlauf oder biochemische Parameter.

Wichtiger Aspekt für die quantitative PCR ist die Überprüfung eines Therapieerfolgs. Ein Beispiel für die Relevanz der quantitativen PCR ist die Bestimmung des Hepatitis C-Virus. Anhand der Virusbeladung des Bluts kann beurteilt werden, ob die Erkrankung fortschreitet und ob die durchgeführte Therapie Erfolge zeigt.

Eine weitere wichtige Anwendung der quantitativen PCR bei Infektionserkrankungen ist die Immunschwäche AIDS. Auch hier dient die quantitative PCR vor allem der Therapieüberwachung. Ein Anstieg der Viruszahl im Blut wäre der erste Hinweis, dass die eingesetzten Medikamente ihre Wirkung verlieren.

Ebenso einen hohen Stellenwert hat die PCR in der Indikation einer präemptiven Therapie. Bei Immunsupprimierten ist die Infektion mit Cytomegalievirus eine lebensbedrohliche Komplikation. Beim asymptomatischen Patienten wird bereits ein Monitoring der Viruslast durchgeführt und beim Anstieg der Viruslast sofort eine Therapie begonnen.

52.3.3 Alternative Amplifikationsmethoden

52.3.3.1 Signalamplifikation

Branched-DNA-Technologie

Bei der branched-DNA Technologie wird die Ziel-DNA oder Ziel-RNA direkt ohne vorgeschalteten PCR-Amplifikationsschritt quantifiziert /20/. Die eigentliche Amplifikationsreaktion beruht auf der Multiplikation des Messsignals. Im Reaktionsansatz befinden sich Oligonukleotide als Zielsonden, die die Ziel-DNA oder RNA an Festphase-gebundene Oligonukleotide fixieren. Ein zweiter Satz Oligonukleotide bindet an die fixierte Zielsequenz. Diese Oligonukleotide dienen wiederum Signalamplifikationsmolekülen als Bindungsstelle. Signalamplifikationsmoleküle sind synthetisch konstruierte DNA-Moleküle mit insgesamt 15 Ästen, wobei jeder Ast wiederum drei Bindungsstellen für die mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Nachweis-Oligonukleotide besitzt (Abb. 52.3-6 – Branched DNA (bDNA)-Methode zur Quantifizierung von HIV-Typ 1 RNA). Ein Ast kann somit bis zu 45 Nachweisoligonukleotide binden. Die eigentliche Signaldetektion erfolgt durch Chemolumineszenz in einem Luminometer.

Einsatz findet die branched-DNA-Technologie vor allem in der Diagnostik der Viruserkrankungen HCV und HIV-1. Im Vergleich zu Amplifiktionstechniken durch PCR kann bei der branched-DNA-Technologie auf die reverse Transkriptase-Reaktion verzichtet werden. Die im Reaktionsansatz enthaltenen Oligonukleotide können direkt an die entsprechenden RNA-Zielsequenzen der beiden Viren binden. Das Messsignal wird somit ohne enzymatischen Schritt allein durch chemische Reaktion generiert.

Die quantitative Bestimmung der Viruslast erfolgt anhand einer Kalibrationskurve. Durch Wegfall der enzymatischen Schritte ist die branched-DNA-Technologie weniger anfällig für Inhibitoren im Reaktionsansatz. Die Wahl der Oligonukleotide, die an die Zielsequenz binden, ermöglicht die Erfassung von Virussubtypen. Da nur das Signal verstärkt wird, ist das Kontaminationsrisiko deutlich geringer als bei Methoden mit Zielsequenz-Amplifikation.

Diesen Vorteilen der branched-DNA-Technologie steht eine geringfügig geringere Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu Gen-amplifizieren Methoden gegenüber. Für die Diagnostik von HCV und HIV-1 hat die branched-DNA-Technologie, vor allem in den USA, eine weite Verbreitung gefunden, in Europa werden hingegen bevorzugt PCR-basierte Tests eingesetzt. Im Rahmen der Forschung wird die DNA-Branched-Technologie in Kombination mit der xMAP^® (Multiple-analyte profiling beads) in zahlreichen Kits für die gleichzeitige Quantifizierung unterschiedlicher RNAs angeboten /21/.

Hybrid-capture-Technologie

Durch die Hybrid-capture-Technologie wird direkt, ohne vorgeschaltete enzymatische Reaktion, eine Ziel-DNA nachgewiesen /22/. Somit liegen, wie bei der branched-DNA-Methode, die Vorteile in einer einfachen und schnellen Handhabung. Aufwendige Präparationen der DNA entfallen, lediglich eine einfache chemische Reaktion zur Freisetzung der DNA ist notwendig. Da keine Zielsequenz-Amplifikation erfolgt, ist das Kontaminationsrisiko bei der Hybrid-capture-Technologie ebenfalls deutlich reduziert. Nach der Freisetzung der Ziel-DNA hybridisiert eine zugesetzte RNA-Sonde und ein DNA-RNA-Hybrid entsteht. Die Innenseite des Inkubationsgefäßes ist mit Antikörpern spezifisch für DNA-RNA-Hybride beschichtet. Die DNA-RNA-Hybride werden durch die Antikörper-Beschichtung an die Röhrchenwand fixiert. Im nächsten Reaktionsschritt bindet ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter Antikörper an die fixierte DNA-RNA-Hybride. Durch die Bindung von zahlreichen Enzym markierten Antikörpern an das Hybrid erfolgt eine Signalamplifikation um etwa den Faktor 3.000 (Abb. 52.3-7 – Hybrid-Capture-Technologie zur Detektion von DNA-Zielsequenzen). Das eigentliche Messsignal wird durch eine Chemilumineszenz-Reaktion erzeugt.

Die Hybrid-capture-Technologie hat sich vor allem in der Diagnostik des Human Papillomavirus (HPV) im Rahmen des Screenings auf das Cervixkarzinom durchgesetzt. Der Nachweis durch PCR gilt zwar als deutlich sensitiver, aber dieser empfindliche Nachweis ist hier nicht gefordert. Die Hybrid-Capture Technologie ist auf einen klinisch relevanten cut-off eingestellt.

52.3.3.2 Zielsequenz-Amplifikation

Nucleic-acid sequence-based amplification (NASBA)

Charakteristisch greifen bei der Nucleic-acid sequence-based amplification (NASBA) drei Enzyme ineinander /23/. Im Gegensatz zur PCR verläuft die Amplifikationsreaktion bei einer konstanten Temperatur von 41 °C.

Ausgangsmaterial der Amplifikation ist einzelsträngige RNA. Dies macht diese Methode besonders geeignet für den Nachweis von RNA-Viren oder Erreger-spezifische mRNA, da der notwendige reverse Transkriptase-Schritt zu Beginn einer PCR entfallen kann. Ein weiterer Vorteil, der sich aus der nicht notwendigen reversen Transkription zu Beginn ergibt, besteht in der Amplifikation von RNA vor dem Hintergrund doppelsträngiger DNA.

Im ersten Schritt der NASBA-Reaktion bindet der komplementäre Primer an die Ziel-RNA (Abb. 52.3-8 – Nucleic-acid sequence-based amplification (NASBA)-Reaktion zur Detektion von RNA-Zielsequenzen). Typischerweise enthält der Primer an seinem 5'-Ende eine Bindungssequenz für die T7-Polymerase. Ausgehend von dem angelagerten Primer synthetisiert die reverse Transkriptase, eine zur RNA komplementäre DNA.

In einem zweiten Schritt zerstört die im Reaktionsansatz befindliche RNase H selektiv die RNA-Matrize. Zurück bleibt die einzelsträngige cDNA.

Im dritten Schritt lagert sich der Gegenprimer an den gebildeten DNA-Einzelstrang an, so dass die reverse Transkriptase auf Grund ihrer Polymeraseaktivität den DNA-Gegenstrang synthetisieren kann. Der gebildete DNA-Doppelstrang enthält die angehängte Sequenz des T7-Polymerase-Promotors.

Die drei Reaktionsschritte bis zur Doppelstrangsynthese der DNA werden als nicht zyklische Vorphase beschrieben. In der zyklischen Phase wird, ausgehend vom T7-Polymerase Promotor, durch die T7-Polymerase der komplementäre RNA-Strang gebildet. Von einem einzigen DNA-Molekül können mehrere tausend RNA-Moleküle synthetisiert werden. Durch Anlagerung des Gegenstrang-Primers, anschließende DNA-Synthese durch die reverse Transkriptase, Abbau des RNA-Strangs durch RNase H und Anlagerung des Primers mit T7-Promotorsequenz entsteht aus der gebildeten RNA wiederum ein DNA-Doppelstrang mit entsprechender Promotor-Aktivität. Der DNA-Doppelstrang ist wiederum Ausgangsmolekül der zyklischen Phase (Zweitstrangsynthese). Die Kombination aus nicht zyklischer Phase, zyklischer Phase und Zweitstrangsynthese ist Ursache für die hohe Amplifikationeffizienz dieser Methode.

Transkription-mediated nucleic acid amplification (TMA)

Dieses Verfahren beschreibt einen Reaktionsablauf vergleichbar zur NASBA. Im Vergleich zur NASBA-Reaktion werden jedoch nur zwei Enzyme zugesetzt. Auf die RNase H kann verzichtet werden, da die reverse Transkriptase eine ausreichende RNAse-Aktivität besitzt. Durch den Einsatz von molekularen Beacons konnte die Quantifizierung des RNA-Strangs deutlich vereinfacht und verbessert werden. Die molekulare Beacon-Technik erlaubt eine kontinuierliche Registrierung des Messsignals und ermöglicht so quantitative Bestimmungen /24/. Molekulare Beacons sind Haarnadel förmige DNA-Strukturen, die sich aus einem selbst komplementären Stamm und einer Loop-Region, die komplementäre Sequenzen zur Zielsequenz enthält, aufbauen. An den beiden Enden tragen sie zwei Fluorophore: Einen fluoreszierenden Baustein (meist Fluorescein), der als Donor agiert, und einen Akzeptor (meist Dabcyl), der die Fluoreszenz absorbiert. Ist der fluoreszierende Baustein in der Nähe des Akzeptors positioniert, wird der fluoreszierende Effekt gelöscht. Kann jedoch der molekulare Beacon an seine Zielsequenz binden, öffnet sich die Haarnadel Struktur. Die beiden Chromophore werden räumlich getrennt, so dass die Fluoreszenz-löschende Funktion des Akzeptors aufgehoben wird. Das gemessene Fluoreszenzsignal entspricht somit der Menge der Ziel-RNA-Sequenz. Kommerzielle Tests, basierend auf der NASBA- oder TMA-Technologie, werden vor allem noch für die HPV-Diagnostik eingesetzt. Im Vergleich zu den DNA-basierten Tests ist möglicherweise eine bessere Diskriminierung zwischen transienter Infektion und klinisch relevanter Erkrankung gegeben.

52.3.3.3 Ligase-Kettenreaktion (LCR)

Zwei Oligonukleotide binden direkt nebeneinander an die Zielsequenz. Eine thermostabile Ligase verknüpft das 5'-Phosphat des einen Oligonukleotids mit dem 3'-OH des benachbarten Oligonukleotids. Aus zwei Oligonukleotiden entsteht ein neues Oligonukleotid, das der Summe der Längen der beiden Einzelnukleotide entspricht. Nach einem Denaturierungsschritt binden die kurzen Oligonukleotide erneut an ihre komplementären Sequenzen und der Vorgang der Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reaction, LCR) wiederholt sich erneut /25/. Durch unterschiedliche Markierungen der freien äußeren Enden des gebildeten langen Oligonukleotids kann einerseits die Fixierung an eine feste Phase erfolgen und andererseits die Nachweisreaktion durch eine Signalmarkierung eingeleitet werden. Ein entscheidender Nachteil der so beschriebenen Ligase-Kettenreaktion ist die im Vergleich zu anderen Methoden geringere Spezifität. Um die Spezifität zu erhöhen, werden häufig die beiden Oligonukleotide um einige Basenpaare auseinander positioniert und der Zwischenraum mit Hilfe einer Auffüllreaktion geschlossen. Die LCR Technik spielt in der Diagnostik mit selbst entwickelten Tests nur noch eine untergeordnete Rolle. In kommerziellen Tests ist diese Technik heute weitestgehend verdrängt worden.

Die vier beschriebenen nicht PCR-basierten Methoden der Amplifikation benötigen teilweise eine spezielle Technologie, die einem normalen Anwender nicht zur Verfügung steht. Drei der vier beschriebenen Methoden finden daher vor allem in kommerziellen Applikationen ihre Anwendung. Einmal optimiert sind diese Tests einfach einzusetzen. Die Vielfalt der kommerziell angebotenen Kits nimmt jedoch zugunsten PCR basierter Methoden zunehmend ab.

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52.4 Chromatographische und massenspektrometrische Analysemethoden

Michael Vogeser

Die Massenspektrometrie hat die Analytik des menschlichen Genoms revolutioniert und die klinische Analytik bezugnehmend Durchsatz und Präzision verbessert.

52.4.1 Prinzip der massenspektometrischen Bestimmung

Chromatographische Analysemethoden beruhen generell darauf, dass die konstituierenden Einzelsubstanzen eines Untersuchungsmaterials durch differentielle Adsorption an definierte Oberflächen separiert werden. An einer möglichst spezifischen Trennsäule erfolgt je nach Intensität der Wechselwirkung zwischen Analyt, mobiler und stationärer Phase die Elution in einer charakteristischen zeitlichen Sequenz. Das Chromatogramm stellt das Detektionssignal auf der y-Achse gegen die Zeit auf der x-Achse dar (Abb. 52.4-1 – Grundprinzip der Chromatographie). Ein sauber getrennter Einzelstoff ergibt einen Peak, der idealerweise eine symmetrische Form aufweist und von Probe zu Probe eine konstante Retentionszeit aufweist, über die die Identifikation erfolgt. Zur Quantifizierung von Einzelstoffen wird entweder die Fläche unter dem Peak oder dessen Höhe bestimmt und mit Kalibrationsproben in Beziehung gesetzt. Prinzipiell kann durch einen chromatographischen Lauf die Quantifizierung mehrerer unterschiedlicher Analyten erfolgen, z.B. Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin in der Phäochromozytom-Diagnostik. Den chromatographischen Analysen geht meist eine Analyt-spezifische Vorbereitung der Proben voraus, bei der interferierende Matrixbestandteile abgereichert und die Zielanalyten aufgereichert werden und teilweise auch chemische Veränderungen der Analyten erfolgen (Derivatisierung).

Aus einer Vielzahl unterschiedlicher chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken finden in der Labormedizin vor allen die Gaschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (GC-MS) Anwendung, die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (High performance liquid chromatography; HPLC) mit unterschiedlichen Detektionsverfahren, sowie die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS-MS).

52.4.1.1 Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)

Der gasförmigen Gaschromatographie sind Stoffe zugänglich, die per se volatil sind oder durch eine chemische Derivatisierung volatilisierbar sind. Aufgereinigte und meist derivatisierte Proben werden im Injektor des Gaschromatographen bei Temperaturen über 70 °C verdampft und in einem Strom von Helium (ca. 1 ml/min; mobile Phase) auf eine Trennsäule geleitet. Dies sind flexible Quarzkapillaren von ca. 30 m Länge mit einer beschichteten, definierten Innenoberfläche (stationäre Phase) und einem Innendurchmesser von ca. 0,3 mm. Während des Trennlaufs von typischerweise etwa 20 min Dauer wird die Temperatur der in einem Ofen befindlichen Säule hochgefahren, beispielsweise von 70 auf 280 °C; durch den Verlauf dieses Temperaturgradienten kann die Trennungscharakteristik variiert werden.

Ionenerzeugung

Das GC-Eluat wird direkt in die sog. Ionenquelle transferiert, die sich in einem Höchstvakuum befindet. Hier werden Elektronen aus einem Glühfilament freigesetzt, auf eine Gegenkathode hin beschleunigt und dabei zur Kollision mit den gasförmigen Probenmolekülen gebracht. Hierdurch kommt es zur Desintegration der Stoffe in unterschiedliche, geladene Fragmentionen (Electron-Impact-Ionisation, EI). Das Massenspektrometer ist als Quadrupol eine Parallel-Anordnung von vier Metallstäben oder als Ion-Trap ein von Ringelektroden umschlossener Raum.

Durch das Massenspektrometer wird mit angelegten spezifischen Radiofrequenzmustern erreicht, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt Fragmente mit nur einer bestimmten Masse-zu-Ladungs-Ratio (m/z) einen Ionen-Detektor erreichen können, während alle anderen Ionen abgelenkt werden (Massenfilter). Im Detektor schlagen die aus der Gesamtionen-Ausbeute zu einem bestimmten Zeitpunkt herausgefilterten Ionen Elektronen aus einem Aluminiumblock frei, die nach Amplifikation in einem Photomultiplier einen Messstrom erzeugen.

Massenspektren (MS)

Da die MS-Radiofrequenzen in Sekundenbruchteilen durchgestimmt werden können, ist in diesem Zeitraum ein Scan über weite Massenbereiche möglich (10–800). Die meisten Moleküle werden durch die Electron-Impact-Ionisation in 3–5 dominierende, thermodynamisch begünstigte typische Fragmentionen desintegriert. Das Massenspektrum eines Stoffs zeigt die jeweilige relative Intensität dieser Fragmente auf der y-Achse über der nach der Masse-zu-Ladungsratio skalierten x-Achse (Abb. 52.4-2 – Beispiel eines durch Elektron-Impact-Ionisation generierten Massenspektrums). Da die gewonnenen Massenspektren eine relativ hohe Stoffspezifität aufweisen und mit sehr großen Stoffbibliotheken verglichen werden können, erlauben sie die Identifikation eines Stoffs, der in einem individuellen GC-Peak eluiert. Aus den Daten der einzeln aufgezeichneten Massenspektren eines Analysenlaufs kann das Signal einer einzelnen, für einen Stoff charakteristischen Fragmentionenmasse als Ionenchromatogramm über die Zeit extrahiert und zur Quantifizierung genutzt werden (Selected ion monitoring, SIM).

52.4.2 Messmethoden

Da die GC-MS durch die Kombination der sehr hohen Trennleistung der GC mit der Massenfragmentographie ein besonders hohes Maß an Spezifität aufweist, hat diese Technik eine Schlüsselstellung im Bereich der toxikologischen und Umwelt medizinischen Analytik gewonnen. Für quantitative Untersuchungen mittels GC-MS wird überwiegend die Stabilisotopen-Verdünnungstechnik verwendet. Hierbei wird der Kalibratorserie und den Patientenproben eine identische Menge des Zielanalyten zugegeben, wobei in diesen Molekülen mehrere Atome durch stabile, nicht radioaktive Isotope ausgetauscht sind, die jeweils eine um 1 höhere Atommasse aufweisen. Beispielsweise wird zur Messung von Methylmalonsäure als interner Standard ein synthetisches Methylmalonsäure-Molekül verwendet, bei dem drei Wasserstoffatome durch Deuterium ersetzt sind; häufig werden auch native C-12-Atome durch C-13-Atome ersetzt. Auf Grund ihrer differierenden Molekülmassen können nativer Analyt aus der Probe und in einheitlicher Menge zugegebener synthetischer interner Standard massenspektrometrisch eindeutig unterschieden werden. Eigentliche Messgröße der GC-MS-Analyse ist dann das Peak-Flächen-Verhältnis zwischen der SIM-Spur des nativen Analyten und der des internen Standards. Das physikochemische Verhalten Stabilisotopen-markierter interner Standards ist mit dem der jeweiligen natürlich vorkommenden Zielanalyte praktisch identisch; hierdurch werden Varianzen in der Probenextraktion, Derivatisierung und Ionisation von Probe zu Probe voll kompensiert. Daher bietet die Stabilisotopen-Verdünnungs-GC-MS ein Höchstmaß an analytischer Richtigkeit, was entsprechende Verfahren als Referenzmethoden qualifiziert, die vor allem zur Spezifizierung von Kalibrations-, Kontroll- und Ringversuchsmaterialien eingesetzt werden.

Einsatzmöglichkeiten: Klinisch-chemische Referenzmethoden; General unknown screening in der Arbeits-, Umwelt- und Gerichtsmedizin, dort und selten bei vorhandener Methodik auch in der Klinischen Chemie Messungen mit höchstem Anspruch auf analytische Richtigkeit, z.B. Oxalsäure zur Diagnostik der primären Oxalose, Phytansäure zur Diagnostik des Morbus Refsum.

Stärken und Limitierungen

Sehr hohe Spezifität und gute Sensitivität; Identifikation unbekannter Substanzen.

Sehr hoher Aufwand in der Probenvorbereitung, sehr anspruchsvolles Gerätehandling. Enges Analytenspektrum.

Typische Anwendungen von Chromatographie und der Massenspektrometrie sind aufgeführt in Tab. 52.4-1 – Typische Anwendungen chromatographischer und massenspektrometrischer Verfahren in der Labormedizin.

52.4.2.1 High performance liquid chromatography (HPLC)

Bei der HPLC ist die mobile Phase ein Gemisch von wässeriger Pufferlösung und organischem Lösungsmittel, die stationäre Phase stellt die Oberfläche von sehr dicht in einer Stahlkartusche gepackten Partikeln mit definierter Oberfläche dar. Oft handelt es sich um Ketten von Kohlenwasserstoffen an Silica-Partikeln, z.B. C-18 für Ketten von 18 Kohlenstoffatomen. Die mobile Phase wird mit hohem Druck, meist 50 bis 150 bar und Flussraten von etwa 1 ml/min durch die gefüllte Trennsäulen-Kartuschen von ca. 15 cm Länge und 4 mm Innendurchmesser gepumpt. Die Probenaufgabe erfolgt, wie auch bei der GC, durch einen von einer umfassenden Chromatographiesoftware gesteuerten Autosampler, so dass Analysenläufe über viele Stunden ohne weitere Personalbindung durchgeführt werden können. Ein Aliquot von 10–100 μl der vorbehandelten Proben wird mit Hilfe eines speziellen Schaltventils im Autosampler in den Hochdruck-Flüssigkeitsstrom transferiert und der Säule zur Trennung zugeführt. Bei der HPLC-Trennung wird der Druck des Flüssigkeitsstroms abgebaut, das Eluat strömt mit Atmosphärendruck aus der Säule und wird in den jeweiligen Detektor geleitet. In den für die medizinische Analytik überwiegend verwendeten Reversed-phase-Systemen eluieren weniger lipophile Substanzen vor lipophileren, die eine intensivere Wechselwirkung mit den typischen apolaren stationären Phasen eingehen. Je höher der Anteil des jeweiligen organischen Lösungsmittels (meist Methanol oder Acetonitril) gewählt ist, desto früher eluieren lipophile Substanzen.

Detektion

Zur Detektion der eluierenden Substanzen finden im klinischen Labor vorwiegend drei unterschiedliche Verfahren Verwendung: UV-VIS-Detektion, Fluoreszenzdetektion und elektrochemische Detektion. Bei dem erstgenannten Prinzip finden Transmissionsphotometer Verwendung, die im ultravioletten bis in den sichtbaren Wellenlängenbereich arbeiten. Voraussetzung für die Detektion sind UV aktive Doppelbindungen im Zielanalyten. Unterschiedliche Stoffe weisen zwar typische Absorptionsmaxima bei bestimmten Wellenlängen auf, die Spezifität der UV-Detektion ist jedoch gering, insbesondere im niedrigen Wellenlängenbereich. Bei der Fluorezenzdetektion wird monochromatisches Licht einer definierten Wellenlänge in die Messzelle eingestrahlt und gegebenenfalls emittiertes Licht einer unterschiedlichen, längeren Wellenlänge detektiert. Fluoreszenz kann bei Molekülen auftreten, die konjugierte Doppelbindungen ausweisen. In manche Analytmoleküle kann durch eine chemische Derivatisierung eine Fluoreszenz aktive Gruppe eingeführt werden. Bei der elektrochemischen Detektion stellt ein spezifisches Redoxpotential der Zielanalyten die Detektionsgrundlage dar. Hierfür wird in der Messzelle eine Spannung angelegt. Kommt es zur Reduktion bzw. Oxidation eines Stoffs, kann ein Strom als Messsignal abgeleitet werden. Alle gängigen Detektionsprinzipien erfordern bestimmte molekulare Charakteristika der jeweiligen Zielanalyte und sind deshalb keineswegs universell einsetzbar. Während die Empfindlichkeit der UV-Detektion relativ gering ist (typische Nachweisgrenzen im Bereich von mg/l), können Fluoreszenz-Detektion und elektrochemische Detektion für bestimmte Analyte eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweisen (Bereich pg/l). Da die Stoffspezifität aller genannten Prinzipien der Detektion erheblich limitiert ist, muss eine vollständige chromatographische Abtrennung aller in einer medizinischen Probe vorkommenden endogenen und exogenen Substanzen vom jeweiligen Zielanalyten erfolgen.

Die Trennung kann durch eine Gradienten-Elution (gegenüber der konstanten isokratischen Elution) optimiert werden. Hierbei wird das Mischungsverhältnis von organischem und wässrigem Anteil in der mobilen Phase innerhalb des Analysenlaufes variiert. Zur Beurteilung der Vollständigkeit der Trennung ist die Bewertung der Peakform unerlässlich. Eine Verbreiterung des Peaks in einer Probe gegenüber dem Peak, der bei Injektion der Reinsubstanz gefunden wird (erkennbar in einem unterschiedlichen Quotienten von Fläche zu Höhe oder Schulter eines Peaks), spricht für eine unbekannte störende Substanz, die mit dem Analyten koeluiert und somit die Messung nicht verwertbar ist.

Probenvorbereitung

Die HPLC-Analyse biologischer Proben erfordert in allen Fällen eine spezifische Probenvorbereitung, die in den meisten Fällen darauf zielt, makromolekulare Matrixbestandteile (Proteine) aus der Probe zu entfernen, da die direkte Aufgabe von Serum schnell zu einem Verstopfen der HPLC-Trennsäule führen würden. Einfachstes Verfahren zur Vorbereitung der Proben ist die alleinige Proteinfällung mit starken Säuren oder organischen Lösungsmitteln, z.B. Trichloressigsäure bzw. Acetonitril. Nach hochtouriger Zentrifugation wird ein klarer Überstand gewonnen. Bei der aufwändigeren Flüssigphasen-Extraktion wird der Probe ein organisches Lösungsmittel wie Ethylacetat zugegeben, das sich nicht mit der wässerigen Phase der Probe mischt; durch Schütteln bildet sich eine Emulsion, lipophile Substanzen werden im Lösungsmittel angereichert. Nach Zentrifugation wird das Lösungsmittel abgenommen und zur Trockne evaporiert, schließlich wird das Extrakt in einer geringen Menge mobiler Phase aufgenommen. Hierdurch ist es möglich, lipophile Zielanalyte auf zu konzentrieren und die Empfindlichkeit der Methoden zu steigern.

Häufiger findet die Festphasen-Extraktion Verwendung, die im Prinzip eine separate Vorchromatographie mit Einwegkartuschen darstellt; Serum oder Urin werden auf die Kartuschen aufgegeben (typischerweise 0,5 bis 1 ml), die Analyten binden an die stationäre Phase der Vorbereitungssäule, hydrophile Matrix wird mit wässrigen Lösungen ausgewaschen; schließlich wird das Matrix-abgereicherte Extrakt mit einer geringen Menge eines Lösungsmittels in die HPLC-Probengefäße eluiert. Auch bei diesem Vorgehen ist ein Aufkonzentrieren von Zielanalyten möglich. Festphasen-Extraktionsverfahren können automatisiert werden, wobei auch wieder verwendbare Extraktionssäulen Einsatz finden (On-Line Festphasenextraktion).

Die Auftrennung von Proteinen, wie etwa von Hämoglobinen oder Transferrin-Isoformen, ist mit Hilfe der HPLC ebenfalls möglich und erfordert dann eine definierte Verdünnung bzw. eine Hämolyse der Proben. Für eine Reihe von Parametern bieten spezialisierte Hersteller HPLC-Komplett-Kits an, die Trennsäulen, mobile Phasen, Standards, Kontrollen sowie Verbrauchsmaterialien zur Probenvorbereitung beinhalten. Teilweise werden vom jeweiligen Labor selbst entwickelte In-house Methoden verwendet.

Einsatzmöglichkeiten

HPLC-Analysen finden in der Labormedizin vor allem für die Messung von Analyten Anwendung, für die keine ausreichend spezifischen Immunoassays zur Verfügung stehen, z.B. biogene Amine. Für eine Reihe von relativ selten bestimmten Substanzen ist die Entwicklung leistungsfähiger Immunoassays zwar technisch möglich, für die Diagnostikaindustrie jedoch nicht lukrativ, so dass HPLC-Methoden zur Messung verwendet werden müssen, z.B. für bestimmte Antiepileptika. Für einige Parameter sind sowohl leistungsfähige Immunoassays wie auch HPLC-Methoden verfügbar, z.B. HbA_1c, Homocystein. Der potentiell höheren Spezifität und meist relativ geringeren Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien steht bei HPLC-Verfahren eine hohe Personalbindung gegenüber, so dass die Wahl der Technik von den spezifischen Gegebenheiten eines Labors abhängt.

Stärken und Limitierungen

Während die Entwicklung von Immunoassays die aufwendige Produktion von Testantikörpern beinhaltet und damit praktisch komplett der Diagnostikaindustrie vorbehalten ist, können HPLC-Methoden in versierten Labors oft rasch und flexibel etabliert werden. Die Spezifität der Methoden ist meist zufriedenstellend, darf aber nicht überschätzt werden.

HPLC-Methoden erfordern, verglichen mit Immunoassays, meist einen deutlich höheren Arbeitsaufwand und spezialisiertes Personal. Auch ist der Probendurchsatz bei typischen Analysezeiten von ca. 15 min erheblich limitiert. Für viele, insbesondere endogene Analyten, wie Hormone, ist die Nachweisempfindlichkeit nicht ausreichend.

HPLC-Methoden sind nicht für alle Analyten anwendbar, da die Detektion bestimmte molekulare Strukturen voraussetzt.

Im Gegensatz zur GC-MS erlauben konventionelle HPLC-Techniken nicht den Einsatz von Stabilisotopen-markierten internen Standardsubstanzen. Hierfür müssen bei der HPLC Stoffe verwendet werden, die sich chromatographisch klar von den eigentlichen Zielanalyten abtrennen lassen, wobei ihre Extraktions-Eigenschaften dann deutlich variieren können, was die Richtigkeit der Analysen beeinträchtigen kann.

52.4.3 Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-Tandem-MS; LC-MS/MS)

Die Kopplung der Trenntechnik der HPLC mit einem massenspektrometrischen Detektionsverfahren, analog zur GC-MS, war für lange Zeit eine technische Herausforderung; ein Transfer des HPLC-Eluats direkt in ein Hochvakuum, wie bei der GC-MS, ist unmöglich, da die Evaporation der mobilen Phase enorme Gasmengen erzeugen würde, die mit dem für die Massenspektrometrie essentiell notwendigen Höchstvakuum inkompatibel wären.

Electrospray-Ionisation (ESI)

Erst die Entwicklung der ESI ermöglichte die Kopplung von HPLC und Massenspektrometer. Bei der ESI erfolgt die Ionisation der Zielanalyte bei Atmosphären-Druck außerhalb des Massenspektrometers. Hierbei wird die mobile Phase der HPLC durch eine feine Kapillare, unterstützt durch einen Stickstoff-Strom (Nebulizer Gas), aerosolisiert. Auf der Spraykapillare liegt eine Spannung von ca. 3 kV; hierdurch wird eine elektrische Ladung auf die Tröpfchen des Aerosols übertragen. In das Aerosol wird ein hoher Strom heißen Stickstoffs gelenkt (ca. 600 l/min bei über 200 °C; Desolvation Gas) um die Lösungsmittel des Eluats rasch zu verdampfen. Die entstehende Verdunstungskälte verhindert eine thermische Belastung der Analyte. Der Durchmesser der Tröpfchen nimmt schnell ab, die elektrostatische Abstoßung in den Tröpfchen übersteigt die Oberflächenspannung, was zum Zerplatzen derselben in immer kleinere Tröpfchen-Generationen führt (Coulomb-Explosion). Schließlich wird elektrische Ladung auf einzelne Moleküle in den Tröpfchen übertragen und es kommt zur Emission von Einzelionen aus den Tröpfchen auf Grund der gleichsinnigen Ladung (Abb. 52.4-3 – Prinzip der Electrospray-Ionisation). Die Ionisation erfolgt in einem Bereich von ca. 2 cm am Ende der Spraykapillare. Meist wird im positiven Ladungsmodus gearbeitet wobei ein Proton auf die Analyten übertragen wird; es kann jedoch auch zur Bildung von Clusterionen mit Bestandteilen der mobilen Phase kommen, z.B. Ammonium-, Formiat- oder Natrium-Addukte der Analyte. Der durch die ESI erzeugte Gesamt-Ionenstrom wird durch eine Gegenspannung bezüglich der Kapillare auf die feine, meist orthogonal angeordnete, Eintrittsöffnung des Massenspektrometers gelenkt. Durch Ionenoptiken wird der Ionenstrom durch einen Bereich eines relativ geringen Vakuums (ca. 10^–3 Torr) schließlich in den Hochvakuum-Bereich des Massenspektrometers (ca. 10^–6 Torr), der durch Turbinenpumpen evakuiert wird, geleitet.

Bei der ESI kommt es im Gegensatz zur Electron-Impact-Ionisation der GC-MS nicht zur Desintegration der Moleküle. Als weiche Ionisation ist die Technik auch für Makromoleküle wie Proteine und DNA anwendbar. Solche Moleküle können bei der ESI mehrfach ionisiert werden. Da Massenspektrometer primär anhand der jeweiligen Ratio von Masse zu Ladung (m/z) in einem Bereich bis 2.000 arbeiten, können mit Hilfe einer Dekonvolutions-Software beliebig große Moleküle massenspektrometrisch analysiert werden (ein 10 fach geladenes Molekül der Masse 15.000 hat ein m/z von 1.500).

Neben der Elektrospray-Ionisation werden die Atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) bzw. die Atmospheric-pressure photo ionisation (APPI) als Alternative der Atmospheric-pressure ionisation (API) eingesetzt, insbesondere bei apolaren Analyten.

Ionen-Analyse

Ein Tandem-Massenspektrometer stellt die Kopplung zweier Quadrupol-Massenfilter mit interponierter Kollisionszelle dar. Durch diese Anordnung und die Möglichkeit von unabhängigen Scans beider Quadrupole sind mehrere Arbeitsmodi der Tandem-MS möglich, wobei die dominierende Technik zur quantitativen Analytik das sogenannten Multiple Reaction Monitoring (MRM) darstellt.

Hierbei wird der bei der ESI generierte Gesamt-Ionenstrom in das erste Quadrupol geleitet, dessen Radiofrequenzmuster so geschaltet ist, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt ausschließlich Ionen einer individuellen Ratio Masse-zu-Ladung durch das Quadrupol transportiert werden, während alle anderen Ionen abgelenkt werden. Das auf diese Weise aus dem Strom der Gesamtionen herausgefilterte intakte Molekülion eines Zielanalyten (Mutterion) gelangt so in die Kollisionszelle, in die mit einem äußerst geringen Fluss ein Inertgas wie Argon strömt. Die beschleunigten Analytionen kollidieren hier mit den Argon-Atomen und werden zu thermodynamisch begünstigten Fragmentionen (Tochterionen) desintegriert. Der Fragmentionenstrom wird nun in das zweite Quadrupol geleitet, wo ein einzelnes, definiertes Fragmention des Zielanalyten herausgefiltert wird und so schließlich den Ionendetektor erreicht. Im MRM-Modus ist somit ein kontrolliert herbeigeführter physiko-chemischer Zerfallsprozess Grundlage einer hochspezifischen Stoffdetektion (Abb. 52.4-4 – Prinzip der Tandem-Massenspektrometrie). Tandem-MS-Systeme können in Zeittakten von deutlich unter 1 sec zwischen über 20 Massenübergängen alternieren, was die simultane Quantifizierung zahlreicher Stoffe in einem analytischen Lauf von wenigen Minuten Dauer ermöglicht.

Vorteile gegenüber bisherigen chromatographischen Verfahren

Auf Grund der hohen Detektionsspezifität der Tandem-Massenspektrometrie werden zum einen Hintergrundsignale weitgehend unterdrückt, was eine gute analytische Empfindlichkeit gewährleistet. Zum anderen wird die Bedeutung der Probenvorbereitung und der chromatographischen Trennung gegenüber konventionellen HPLC-Detektionsverfahren minimiert, da die simultane Elution mehrerer Stoffe kein Problem darstellt, im Fall des jeweils obligaten internen Standards eines Zielanalyten sogar wünschenswert ist (Abb. 52.4-5 – LC-Tandem-MS Chromatogram). Nach Entfernung der Probenmatrix im Rahmen einer Probenvorbereitung ist eine chromatographische Vortrennung der Probe jedoch häufig sinnvoll, um zu erreichen, dass verbliebene Matrix-Reste vor den Zielanalyten eluieren, da es anderenfalls zur Beeinträchtigung der Ionisation kommen kann (Ion suppression). Die automatisierte Festphasen-Extraktion mit Säulenschaltung und direkter Kopplung über eine kurze analytische Säule zum MS-System stellt eine bewährte Lösung dar /1/.

Während die GC-MS nur für eine sehr begrenzte Zahl medizinisch relevanter Analyte anwendbar ist (thermostabile, volatile bzw. volatilisierbare Stoffe mit einem Molekülgewicht unter 500), ermöglicht die weiche ESI, gekoppelt mit der Tandem-MS, die hochspezifische, massenfragmentographische Analyse praktisch aller im Körper vorkommender Stoffe ohne Limitierung hinsichtlich der Molekülmasse. Die ESI erfolgt außerhalb des schwer zugänglichen MS-Vakuumbereichs, nur ein sauberer Ionenstrom gelangt in diese Gerätezone. Im Gegensatz dazu gelangt bei der GC-MS das gesamte GC-Eluat in den Quellenbereich, der durch nicht-ionisierte Matrixreste verschmutzt wird. Aus diesem Grund ist der Aufwand für Gerätewartung und Probenaufreinigung bei der GC-MS sehr viel höher als bei der LC-Tandem-MS. Auf Grund der geringen Anforderungen an die Probenvorbereitung mit der Möglichkeit einer weitgehenden Automatisation, typischer analytischer Laufzeiten von wenigen Minuten und der wartungsarmen Technik, ermöglicht die LC-Tandem-MS Hochdurchsatz-Analysen. Dabei sind die laufenden Kosten pro Analyse gering. Routinetaugliche LC-ESI-Tandem-MS-Systeme sind seit Ende der 90er Jahre als Auftischgeräte verfügbar geworden.

Einsatzmöglichkeiten

Die LC-Tandem-MS eignet sich vor allem zur höchst akkuraten Quantifizierung endogener und exogener niedermolekularer Analyte in biologischen Proben, wobei wie besonders im Fall des erweiterten Neonatal-Screenings auf angeborene Stoffwechselstörungen relevant umfangreiche Multi-Analyt-Quantifizierungen möglich sind /2/. Durch die Möglichkeit einer internen Standardisierung durch Stabilisotope ist auf Basis der LC-Tandem-MS die Entwicklung von Referenzmethoden möglich.

Stärken und Limitierungen

Weites Analyten-Spektrum, für niedermolekulare biologisch relevante Stoffe anwendbar; Methodenentwicklung unabhängig von der Diagnostika-Industrie. Niedrige laufende Kosten, bei guter Geräteauslastung, sehr Kosten effiziente Technik, im Allgemeinen sehr hohe Spezifität und Richtigkeit der Messungen.

Die Spezifität der LC-Tandem-MS darf nicht als absolut betrachtet werden. So kann es z.B. zur Desintegration von Konjugat-Metaboliten eines Analyten bereits bei der Ionisation kommen /3/. Die große Zahl von im Körper vorkommender Stoffe und die Möglichkeit von Mehrfachionisationen bei der ESI birgt das Risiko, dass mehrere Stoffe gleiche MRM-Übergänge aufweisen. Aus diesen Gründen erfordert auch die LC-Tandem-MS für die meisten Applikationen eine chromatographische Vortrennung der Proben.

Mit den verfügbaren Systemen wird die potentielle Nachweisempfindlichkeit moderner Immunoassays nicht erreicht. Für die meisten Analyten können mit der LC-Tandem-MS Nachweisgrenzen von 1–10 μg/l erzielt werden. Somit ist z.B. die Quantifizierung von Peptid- und Proteohormonen noch nicht realisierbar. Die hohe Spezifität der LC-Tandem-MS, basierend auf exakten Molekulargewichten, würde hier weiterhin Probleme aufwerfen, falls Analyte auch nur geringfüge Modifikationen wie Trunkierungen aufweisen. Die Quantifizierung entsprechender Substanzen dürfte die Domäne von Immunoassays bleiben.

Kollisions-induzierte Desintegrations-Massenspektren der LC-Tandem-MS werden von weit mehr Parametern bestimmt als Electron Impact-Massenspektren der GC-MS. Die Entwicklung von Spektrenbibliotheken zur Identifikation unbekannter Substanzen in biologischen Proben ist daher für die LC-Tandem-MS nur schwer möglich, ein General unknown screening in Toxikologie und Umweltmedizin wird wohl der GC-MS vorbehalten bleiben.

52.4.4 Time of Flight (TOF)-Massenspektrometrie

Bei der TOF-Massenspektrometrie erfolgt die sehr präzise Ermittlung der Masse von Molekülen bzw. Fragmentionen anhand der jeweiligen Flugzeit in einem elektrischen Feld. Gekoppelt mit der ESI oder der Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) eignet sich die TOF-Massenspektrometrie unter Verwendung spezialisierter Software vor allem zur Charakterisierung von Proteinen, entsprechend kann die TOF-Massenspektrometrie als die Schlüsseltechnologie von Proteomics, dem Konzept einer umfassenden Charakterisierung aller Proteine im Organismus, gelten. Proteomics eröffnet möglicherweise die Perspektive der Identifikation neuer, diagnostisch relevanter Markermoleküle. Auch wird intensiv untersucht, ob die Charakterisierung krankheitspezifischer Proteinexpressions-Muster möglich ist und diagnostische Anwendung finden könnte.

Typische Anwendungen der Chromatographie und Massenspektrometrie

Siehe Tab. 52.4-1 – Typische Anwendunge der Chromatographie und Massenspektrometrie.

Literatur

1. Food and Drug Administration perspectives on clinical mass spectrometry. Clin Cem 2016; 62: 41–7.

2. Jannetto PJ, Fitzgerald RL. Effective use of mass spectrometry in the clinical laboratory. Clin Cem 2016; 62: 92–8.

3. Wilcken B, Wiley V, Hammon J, Carpenter K. Screening newborns for inborn errors of metabolism by tandem mass spectrometry. N Engl J Med 2003; 348: 2304–12.

4. Clarke NJ. Mass spectrometry in precision medicine: phenotypic measurements alongside pharmacogenomics. Clin Chem 2016; 62: 70–6.

5. Vogeser M, Seger C. Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in the clinical laboratory. Clin Chem 2010; 56: 1234–44.

6. Ferreira CR, Yannell KE, Jarmusch AK, Pirro V, Quyang Z, Cooks RG. Ambient ionization mass spectrometry for point-of-care s diagnostics and other clinical measurements. Clin Chem 2016; 62: 99–110.

7. Vogeser M, Seger C. A decade of HPLC-MS/MS in the routine clinical laboratory – goals for further developments. Clin Biochem 2008; 41: 649–62.

52.5 Sequenzierung in der Laboratoriumsmedizin

Nina Grünen, Christof Meyer-Kleine, Lothar Thomas

Die Technologien der Seqenzierung werden in drei Generationen gruppiert und werden zunehmend wichtiger in der Labordiagnostik.

52.5.1 Sanger Sequenzierung

Die Sequenzierung nach Sanger ist die erste Generation der Sequenzierungs-Technologien und wurde in 1977 von Frederick Sanger entwickelt /1/. In der ursprünglichen Version wurden die T 7-Polymerase und radioaktiv markierte Terminatoren verwendet, die beim Einbau zu einem Kettenabbruch führten. Diese Methode war sehr arbeitsaufwendig, da zum einen viel Ausgangsmaterial zur Verfügung gestellt werden musste und zum anderen pro zu analysierendem DNA-Fragment vier Reaktionsansätze erfolgen mussten. Durch eine Kombination der Polymerasekettenreaktion und mit der Verwendung von vier mit unterschiedlicher Fluoreszenz markierten Terminatoren wurde der Arbeitsaufwand dieser Methode vereinfacht. Die benötigte Ausgangsmenge sank um 99 % und die Anzahl benötigter Reaktionen um 75 % bei einer gesteigerten Spezifität und Sensitivität. Die Methode, auch als cycle-sequencing bezeichnet, wird auch heute noch vielfach angewendet.

Bei der Sequenzierung nach Sanger wird nur ein Primer eingesetzt. Verwendet wird eine Mischung aus Fluoreszenz-markierten Terminatoren, die Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTPs) und dNTPs in einem optimierenden Verhältnis. Die ddNTPs verhindern den weiteren Einbau von Nukleotiden und führen bei einem zufälligen Einbau zu einem Abbruch der DNA-Synthese. Die Sanger-Methode wird deshalb auch als statistische Kettenabbruchsynthese bezeichnet.

Im Master-Mix liegen vor: Primer, Polymerase, eine Mischung aus Trinukleotidphosphaten (dNTPs) und ddNTPs. Jede der 4 ddNTPs (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin) ist mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt, besitzt aber keine 3' Hydoxylgruppe zur Bindung an die 5' Hydroxylgruppe eines weiteren Nukleotids, was zur Verlängerung der DNA-Kette notwendig ist.

Die Sanger-Sequenzierung umfasst folgende Schritte /2/:

• Denaturierung: Ein Primer wird hergestellt (oder kommerziell erworben), der spezifisch an die Zielsequenz bindet und so als Startpunkt für die Ablesung der Nukleotidsequenz der Zielregion dient. Die Denaturierung erfolgt bei 95 °C. Die hohe Temperatur sorgt dafür, dass sich die Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den DNA Strängen trennen und das DNA-Fragment als Einzelstrang vorliegt.
• Primer Annealing: Anlagerung des Primers an das einzelsträngige DNA-Fragment; je nach Länge des vorliegenden Primers und dessen Basenabfolge sind Temperaturen von 50–65 °C optimal.
• Elongation: Die Polymerase lagert Nukleotide (dNTPs) bei 68–72 °C an die Einzelstrang-DNA. Es werden so lange dNTPs angelagert bis es zufällig zum Einbau eines ddNTPs und damit zum Abbruch der Synthese kommt. Das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPS bestimmt somit die Kettenlänge. Die Abbruchsanaloga (ddNTPs als Adenin, Guanin, Cytosin Thymin), sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Jede Farbe kennzeichnet eine der verschiedenen ddNTPs am Ende der jeweiligen Kette.
• Auswertung: Die DNA-Fragmente werden mittels Kapillarelektrophorese nach der Länge getrennt und das durch die unterschiedlichen Terminatoren entstandene Sequenzmuster bewertet.

52.5.2 Next generation sequencing (NGS) Methodik

Die NGS ist die zweite Generation und eine massive parallele Technologie der Sequenzierung. Sie wird durchgeführt, um die Anordnung der Nukleotide im gesamten DNA Strang oder in einer Zielsequenz der DNA festzustellen. Das NGS ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz und eine gute Skalierbarkeit. Einheitliche molekulare Marker, um die zellfreie DNA zu markieren, nachdem diese aus dem Blut extrahiert ist, werden angewendet. Dieser Vorgang wird vor der PCR Amplifikation und der Sequenzierung durchgeführt, um wahre Veränderungen der DNA zu registrieren und keine Veränderungen zu erfassen, die während des Amplifikationsvorgangs aufgetreten sein könnten. Nach dem Erstellen eines Registers und einer Bibliothek von Zielsequenzen wird nach Durchführung des NGS dessen Daten analysiert und eventuell vorhandene Varianten registriert durch Vergleich mit dem Register der Zielsequenzen. Die analytische Sensitivität des NGS beträgt > 99 % bei einer gleich hohen analytischen Spezifität.

NGS ist eine etablierte Methode zur Bestimmung von Mutationen der Keimbahn (angeboren) und somatischen (acquired) genetischen Mutationen. Zur Erkennung der Keimbahnmutationen sind Zielsequenzen kommerziell erhältlich. Das betrifft Zielsequenzen, Exome, Genome oder mitochondrial DNA. Auch sind Panels für bestimmte erbliche Erkrankungen verfügbar /3, 4/.

52.5.2.1 Ablauf eines next generation sequenching

DNA-Library: Sie muss spezifisch von jedem Patienten hergestellt werden.

Target-Anreicherung: Sie erfolgt durch eine PCR (Amplikon-basierende Sequenzierung) oder durch eine Hybrid capture Technik mit anschließender Bridge-Amplifikation. Es entstehen viele Polonies.

Sequenzierung: Verfahren der Sequenzierung sind die Pyrosequenzierung, das Sequenching by synthesis und das Sequenching by ligation. Die Art der Sequenzierung ist vom Sequenziergerät abhängig.

52.5.2.2 Library Präparation

Der Begriff Library Präparation bezieht sich auf den Vorgang eine oder mehrere DNAs für einen Sequenzer zu präparieren. Es gibt viele Methoden eine DNA zu fragmentieren und Adaptoren an ihre Enden zu binden. Die Adaptoren bestehen in der Regel aus universellen (PCR) Primern und Barcodes, zur Identifizierung der einzenen Patienten-DNAs. Nachdem die Adaptoren mit der Patienten-DNA verknüpft sind, kann in der sogenannten Bridge-Amplifikation die DNA vermehrt und kovalent an die Matrix gebunden werden /5, 6/.

52.5.2.3 Target Anreicherung

Die Library wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Hybridisierung erstellt und anschließend in einer PCR amplifiziert. Angewendet werden vorwiegend die Verfahren der Emulsions-PCR und der Bridge-Amplifikation. Bei der Emulsions-PCR findet die PCR an der Oberfläche kleiner Kügelchen statt. Bei diesem Verfahren befindet sich in einer Wasser-Öl-Emulsion jeweils ein Kügelchen mit Primer und ein DNA-Molekül. Kritisch ist, hierbei dass /4/:

• Die Konzentration der DNA-Fragmente, die DNA-Library-Fragmente und die Kügelchen in einem solchen Verhältnis stehen müssen, dass theoretisch jeweils ein Kügelchen einen Primer bindet.
• Zwei oder kein DNA-Fragment eine erfolgreiche Sequenzierung verhindert.

Bei der Bridge-Amplifikation entstehen durch isothermale Polymerasekettenreaktion DNA-Kolonien (cluster). Bei der Bridge-Amplifikation werden die vormals hybridisierten DNA-Fragmente kovalent an die Glasplatte einer Durchflusszelle gebunden. Dort findet die klonale Amplifikation statt. Auch hierbei ist die exakte Einstellung der DNA-Konzentration entscheidend, damit auswertbare Ergebnisse und keine Verschwendung von Sequenzierkapazität erfolgt.

52.5.2.4 Sequenzierung

• Pyrosequenzierung: Vier mit verschiedener Fluoreszenz-markierte dNTPs werden nacheinander zugefügt zur Generierung von Sequenzen an DNA-Molekülen. Erfolgt der Einbau, wird Pyrophosphat abgespalten und ein Lichtblitz erfolgt, der von einer Kamera erfasst wird. Prinzip bei Roche 454 und abgewandelt beim Ion torrent, das Änderung des pH-Werts misst.
• Sequenzierung by synthesis: Zeitgleich sind 4 mit unterschiedlichem Fluoreszenzfarbstoff markierte dNTPs verfügbar. Geschieht der Einbau, wird Pyrophosphat und Farbstoff abgespalten, der Farbstoff vermittels einer Kamera erfasst. Auch wird der terminale 3' Blocker entfernt (reversibler Terminator). Prinzip bei Illumina.
• Sequenzierung by ligation: Verwendet werden Oktamere (8-mer Oligonukleotide), die aus 2 spezifischen Nulltesten, 3 degenerierten Basen und Fluoreszenzfarbstoff bestehen. Am Sequenzierende hybridisiert das Oktamer an zu sequenzierende DNA. Prinzip bei SOLID. Der Name SOLID steht für Small Oligonucleotide Ligation and Detection system /5/.

52.5.3 NGS Plattformen

Die Next Generation-Sequencing (NGS) Plattformen haben gemeinsame Merkmale /3/:

• Die massive parallele Sequenzierung klonal amplifizierter oder einzelner DNA-Moleküle, die in einer Fließzelle räumlich voneinander getrennt sind.
• Diese Konfiguration bedeutet einen Paradigmenwechsel gegenüber der Sequenzierung nach Sanger, die auf dem Prinzip der elektrophoretischen Trennung terminaler Endprodukte in einer einzelnen Sequenzierungsreaktion beruht.
• Bei der NGS erfolgt die Sequenzierung in wiederholten Zyklen der Polymerase vermittelten Nukleotidverlängerung oder durch wiederholte Zyklen der Oligonukleotid-Ligation.
• In einem massiven parallelen Vorgang generiert das NGS, abhängig von der Plattform, hunderte von Mega- oder Gigabasen einer Nukleotidsequenz.

Für die nachfolgend beschriebenen Plattformen von

• Roche 454, IonTorrent, Illumina und Solid ist eine Amplifikation der DNA-Fragmente zu Polonies erforderlich, um das Verhältnis Signal-zu-Hintergrund zu erhöhen, da die Systeme nicht empfindlich genug sind zur Erkennung der Extension (Verlängerung) einer Base bei einer individuellen Konzentration eines Primermoleküls /5/. Die Roche 454 Plattform war das erste NGS-System, ist aber nicht mehr verfügbar.

52.5.3.1 Ion torrent (Ionen-Halbleiter)-Technologie

Beim Ion torrent Verfahren liegen an Perlchen fixierte DNA Primer vor. Die Amplifikation erfolgt mittels Emulsions-PCR an den Perlchen auf einem Halbleiter-Chip. Dieser ist wie folgt aufgebaut: Fließkompartiment, Reaktionskammer mit DNA-Polymerase, pH-Sensor und eine Anordnung von Näpfchen. Für die Sequenzierung werden die Perlchen angereichert und auf den Halbleiter-Chip geladen. Dieser enthält viele Vertiefungen, in die die Perlchen fallen und an denen die Sequenzierreaktion stattfindet. Den Reaktionskammern werden sequenziell unterschiedliche Nukleotide zugesetzt. Der Einbau eines Nukleotids in ein DNA-Fragment führt zur Freisetzung eines Protons mit Änderung des pH-Werts. Jede Vertiefung einer Reaktionskammer des Halbleiter-Chips ist mit der Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)-Technologie ausgestattet. Zum Nachweis des Einbaus eines Nukleotides wird die CMOS-Technologie angewendet, denn wenn Nukleotide zur Komplettierung in den DNA-Strang eingebaut werden, erfolgt die Freisetzung von Protonen /6/. Die dabei erfolgte pH-Änderung wird mittels CMOS-Technologie eines jeden Näpfchens gemessen. Das chemische Signal wird in ein digitales umgewandelt.

52.5.3.2 SOLID-Technologie

Der Name SOLID bedeutet „sequenching by oligonucleotide ligation and detection“. Die Präparation der Library (DNA-Fragmente) erfolgt wie zuvor beschrieben. Die Amplifikation findet in Form der Emulsions-PCR an Kügelchen statt /6/. Nach der Amplifikation werden die Kügelchen zur Sequenzierung auf Glasplatten (flow chips) zum Zwecke der Sequenzierung gebracht. Dabei wird anstelle der üblichen Polymerasereaktion eine Ligase verwendet. Die Sequenzierung findet mittels 8-mer-Oligonukleotiden statt. Jedes der Oligonukleotide besteht aus 2 spezifischen Nukleotiden, gefolgt von 3 degenerierten Basen und 3 weiteren Basen. Zwischen den degenerierten und den letzten 3 Basen befindet sich eine Schnittstelle zur chemischen Spaltung. Alle 8-mer-Oligomere sind an einen von 4 Farbstoffen gekoppelt. Die ersten 2 Nukleotide legen fest, welcher Farbstoff angekoppelt wurde. Insgesamt gibt es 4 Farben, 1024 (4⁵) verschiedene Oktamere, und 256 Oktamere pro Farbe. Jedes Nukleotid wird doppelt gelesen nach insgesamt sechs Ligationsrunden, denn das erste Oktamer beginnt immer um 1 Nukleotid versetzt und gleichzeitig werden immer 2 Nukleotide gelesen. Die gelesenen Nukleotide entsprechen bei der Solid-Methode immer Farben und nicht Nukleotiden. Die Abfolge der Farben wird wieder in die Nukleotidfolge umgeschrieben bevor die weitere Sequenzanalyse stattfindet /7/.

52.5.3.3 Illumina/Solexa-Technologie

Bei der Sequenziertechologie von Illumina findet die Amplifikation der Library nicht an Kügelchen statt, sondern beruht auf der Clusteramplifikation mittels Bridge-PCR. Bei der Sequenzierung handelt es sich um ein Verfahren des „sequenching by synthesis“. Alle 4, mit verschiedenen Farbstoffen versehenen, Nukleotide werden gleichzeitig über die Glasplatte der Durchflusszelle gespült. Die eingebauten Nukleotide werden mit einer Kamera über den jeweils angekoppelten Farbstoff erkannt. Die übrigen, nicht eingebauten Nukleotide werden weggewaschen. Durch terminale 3' Blocker wird verhindert, dass nach dem Einbau weitere Nukleotide integriert werden um einen neuen Zyklus zu beginnen /4/.

52.5.4 Sequenzierung der dritten Generation

Obwohl das Verfahren des Second generation sequencing eine massiv erhöhte Datenmenge bei einer erhöhten Sensitivität und Spezifiät liefert, ist bereits eine neue Generation in Entwicklung: das Third generation sequencing. Dieses Verfahren führt den Nachweis einzelner DNA- oder RNA-Moleküle ohne vorherige Amplifikation und ohne optische Schritte durch. Es erledigt Ablesungen in der Länge von bis zu 200.000 Basen in deutlich kürzeren Zeiträumen und hat keine Guanin-Cytosin Deckungsverzerrung bei der DNA-Sequenzierung (GC-Bias) /7/. Es besteht eine hinreichende Ablesegenauigkeit und ist genügend flexibel, um so viele Ablesungen der Sequenz wie notwendig für eine spezifische Fragestellung zu verwenden /8/.

Es ist somit möglich, die Basenfolge von DNA-Polymeren zu ermitteln während sie durch eine Nanopore geführt werden. Das Funktionsprinzip ist wie folgt: Gemessen wird die Änderung einer angelegten Spannung, wenn DNA über eine Membran durch wenige Nanometer große Proteinporen transportiert wird. Die Veränderung des Stromes über die Poren wird gemessen, wenn biologische Moleküle die Poren passieren. Das Signal des Stromes wird verwendet um die Moleküle zu identifizieren /9/. Es ist möglich, die Basenfolge von DNA-Polymeren, die durch die Poren geführt werden, zu bestimmen.

Mit der Sequenziermethode der dritten Generation ist es möglich, krankheitsrelevante genomische Regionen zu untersuchen, die bisher nicht auslesbar waren.

Literatur

1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74 (12): 5463–7.

2. Neveling K, Hoischen A. Einführung in die Grundlagen der Hochdurchsatzsequenzierung. Medgem 2014; 26: 231–8.

3. Voelkerding KV, Dames SA, Durtschi JD. Next generation sequencing: from basic research to diagnosis. Clin Chem 2009; 55 (4): 641–58.

4. Abedlhagafi M, Bawazeer S, Fawaz RI, Heritage AM, Faqeih E. Non invasive prenatal testing: a revolutionary journey in prenatal testing. Frontiers in Medicine 2023. doi: 103389/fmed.2023.1265090.

5. Cai G, Buxbaum JD. Sequencing by ligation. Science direct 2015; www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/sequencing-by-ligation

6. Liu L, Li Y, Li S, Hu N, He Y, Pong R, et al. Comparison of next-generation sequencing systems. J Biomed and Biotech 2012. doi: 10.1155/2012/251364.

7. Mardis ER. The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Cell, Trends in Genetics 2008. doi: 10.1016/j.tig2007.12.007.

8. Petersen LM, Martin IW, Moschetti WE,Kershaw CM, Tsongalis GJ. Third-generation sequencing in the clinical laboratory: exploring the advantages and challenges of nanopore sequencing. J Clin Microbiol 2019; 58 (1): e01315–19.

9. Zhong Y, Xu F, Wu J, Schubert J, Li MM. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Ann Lab Med 2021; 41 (1): 25–43.

52.6 Metabolomics

Lothar Thomas

Metabolomics sind kleine Moleküle (< 1.000 D). Sie spielen z.B. eine Rolle im Screening von Neugeborenen.

Metabolomics werden unterschieden in /1/:

• Gezielte Metabolomics: Gesucht wird nach einer bekannten Substanz bei einer Krankheit, die quantitativ bestimmt werden soll. In klinischen Laboratorien betrifft dies das Neugeborenenscreening, z.B. Störungen der Entsorgung des Ammoniaks, und Störungen des Cholin-, Creatin- und Purin-Stoffwechsels /1/.
• Ungezielte Metabolomics: Bei einer Krankheit wird ein breites Spektrum niedermolekularer Substanzen oder ein Muster niedermolekularen Substanzen gesucht. Ein Problem ist, dass eine Vielzahl von Substanzen in der Probe identifiziert werden, die zur Fragestellung nichts beitragen.

52.6.1 Bestimmungsmethode

Plattformen zur Erfassung von Metabolomics sind die hochempfindliche Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektroskopie.

52.6.2 Untersuchungsmaterial

Serum, Urin, seltener Liquor cerebrospinalis.

52.6.3 Bewertung

Die zielgerichteten Untersuchungen auf Metabolomics sind vorselektiert. Eine Liste angeborener Stoffwechselstörungen, bei denen Metabolomics bestimmt werden, ist in Lit. /1/ aufgeführt.

Durch nicht zielgerichtete Metabolomics kann simultan ein breites Spektrum von Analyten in einer Probe bestimmt werden. Metabolische Datenbasen helfen dem Forscher bei der Interpretation, aber ein Referenzstandard muss immer vorliegen /2/.

Literatur

1. Odom JD, Sutton VR. Metabolomics in clinical practice Clin Chem 2021; 67 (12): 1606–17.

2. Wishart DS, Jewison T, Guo AC, Wilson M, Knox C, Liu Y, et al. HMDB 3.0 – The human metabolome database in 2013. Nucleic Acids Res 2013; 41: D80 1–7.