Hämatologie

15.1 Hämatopoese

Lothar Thomas

Die zirkulierenden Blutzellen haben eine multifunktionale Rolle in der Aufrechterhaltung der Organfunktionen. Sie reagieren auf Stimuli und passen ihre Zahl und Funktion an die Erfordernisse des Organismus an. Die Lebensdauer der einzelnen Blutzellen in der Zirkulation ist aufgeführt in Tab. 15.1-1 – Lebenszeit im Blut und täglicher Umsatz von Blutzellen. Änderungen in der Zahl oder Funktion von Blutzellen können aus einer Erkrankung des hämatopoetischen Systems resultieren oder die Hämatopoese ist aktiviert oder kompromittiert auf Grund der Erkrankung eines Organes oder einer systemischen Erkrankung. Letzteres ist der häufigere Fall.

15.1.1 Klonale Hämatopoese mit unbestimmtem Potential (CHIP)

Die klonale Hämatopoese mit unbestimmtem Potential (Clonal Hematopoiesis of Indeterminante Potential; CHIP) ist eine hämatologische Vorläufererkrankung. Sie ist durch somatische Mutationen peripherer Blutzellen definiert, aber ohne Evidenz für eine Leukämie oder eine andere hämatologische neoplastische Erkrankung.

15.1.1.1 Blutzellzahlabnormitäten bei CHIP

Die Mehrzahl der Personen mit CHIP hat eine normale Morphologie der Leukozyten. In einigen Studien wurde aber eine Erhöhung des mittleren zellulären Volumens (MCV) der roten Blutzellen beschrieben und die erhöhte Verteilungsbreite der Erythrozyten (red cell distribution width; RDW) ist das beständigste Merkmal der CHIP. Der next generation sequencing basierte Nachweis der CHIP ist der diagnostische Standard in der hämatologischen Diagnostik bei Verdacht auf eine myeloische Leukämie. Zur Zeit ist keine Testung auf CHIP in der Normalbevölkerung geplant. Zusätzlich zur hämatologischen Progression ist die CHIP mit einer Vielzahl nicht-hämatologischer Erkrankungen assoziiert, von denen kardiovaskuläre Beschwerden am besten verstanden und klinisch behandelt werden /34/.

15.1.1.2 Rote Blutzellen

Rote Blutzellen umfassen zu 99 % die Erythrozyten und zu 1 % die Retikulozyten. Rote Blutzellen transportieren O₂ von der Lunge in die Gewebe und CO₂ von den Geweben in die Lunge. Sie üben ihre Funktion ausschließlich in der Zirkulation aus. Im Mittel enthält der menschliche Organismus eine rote Blutzellmasse von 2–3 Litern und die täglich total zirkulierende Erythozytenmasse beträgt 3.000 Liter. Etwa 2,0 × 10¹¹ alternde Erythrozyten (etwa 1 % der gesamten roten Blutzellen) werden bei einer erwachsenen Person täglich aus der Zirkulation genommen, von der Milz zurückgehalten, von deren Makrophagen abgebaut und vom Knochenmark wieder ersetzt. Jeder Erythrozyt gelangt als Retikulozyt in die Blutbahn. Eine Erhöhung des Anteils der Retikulozyten im Blut ist ein Zeichen, dass die Sauerstoffversorgung der Gewebe unzureichend ist /1/. Beim akuten extremen Sauerstoffmangel der Gewebe ist die Blutversorgung gestoppt. Innerhalb von 1–2 Stunden nach Beginn der Hypoxie steigt die Konzentration von Erythropoetin in der Zirkulation an und eine Verdopplung der Retikulozytenzahl nach 1–2 Tagen ist die Folge /1/.

Zellmembran roter Blutzellen

Die Zellmembran roter Blutzellen (RBCs) besteht aus einem Lipid bilayer der etwa 20 wichtige Proteine und mindestens etwa 850 kleinere oder unwesentlichere Proteine enthält /2/. Der Lipid bilayer fungiert als eine Barriere zum Rückhalt von Kationen und Anionen innerhalb der RBC während Wassermoleküle frei passieren können. Die Aufrechterhaltung der inneren hohen K⁺ Konzentration und der niedrigen Konzentration von Na⁺ im Vergleich zur Konzentration dieser Ionen im Plasma ist bedingt durch den passiven Austritt von K⁺ die zurück gepumpt werden im Austausch zu Na⁺ durch die ATP abhängige Na+–K+ Pumpe. Ein weiterer wichtiger Bestandteil der RBC Membran ist das Zytoskelett. Dieses Proteinnetzwerk begrenzt die innere Oberfäche der Zellmembran und enthält Proteine wie Spectrin und Actin die miteinander verbunden sind in zwei Proteinkomplexen; Ankrin und Protein 4.1 Komplex. Die Membran der RBC ist mit dem Zytoskelett verknüpft durch Protein-Protein-Bindungen und Protein-Lipid-Bindungen. So erhält die RBC ihre Form, Stabilität und Deformierbarkeit. Während ihres Lebenszyklus ist die RBC gezwungen die Poren und Sinusoide in der Milz zu durchqueren und hat eine dauernde Interaktion mit diesem Organ, das dazu beiträgt die Morphe der Zelle in den ersten Lebenswochen zu formen. Außerdem ist die Milz bedeutsam in der Entfernung alter oder geschädigter Zellen aus der Zirkulation.

15.1.1.3 Dynamik der roten Blutzellen

Die RBCs erfahren nach dem Verlassen des Knochenmarks während der ersten Tage in der Zirkulation eine schnelle Verminderung des Volumens und von Hb. Dieser raschen Phase folgt eine langsamere in der das Volumen und die Hb Menge korrelieren /3/. Das Volumen und der Hb Gehalt korrelieren mit Reifung der Zellen. Beträgt der Korrelationskoeffizient des Volumens der RBC in der retikulozytären Phase nur 0,40 so erreicht er in der Population der reifen Erythrozyzyten etwa 0,85.

15.1.1.4 Adaption der Erythroblasten an Eisen

Während der Reifung der RBCs wird eine Menge Eisen zur Bildung von Hämoglobin benötigt. Da Eisen für die Synthese von Häm essentiell ist, verbraucht die Erythropoese den größten Teil des Körpereisens. Der Transkriptionsfaktor Bach-1 ist in die Antwort der Erythroblasten an eine Verminderung des Eisens involviert. Bei Eisenmangel und verminderter Bildung von Häm bremst Bach-1 die Gene der Globinsynthese in den Erythroblasten und gleicht die Globinsynthese an die Bildung von Häm an /4/.

Der Regulator der Erythropoese, das Protein Erythroferron begünstigt die Eisenverfügbarkeit des Knochenmarks bei einem erhöhten Bedarf an Eisen, z.B. nach einer akuten Blutung. Nach Stimulation durch Erythropoetin bildet die hyperproliferative Erythropoese das Protein Erythroferron, das die Synthese von Hepcidin in der Leber bremst. Somit wird vermehrt Eisen absorbiert und aus den Speichern freigesetzt, das den Erythroblasten zur Bildung von Häm zur Verfügung steht /5/.

15.1.2 Thrombozyten

Pro Tag werden etwa 2 × 10¹⁰ Thrombozyten pro Liter Blutvolumen gebildet. Die Plasmamembran enthält Rezeptoren wie den Glykoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptor und den von Willebrand Rezeptor GP Ib/V/IX. Die Wirkungsstätte der Rezeptoren ist primär die Gefäßwand, von wo aus sie die Hämostase aufrecht halten.

15.1.3 Leukozyten

Die Leukozyten über ihre Funktion extravasal aus und benutzen das Blut nur als Transport­mittel /1/.

Polymorpkernige neutrophile Granulozyten (PMN)

Der Pool an PMN ist im Blut in zwei Kompartimente von etwa gleicher Größe aufgeteilt. Der zirkulierende Pool wird bei der Blutentnahme zur Leukozytenzählung gut erfasst, nicht aber der marginale Pool. In diesem sind die PMN an die Wände kleiner Gefäße adhäriert. Es besteht jedoch ein konstanter Zellaustausch zwischen den beiden Kompartimenten. In den Geweben phagozytieren die PMN mikrobielle Erreger und zerstören diese.

15.1.3.1 Eosinophile Granulozyten

Nach kurzer Zirkulation im Blut nehmen sie im Gewebe, stimuliert durch das Immunsystem, an inflammatorischen Reaktionen teil und sind in die Abwehr gegen Infektionen mit Helminthen involviert.

15.1.3.2 Basophile Granulozyten

Auch diese Zellen haben ihren Wirkort in den Geweben und nehmen an der Immun-vermittelten Sofortreaktion teil.

15.1.3.3 Lymphozyten

Sie variieren in der Größe von etwas größer als Erythrozyten bis zur Größe von Monozyten. Lymphozyten werden grob in T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen differenziert und sind in die Vermittlung der angeborenen und erworbenen Immunität involviert. Die Subpopulationen werden flowzytometrisch bestimmt. Siehe auch Beitrag 21.1.4 – Angeborene Immunität.

15.1.3.4 Monozyten

Wie bei den PMN ist auch bei den Monozyten das Blut nur ein Transportmittel und die Zellen sind in ein zirkulierendes und ein marginales Kompartiment verteilt. Nach Stimulierung, die gewöhnlich in den Geweben erfolgt, transformieren sie zu den metabolisch aktiven Makrophagen. Ihre wesentlichen Funktionen sind die Phagozytose von alternden Erythrozyten, von Mikroorganismen und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen zur Regulation des zellulären und humoralen Immunsystems.

15.1.3.5 Zellverteilung im Knochenmark

Die im Knochenmark reifenden und sich differenzierenden Zellen der Hämatopoese umfassen zu 60 % Zellen der granulozytären Zellreihe, vorwiegend der neutrophilen, 20 % erythropoetische Vorläuferzellen und 15 % Lymphozyten, Plasmazellen, Monozyten und Megakaryozyten.

15.1.4 Hämatopoetisches System

Das hämatopoetische System versorgt das Blut mit Zellen, muss einen konstanten Turnover an Zellen aufrecht erhalten und auf akute Provokationen reagieren /6/. In einem Zeitraum von 7 Jahren bildet der Erwachsene eine Masse von Blutzellen, die seinem Körpergewicht entspricht.

Das hämatopoetische System ist hierarchisch organisiert (Abb. 15.1-1 – Hierarchie des hämatopoetischen Systems mit Myelopoese und Lymphopoese). Ausgangszellen sind die Stammzellen, mit der Fähigkeit der Reproduktion und Differenzierung. Die Differenzierung der Stammzelle in Blutzelllinien ist ein stufenförmiger Prozess, bei dem verschiedene Zelltypen mit unterschiedlicher Funktion gebildet werden. Stammzellen haben von allen hämatopoetischen Zellen die höchste Kapazität der Selbsterneuerung. Spätere Stammzellen (Committed progenitor cells) sind auf eine Zelllinie begrenzt und haben eine geringere Kapazität der Reproduktion.

Wachstumsfaktoren und Zytokine sind wesentlich für das Überleben und die Proliferation hämatopoetischer Zellen auf allen Stufen der Entwicklung /7/. Die Aktivierung von Rezeptoren auf der Zellmembran hämatopoetischer Zellen durch Wachstumsfaktoren übermittelt den Zellen Signale zur Differenzierung.

Eine effektive Erythropoese ist das Ergebnis eines Zusammenspiels der hämatopoetischen Zellen und des sie unterstützenden Stromas. Über 95 % der Hämatopoese findet im Knochenmark statt, dies ist der einzige Ort, wo Erythropoese, Granulopoese, Lymphopoese, Monopoese und Megakaryopoese simultan ablaufen. Unter bestimmten Bedingungen kann die Hämatopoese auch in der Milz stattfinden. Die hämatopoetische Stammzelle kann die Hämatopoese nur in einer entsprechenden Mikroumgebung durchführen.

15.1.4.1 Hämatopoetische Mikroumgebung

Das Stroma des Knochenmarks bildet die Mikroumgebung der hämatopoetischen Zellen, beeinflusst deren Proliferation und Differenzierung und besteht /8/:

• Aus Fibroblasten, Makrophagen, Adipozyten und akzessorischen Zellen wie T-Lymphozyten und Monozyten.
• Extrazellulärer Matrix, z.B. Kollagen, Laminin, Fibronectin und Proteoglykanen.

Die Zellen der Mikroumgebung beeinflussen auf positive oder negative Weise die Hämatopoese durch folgende Mechanismen:

• Den direkten Zell-Zell-Kontakt, so benötigen pluripotente Stammzellen in vitro den Kontakt mit Stromazellen.
• Die Sekretion von Proteinen, die der Aufrechterhaltung der Struktur der extrazellulären Matrix dienen.
• Die Bildung von löslichen und Zell-assoziierten Zytokinen. So werden Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Interleukine (IL-1, IL-3, IL-6, IL-12), aber auch Inhibitoren wie Tumornekrosefaktor-α, Transgrowth Faktor-β und Interferon-γ gebildet.

15.1.4.2 Hämatopoetische Stammzelle

Die Populationen der Blutzellen werden durch die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im Knochenmark aufrecht erhalten. Diese Zellen leiten sich von einer gemeinsamen hämatologischen Vorläuferzelle ab, die aus der Embryogenese stammt und ihre Funktionen das Leben lang beibehält. Zusätzlich zum Differenzierungspotential hat die Stammzelle das Vermögen Tochterzellen zu bilden, die ein gleiches oder ein ähnliches proliferatives und Differenzierungspotential haben als die Mutterzelle /9/. Stammzellen sind definiert als sich selbst erneuernde Zellen, die alle Zellinien für mindestens 4 Monate bilden können, wenn sie in eine Empfängermaus transplantiert werden /10/. Die Teilung der Stammzellen verläuft asymmetrisch. Eine Tochterzelle behält die Pluripotenz der Mutter, während die andere limitiert (committed) ist, sich in Richtung einer der hämatopoetischen Zelllinien zu entwickeln. Stammzellen befinden sich in einem ruhenden oder gering aktiven Status beim Erwachsenen. Die Ruhigstellung erfolgt durch das pleiotrope Hormon Transforming growth factor-β (TGF-β) /11/.

Die hämatopoetischen Vorläuferzellen werden nach dem Kolonietyp (Colony forming unit; CFU) benannt, den sie bei in vitro-Kultivierung bilden /12/. Die pluripotente Stammzelle hat die Bezeichnung CFU-Blast (Abb. 15.1-1 – Hierarchie des hämatopoetischen Systems mit Myelopoese und Lymphopoese). Sie kann Zellen aller hämatopoetischen Linien bilden. Ihr Anteil an den Knochenmarkzellen ist 0,05 %. Die CFU-Blast exprimiert CD34⁺, aber kein Linienmerkmal, ist also definiert als CD34⁺DR^–lin^–. Die Expression des HLA Merkmals DR ist eines der frühesten Differenzierungsmerkmale und führt von der CFU-Blast zu den Committed progenitor cells. Von diesen kann die CFU-GEMM in eine der Zelllinien G = Granuloyzten, E = Erythrozyten, M = Monozyten und M = Megakaryozyten differenzieren /13/.

Die Differenzierung von der CFU-Blast zu einer Committed progenitor cell (Linien-gebundenen Vorläuferzelle) unterliegt der Kontrolle von Wachstumsfaktoren. Von diesen ist der von den Stromazellen gebildete Stammzellfaktor (SCF) der wichtigste. Der SCF ist besonders für das Langzeitüberleben von sich nicht teilenden, pluripotenten Stammzellen verantwortlich.

Pluripotente Stammzellen sind auch im peripheren Blut vorhanden, der Anteil von CD34⁺-Zellen an den mononukleären Blutzellen ist 0,15 %. Durch einen Chemotherapiekurs wird ihr Anteil auf 0,6 % erhöht und durch Apherese für einen Stammzelltransfer gewonnen.

15.1.4.3 Hämatopoetische Wachstumsfaktoren

Wachstumsfaktoren sind erforderlich für /7/:

• Das Überleben und die Proliferation hämatopoetischer Zellen aller Entwicklungsstadien. Es handelt sich um den Steel factor, den Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) ligand, den Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) und IL-2, IL-3 und IL-7.
• Die Förderung von Vorläuferzellen, die auf eine oder zwei Zellinien beschränkt ist. Linien spezifische hämatopoetische Wachstumsfaktoren sind Erythropoetin und Thrombopoetin.

Der Stammzellfaktor (SCF) wird von den Stromazellen gebildet und bindet an c-Kit, den Tyrosinkinase Rezeptor auf Stammzellen und Committed progenitor cells. SCF generiert oder aktiviert diese Zellen und sensitiviert sie für die Colony stimulating factors (CSF). In Zellkulturen zeigt SCF synergistische Effekte mit den CSFs /14/.

Linien spezifische Wachstumsfaktoren werden in den Nieren (Erythropoetin), Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen (G-CSF), Stromazellen des Knochenmarks und in der Leber (Thrombopoetin) gebildet. Die Linien-spezifischen Wachstumsfaktoren vermitteln ihre Wirkung über Rezeptoren der Zytokinrezeptor Superfamilie. Es handelt sich um transmembrane Proteine mit einer oder zwei extrazellulären Bindungsdomänen und einer intrazellulären Domäne, die Kinasen der Januskinasen (JAK)-Familie aktiviert. Die JAK vermitteln über mehrere Zwischenschritte die Signalübertragung auf den Zellkern /7/.

15.1.5 Embryonale und fetale Hämatopoese

Die Blutzellen werden in der SSW 3–6 im Dottersack, der paraaortalen Splanchnopleura (P-Sp) und der ventralen Region des Embryos, die für die Entwicklung von Aorta, Gonaden und Mesonephros (AGM) verantwortlich ist, gebildet. Von diesen Stellen aus erfolgt schon sehr früh die Besiedlung der rudimentären Leber, die bis zur SSW 22 der Hauptort der embryonalen und fetalen Blutbildung ist. In dieser Zeit geschieht die Kolonisation des Knochenmarks und der Milz. In der zweiten Hälfte der Schwangerschaft wird das Knochenmark der Hauptbildungsort der Blutzellen und bleibt es lebenslang. Die Milz verbleibt als Lymphorgan.

Die ersten erythropoetischen Blutzellen sind primitive Erythroblasten im Dottersack am 16.–19. Tag post conceptionem. Das Hämoglobin (Hb) dieser Zellen enthält embryonale Globine. Die Zellen behalten ihren Kern auch eine Zeit lang in der Zirkulation. Die Differenzierung der Erythroblasten erfolgt in der Zirkulation durch Akkumulation zunehmender Mengen an Hb. Ab der 8. Entwicklungswoche ersetzen von der Leber gebildete definitive rote Blutzellen langsam die Erythroblasten. Der Wechsel soll auf einem Dosiseffekt des Gens Eklf beruhen /15/. Die definitiven roten Blutzellen sind kleiner, haben keinen Kern mehr und die Globinbildung ist auf fetales Hb oder Erwachsenen Hb begrenzt. Die Synthese erythropoetischer Zellen ist abhängig von Erythropoetin, das sowohl ein Mitogen als auch ein Überlebensfaktor für erythroide Vorläuferzellen ist /16/. Während der Fetalzeit nehmen der Wert des und der Hämatokrit zu, während das mittlere korpuskuläre Volumen (MCV) abnimmt.

Während des Lebens vermehren sich hämatopoetische Stammzellen und differenzieren in reife Blutzellinien. Bis eine genügende Menge von hämatopoetischen Stammzellen in der Leber gebildet sind um die Erythrozyten Erwachsenener (definitive Erythrozyten) zu bilden spielen die embryonal/fetal-spezifischen Erythrozyten, auch als primitive Erythrozyten bezeichnet da sie im extraembryonalen Dottersack gebildet werden, eine wichtige Role in der Sauerstoffversorgung des embryonalen und fetalen Gewebes. Eine begrenzte (committed) hämatopoetische Zellpopulation dient als Vorläufer der primitiven Erythrozyten und der lympho-myeloiden Zellinien. Primitive Erythrocyten sind groß und gehen in die Zirkulation mit einem Zellkern. Die frühesten hämatopoetischen Vorläuferzellen werden im Zellstadium CD41⁺CD45^– bestimmt /16/.

Bisher wurde gedacht, dass die Hämatopoese sich während der Entwicklung in zwei Phasen ausbildet (primitive und definitive Erythropoese) aber einige Studien zeigen, dass dazwischen noch eine intermediäre Zellpopulation ausgebildet wird /16/.

Die definitive Hämatopoese bildet alle lympho-myeloiden Zellinien und die Erythrozyten des Erwachsenen. Die Leukozyten werden zuerst von Zellen der P-Sp (paraaortischen Splanchnopleura) und dem AGM (Aorta, Gonaden und Mesonephros) gebildet. Die von dort ausgewanderten Stammzellen sind verantwortlich für die Bildung von B- und T-Lymphozyten, Granulozyten und Natural killer (NK) cells. Diese Zellen werden ab der SSW 15 nachweisbar, die mittlere Leukozytenzahl liegt bei 0,8 × 10⁹/l, die 5. Perzentile bei 0. Ab der SSW 21 betragen die Leukozytenzahlen über 1 × 10⁹/l /17/.

15.1.5.1 Erythropoese

Die Erythropoese ist kontinuierlich zur Aufrechterhaltung des Turnovers der roten Blutzellpopulation erforderlich. Etwa 2 × 10¹¹ Retikulozyten werden täglich in die Blutbahn abgegeben nach einer Zeitspanne der Reifung und Differenzierung im Knochenmark von etwa 10 Tagen. Während dieser Zeit kommt es zu einer starken Anreicherung von Hb, das über 95 % des gesamten Proteins der roten Blutzelle ausmacht. Die Differenzierung der Erythropoese beginnt auf der Stufe der pluripotenten hämatologischen Stammzelle. Alle Nachfolgezellen haben die Fähigkeit verloren, die Erythropoese zu erneuern, nur die Zellteilung und Differenzierung ist noch möglich. Die Entwicklung der erythropoetischen Zellen im Knochenmark findet im Proliferations- und Reifungspool statt (Abb. 15.1-2 – Aufteilung der Erythropoese in einen Proliferationspool und einen Reifungspool).

15.1.5.1.1 Proliferationspool

In dieser Phase zur Entwicklung der roten Blutzelle erwirbt die Stammzelle die Potenz zur Expression von Oberflächenrezeptoren. Über diese werden die Signale von Wachstumsfaktoren, die das Überleben und die Differenzierung der Zellen bis zum funktionstüchtigen Erythrozyten regulieren, an den Zellkern weitergeleitet. Die unreifste Form der Committed erythroid progenitors ist die Burst-forming Unit erythroid (BFU-E). Die BFU-E benötigt 14 Tage und mehr bis zur Bildung eines Clusters reifer Erythroblasten. Dem Stadium der BFU-E folgt die Colony forming unit erythroid (CFU-E). Beide Vorläuferzellen haben einen Anteil von etwa 0,3 % an den kernhaltigen erythropoetischen Knochenmarkzellen. Von der CFU-E bis zur Bildung eines Clusters aus 8–64 reifen Erythroblasten bedarf es einer Zeit von 7 Tagen.

15.1.5.1.2 Reifungspool

CFU-E Zellen treten vom Proliferationspool in den Reifungspool über, reifen zu Retikulozyten, die in das Blut entlassen und dort zu Erythrozyten werden. Die Reifungsphase beginnt mit der ersten im Knochenmark zytologisch differenzierbaren Vorläuferzelle, dem Pronormoblasten. Er hat ein basophiles Zytoplasma, einen Kern mit gewöhnlich sechs Nukleolen und einen Durchmesser von 15–20 μm. Mit zunehmenden Reifungsstadium nehmen der Zelldurchmesser und die Dichte der Erythropoetin Rezeptoren ab und der zelluläre Hb-Gehalt zu. Nach Abstoßung des Kernes durch den orthochromatischen Erythroblasten wird der mit RNA-Resten belassene Retikulozyt in die Zirkulation entlassen, wo er innerhalb von 24–48 h zum Erythrozyten heranreift.

Ein wichtiges regulatives Hormon der Erythropoese ist Erythropoetin (EPO). Es verhindert die Apoptose von CFU-E-Zellen und bewirkt deren klonale Expansion. Die CFU-E hat von allen Vorläuferzellen des Differenzierungspools die höchste EPO-Rezeptordichte. Unter der Stimulation von EPO durchläuft die CFU-E noch Teilungsstufen bis zum nicht mehr teilungsfähigen orthochromatischen Erythroblasten.

Die normale rote Blutzelle erreicht eine Mean cellular hemoglobin concentration (MCHC) bis zu 360 g/l. Eine weitere Zunahme kann noch um 10–20 g/l erfolgen, wenn die Zelle Wasser oder Membran verliert, was relativ selten ist. Die Hb-Konzentration der heranreifenden roten Blutzellen reguliert die der Zelle bevorstehende Anzahl an Zellteilungen. Normalerweise erfährt der Pronormoblast vier Teilungen, so dass absolut 16 Erythrozyten resultieren.

Zur Bildung von Häm siehe Beitrag 7.1 – Eisenstoffwechsel und Eisenstoffwechsel-Störungen und Lit. /18/.

Änderungen von Volumen und Konzentration von Hb der Erythrozyten können resultieren aus:

• Eisenmangel oder einem Thalassämie Syndrom. Die zytoplasmatische Hb-Bildung ist vermindert. Nach vier Zellteilungen wird nicht die notwendige Hb-Konzentration erreicht, die dem Zellkern signalisiert, weitere Zellteilungen zu unterlassen. Es erfolgen weitere Teilungen mit zunehmender Reduzierung des Volumens.
• Vitamin B₁₂- und Folsäure-Mangel. Dadurch wird der Zellzyklus verlängert, nicht aber die Rate der zytoplasmatischen Hb-Bildung. Die Konzentration an Hb der Zelle, die dem Zellkern signalisiert mit der Zellteilung aufzuhören und die Ausstoßung des Kerns zu vollziehen, erfolgt schon früher, was weniger Teilungen und ein größeres Volumen des Erythrozyten zur Folge hat.
• Hereditäre Störungen die zur mikrozytären, normochromen Anämie führen (MCHC normal). Beispiele sind der Sphärozyt und der Keratozyt. Bei der hereditären Sphärozytose handelt es sich um eine Erkrankung mit Zellmembrandefekten, wodurch bei älteren Erythrozyten die Zellmembran verloren geht. Das zelluläre Hb und das Zellvolumen sind normal, aber der Durchmesser ist vermindert. Auf Grund des verminderten Durchmessers ist der Hämatokrit niedriger als normal, rechnerisch das MCHC erhöht und der Erythrozyt scheinbar hyperchrom. Beim Keratozyten, der durch die Einwirkung oxidativer Medikamente in vivo entsteht, gehen Zellmembran und Hb verloren. Das Hb des Erythrozyten präzipitiert unter Ausbildung von Heinz-Körperchen, ein Teil des Erythrozyten enthält weniger Hb und erscheint im Blutausstrich blass. Auch geht Zellmembran verloren.

Der alternde Erythrozyt wird vom retikuloendothelialen System der Milz durch Phagozytose aus der Blutbahn genommen. Zuvor verliert er an Volumen und Deformabilität und seine Dichte nimmt zu. Veränderungen der Zellmembran führen zu einem Verlust von Kohlenhydraten auf der Zelloberfläche.

15.1.6 Einteilung der Anämien

Die Einteilung der Anämien erfolgt auf Grund von mittlerem Volumen (MCV) und der Hb-Konzentration (MCHC) der roten Blutzelle in:

• Normozytär und normochrom.
• Makrozytär und hypochrom.
• Mikrozytär und hypochrom.
• Mikrozytär und normochrom.

Die Einteilung der Anämien kann niemals sein:

• Normozytär und hyperchrom.
• Makrozytär und hyperchrom.

15.1.6.1 Regulation der erythroiden Differenzierung

Die Produktion roter Blutzellen kann mehrfach gesteigert werden, schießt aber nicht über. Das resultiert aus einer strengen Regulation. Sie betrifft die Vorgänge Proliferation, Reifung und Überleben. Nach dem Verlust von Blut oder bei Hämolyse stimulieren der Stammzellfaktor (SCF/Kit-Ligand) und Glukokortikoide die Zellen der BFU-E zur Bildung von Kolonien in das Stadium der CFU-E. Doch haben SCF und Glukokortikoide keinen Einfluss auf das Überleben der Zellen in der CFU-E. Das wird gesichert durch Erythropoetin (EPO). Die Bildung von EPO, dem wesentlichen Faktor der Erythropoese, ist aber vom Ausmaß der Hypoxie abhängig. EPO wiederum fördert zwar die Reifung der erythroiden Vorläuferzellen von der CFU-E bis zum basophilen Erythroblasten, beeinflusst aber nicht deren Reifung und Differenzierung. Proliferation, Differenzierung und Überleben sind zwar getrennte Vorgänge, werden aber durch ein spezifisches genetisches Aktivierungs- und Repressionsprogramm gesteuert. Ein wichtiger transkriptionaler Regulator in diesem Prozess ist LIM domain-only protein 2 (LMO2). Dieses Protein wird posttranscriptional und posttranslational in den erythroiden Vorläuferzellen reguliert und trägt zur Präzision der kontrollierten Erythrozytenproduktion. Siehe weiterführend zur Erythropoese Lit. /19/.

15.1.7 Granulopoese

Die beiden phagozytischen Zellinien der granulozytären und monozytären Reihe haben eine gemeinsame Zelllinien-Vorläuferzelle, die Colony forming unit granulocyte-monocyte (CFU-GM). Colony stimulating factors (CSFs) wie der Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) und der Granulocyte macrophage-CSF (GM-CSF) stimulieren die Proliferation, Differenzierung und Reifung von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten sowie von Monozyten. Der GM-CSF hat in der Granulopoese eine vergleichbare Bedeutung wie Erythropoetin bei der Erythropoese.

Produktion und Speicherung neutrophiler Granulozyten

Nach Entwicklung aus der Stammzelle kommt es zu einer kontinuierlichen Reifung vom frühest zytologisch differenzierbaren Myeloblasten bis zum polymorphkernigen Granulozyten. Im Knochenmark reifen die Granulozyten und ihre Vorläufer in zwei Pools:

• Dem mitotischen oder Produktionspool. Er enthält Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten. Vier bis fünf Zellteilungen erfolgen vom Myeloblasten bis zum Myelozyten, was zu einer Vermehrung der Zellzahl um den Faktor 32 führt. Die Reifungszeit vom Myeloblasten zum Myelozyten beträgt 3–9 Tage. Im proliferativen Stress kann die Granulopoese um den Faktor 20 gesteigert werden.
• Dem postmitotischen Pool oder Speicherpool. Er enthält Metamyelozyten, stabkernige und segmentkernige Granulozyten. Hier finden zwar keine Zellteilungen mehr statt, aber ein ständiger Vorgang der Reifung. Bei Bedarf werden die Zellen in die Zirkulation entlassen. Normalerweise befinden sie sich 10 Tage in diesem Pool. Er enthält 15–20 fach so viele Granulozyten wie das periphere Blut.

15.1.7.1 Bildung von Granula

Die Bildung von Granula beginnt in der Reifungsstufe vom Myeloblasten zum Promyelozyten. Von hier an werden Granulaproteine bis zum Stadium des polymorphkernigen Granulozyten gebildet. Es handelt sich bei den Granula um eine Aggregation von unreifen Protein Transportvesikeln, die vom Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) ausgestülpt werden. Im TGN findet eine Auswahl statt zwischen konstitutiv gebildeten Proteinen und Proteinen die den sekretorische Weg gehen, also in die Granula gelenkt werden /20/.

15.1.7.2 Stimulation und Aktivierung der Granulopoese

Eine Leukozytose kann durch folgende Mechanismen ausgelöst werden /1, 21/:

• Demarkation; Granulozyten werden vom Randpool in den zirkulierenden Pool verschoben und bewirken eine Neutrophilie. Das geschieht durch starke körperliche Arbeit und Stimuli (Katecholamine), die den Perfusionsdruck in den Kapillaren erhöhen, den Blutfluss in Organe mit hoher Kapillardichte ablenken oder die Adhäsion der Granulozyten vermindern. Da die Demarkation lediglich eine Rückverteilung der Granulozyten bedeutet, ändert sich die zur Kontrolle der Infektabwehr notwendige Zellzahl nicht.
• Freisetzung von Leukozyten; aus dem postmitotischen Speicherpool des Knochenmarks werden innerhalb von Minuten bis Stunden stabförmige und polymorphkernige Granulozyten freigesetzt, aber es werden nicht vermehrt Zellen gebildet. Die Antwort auf ein Endotoxin oder einen infektiösen Erreger erfolgt innerhalb von Minuten.
• Linksverschiebung; wird im Blut ein erhöhtes Verhältnis Stabkerniger zu Segmentkernigen gemessen bei Präsenz oder auch Abwesenheit einer Granulozytose, so weist das auf eine verstärkte Neubildung von Granulozyten hin. Gewöhlich ist der Speicherpool vermindert. Die erhöhte Granulopoese, wie sie bei schweren Infektionen erfolgt, resultiert in einer Erhöhung der Anzahl postmitotischer Zellen 2–3 Tage nach Infektion.
• Kontinuierliche Stimulation; das ist z.B. der Fall bei einer chronischen Infektion. Die Neutrophilenzahl hat sich auf einen erhöhten Stufe von Verbrauch und Bildung einbalanciert.
• Expression des Fc-Rezeptors (CD 64) Bei ruhenden Neutrophilen ist die Expression relativ niedrig (etwa 1.000 Moleküle pro Zelle), bei Aktivierung erhöht sich die Zahl der Moleküle um den Faktor 5–10 /22/.

15.1.8 Monopoese

Die zytologisch im Knochenmark primär nachweisbare Zelle ist der Monoblast. Er differenziert zum Monozyten, wird in das Blut entlassen, zirkuliert dort mit einer Halbwertszeit von 1–3 Tagen und wandert dann in das Gewebe (pulmonal-alveolärer Makrophage, Makrophagen die Sinusoide auskleiden, Kupffer Zellen der Leber, Langerhans Zellen der Haut. Im Blut sind die Monozytenpopulationen CD14⁺CD16^– und CD14⁺CD16⁺ nachweisbar /23/.

Cluster of differentiation 64 (CD64)

Das Membran-Glykoprotein CD64 (Fc-gamma Rezeptor 1) ist ein Protein der Makrophagen. CD64 bindet monomere Antikörper der Klasse IgG mit hoher Affinität. Die Behandlung von polymorphkernigen Granulozyten mit Interferon (IFN) gamma kann eine CD64 Expression der Granulozyten induzieren. Einige Autoren /35/ empfehlen das Monitoring von CD64 als einen prognostischen Marker beim septischen Schock. Dabei soll ein Abfall von CD64 ein wertvoller Indikator zur Verlaufsbeurteilung des septischen Schocks sein. In den ersten 48 Stunden nach Einlieferung auf die Intensivstation soll ein Abfall des CD64 Hilfestellung leisten zur Vorhersage der Prognose des septischen Schocks.

15.1.9 Megakaryopoese

Die Megakaryopoese entwickelt sich aus committed Vorläuferzellen, der Colony forming unit megakaryocyte (CFU-MK). Es handelt sich um eine heterogene Gruppe von Zellen mit der Fähigkeit zu proliferieren. Ab einem bestimmten Stadium hören die CFU-MK auf zu proliferieren und beginnen mit der Endomitose /24/. In diesem Stadium sind sie Megaloblasten oder unreife Megakaryozyten. Der Vorgang der Endomitose umfasst die DNA Replikation ohne Zellteilung und es bildet sich eine polyploide Zelle mit einem einzelnen vielfach gelappten Kern /25/. Die Replikation geschieht in der Regel dreimal, so dass der reife Megakaryozyt eine Ploidie von 16 hat, die aber variabel ist und bis zu 256 gehen kann.

Reifende Megakaryozyten erwerben die Kompetenz Thrombozyten zu bilden. Das geschieht durch /24/:

• Heraufregulierung von zytoskelettalen, membranösen und regulatorischen Proteinen.
• Anhäufung von Ribosomen, α-Granula und dichten Granula.
• Differenzierung in eine große polyploide Zelle mit einem komplexen System zytoplasmatischer Plättchenareale von abgrenzenden Membranen (Demarcation membrane system, DMS). Das DMS markiert präformierte Regionen der Plättchen, auch als Proplättchen bezeichnet.
• In den Sinusoiden des Knochenmarks sollen durch Scherkräfte die Proplättchen vom Zytoplasma abgetrennt werden. Ein Megakaryozyt kann 1.000–5.000 Plättchen freisetzen. Die Abgabe von Proplättchen ist für den Megakaryozyten ein präterminaler Vorgang, denn der Kern wird dann von Makrophagen phagozytiert.

15.1.9.1 Thrombopoetin (TPO)

Die Megakaryopoese und die Bildung von Thrombozyten wird durch TPO reguliert, aber auch andere Zytokine wie IL-6 und IL-11 spielen eine Rolle /26/. Letztere ermöglichen es dem Megakaryozyten sich an Orten zu adaptieren, die eine Reifung und Thombozytenbildung zulassen. Die Wirkung von TPO an Megakaryozyten und Thrombozyten wird durch den Receptor c-Mpl (CD110) vermittelt, der aber auf den Thrombozyten nur in niedriger Zahl vorhanden ist. TPO wird in konstanter Menge von der Leber gebildet und seine Konzentration wird zum Teil durch die Bindung an seinen thrombozytären Rezeptor und somit auch von der Anzahl der Thrombozyten reguliert. Ist die Zahl der Thrombozyten im Blut hoch, bindet viel TPO an die c-Mpl und wenig an die Megakaryozyten, die Folge ist eine Herunterregulierung der Megakaryopoese. Ist umgekehrt die Thrombozytenzahl niedrig, dann ist die Konzentration von im Plasma hoch und die Megakaryopoese wird stimuliert.

15.1.9.2 Von Willebrand-Faktor-Rezeptor

Der Rezeptor GPIb/V/IX ist ein wichtiger Regulator der Bildungvon Proplättchen. Bei der Immunthrombozytopenie gebildete Autoantikörper hemmen die Freisetzung von Proplättchen.

Bernard-Soulier-Syndrom: Bei dieser autosomal rezessiven vererbten Makrothrombozytopenie sind die definierten Plättchenareale, die durch die DMS markiert sind, größer als normal.

15.1.10 Hämatopoetische Balance

Bei normaler Hämatopoese besteht ein Gleichgewicht zwischen der Masse der Zellen der jeweiligen Zelllinie in der Blutbahn bzw. in den Geweben und ihrer Bildung im Knochenmark. Es gibt drei wesentliche Variationen, die dieses Gleichgewicht stören:

• Hypoproliferation des Marks oder einer bzw. mehrerer Zelllinien. Hier ist entweder das Mark unfähig, auf die verstärkte stimulatorische Wirkung von Wachstumsfaktoren adäquat zu reagieren (intrinsische Markstörung) oder es fehlen wichtige Substanzen zur Bildung funktionstüchtiger Zellen, z.B. Eisenmangel.
• Ineffektivität einer oder mehrerer Zelllinien. Die Hämatopoese ist hypoproliferativ auf Grund der hemmenden Wirkung inflammatorischer Zytokine. Das ist der Fall bei der Anämie chronischer Erkrankungen.
• Hyperproliferativität des Marks bzw. einer oder mehrerer Zelllinien. Es resultiert eine verstärkte Antwort der Hämatopoese auf die Anforderung von Zellen. Die kompensatorische Kapazität des Marks reicht jedoch nicht aus die Anforderungen zu erfüllen. Ein Beispiel ist die Thrombozytopenie bei disseminierter intravasaler Gerinnung.

15.1.10.1 Primäre Störungen der Hämatopoese

Es liegt die pathogene Veränderung einer oder mehrerer hämatopoetischer Zelllinien vor, z. B. bei Leukämie, Thalassämie oder Panzytopenie. Die Differentialdiagnostik der Panzytopenie ist aufgeführt in Tab. 15.1-3 – Differentialdiagnose der Panzytopenie.

15.1.10.2 Sekundäre Störungen der Hämatopoese

Die Hämatopoese wird in ihrer Funktion gestört und ist kompromittiert, die Folge ist eine verminderte oder fehlerhafte Bildung von Blutzellen oder die Hämatopoese antwortet reaktiv mit einer gesteigerten Synthese und der zusätzlichen Ausschüttung von Vorstufen. Störungen können beruhen auf:

• Dem den Mangel wichtiger Substanzen (Eisen, Folsäure, Vitamin B₁₂, Vitamin B₆).
• Einer Mitreaktion (Granulozytose, Granulozytopenie, Thrombozytose, Thrombozytopenie, Anämie) bei systemischer Erkrankung des Organismus.
• Einer reaktiven Reaktion (Polyglobulie in Höhenlagen über 3.000 m).
• Hämatopoetischen Systemerkrankungen wie Leukämie, Polyzythämie oder Thrombozythämie.

Die sekundären Störungen der Hämatopoese sind oft komplexer Natur und erfordern neben dem Blutbild spezielle hämatologische und biochemische Tests zur Abklärung.

15.1.11 Splenektomie

Die Thromboembolie und ein pulmonaler Hochdruck sind häufige Komplikationen der Splenektomie (Odds Ratio 4,08) bei Patienten mit Transfusions-abhängiger Thalassämie. Die Thalassämien sind kongenitale, autosomal rezessive Hämoglobinopathien. Die Patienten bilden nicht genügend Hämoglobin und können nur mittels der Transfusion von Erythrozyten überleben. Die zwei primären Typen der Erkrankung sind die alpha-Thalassämie und die beta-Thalassämie. Sie unterscheiden sich dadurch, dass bei ersterer die alpha-Globinketten des Hämoglobins teilweise oder komplett fehlen und bei letzterer die beta-Globinketten.

Die Thalassämien werden folgendermaßen eingeteilt /36/:

• Beta-Thalassämia minor: Asymptomatische mikrozytäre Anämie.
• Thalassämie-Syndrom: Kriterien der Zuordnung sind die klinischen Beschwerden und der Bedarf an Erythrozytentransfusionen, denn die Patienten müssen einen prätransfusionellen Hämoglobinwert von 95–105 g/l, der die Erythropoese bremst, aufrecht erhalten. Trotz therapeutischer Fortschritte (Luspaterecpt) bleibt bei einigen Patienten die Splenektomie das Mittel der Wahl. Die Splenektomie führt jedoch zu längerfristigen Komplikationen wie z.B. einer Thromboembolie und von Infektionen. Normalerweise entfernt die Milz alte und geschädigte Erythrozyten und Thrombozyten aus der Zirkulation. Wird sie entfernt, bleiben negativ geladene Erythrozyten und hyperaktive Thrombozyten in der Zirkulation. Dort bewirken sie bei den Patienten mit Thalassämiesyndrom einen hyperkoagulabilen Status durch Aktivierung des Gerinnungssystems.

15.1.12 Untersuchungen der Hämatopoese

Zur Untersuchung der Hämatopoese werden basale Untersuchungen von funktionellen Untersuchungen unterschieden. Die basalen Untersuchungen sind beschreibende Größen des Zustandes, z.B. der Hb-Wert oder die Leukozytenzahl. Funktionelle Untersuchungen beschreiben die hämatopoetische Funktion als Antwort auf eine Kompromittierung, z.B. Retikulozytose bei Blutverlust oder Linksverschiebung der Granulopoese bei Sepsis.

Hämatologische Basisuntersuchungen zur Erkennung von Störungen der Hämatopoese sind die mit Hämatologie-Analyzern durchführbaren Methoden:

• Komplette Blutzellzählung (Complete blood count).
• Partielle oder komplette Differenzierung der Leukozyten.
• Retikulozytenzählung. Einige Analyzer messen zusätzlich auch Retikulozyten-Indices wie den Gehalt an Hb der Retikulozyten (CHr, Ret-He), den RNA-Gehalt der Retikulozyten und den Anteil hypochromer roter Blutzellen (%HYPO).
• Blutausstrich Untersuchung. Sie ist ergänzend erforderlich bei symptomatischen Patienten und wenn am Hämatologie-Analyzer eine Signalgebung für das Vorhandensein atypischer Zellen erfolgt. Wichtige hämatologische Untersuchungen zeigt Tab. 15.1-2 – Hämatologische Untersuchungen zur Beurteilung der Hämatopoese.
• Bestimmung von Oberflächenmarkern der Blutzellen mit spezifischen Antikörpern (Immunphänotypisierung) durch Fluoreszenz aktiviertes Zellsorting (FACS).

15.1.13 Hämatologische Basistests

• Komplettes Blutbild
• Teilweise oder komplette Differenzierung der Leukozyten.
• Retikulozytenzählung und Bestimmung des Gehaltes an Hämoglobin.
• Blutausstrich. Der Test ist erforderlich als zusätzliche Untersuchung bei symptomatischen Patienten und wenn der Hämatologieanalyzer ein Signal für die Präsenz atypischer Zellen anzeigt Wichtige Tests sind aufgeführt in Tab. 15.1-2 – Hämatologische Untersuchungen zur Beurteilung der Hämatopoese.
• Flow zytometrische Messung von Oberflächenmarkern der Blutzellen mittels spezifischer Antikörper.

15.1.14 Dermatosen bei hämatologischen Neoplasien

Konsensus Manifestationen hämatologischer Neoplasien unterstützen das Konzept molekularer Defekte bei spezifischen malignen hämatologischen Neoplasien /37/.

Neutrophile oder eosinophile Dermatosen werden aufgrund ihres klinisch-pathologischen Bildes in eine der folgenden vier Kategorien klassifiziert:

• Superficial/epidermal.
• Dermal.
• Tiefe Form.
• Gemischt, das bedeutet syndromische neutrophile Dermatosen.

Neutrophile und eosinophile Dermatosen, die bei einer hämatologischen Neoplasie auftreten, repräsentieren eine heterogene Gruppe von Hautläsionen, die entweder gleichzeitig mit einer hämatologischen Neoplasie auftreten oder davon unabhängig sind.

Die vermutete Pathophysiologie der Dermatosen bei hämatologischen Neoplasien ist, dass die leukämischen Zellen eine systemische Entzündung fördern und somit das klinisch-pathologische Bild des Sweet-Syndroms, einer seltenen neutrophilen Dermatose, darstellen.

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15.2 Erythrozyten (Zellzahl und -indices)

Lothar Thomas

Die Bestimmung der Erythrozytenzahl, ist eine basale Untersuchung zur Erfassung von Störungen der Erythropoese. Sie ist Bestandteil des Blutbildes und wird gemeinsam mit der Konzentration von Hämoglobin (Hb), dem mittleren Zellvolumen (MCV) und der Verteilungsbreite der Erythrozyten(Red cell distribution width, RDW) direkt von den Hämatologie Analyzern gemessen.

Aus der Messung von Erythrozytenzahl, MCV und Konzentration von Hb leiten Hämatologie-Analyzer rechnerisch folgende Parameter ab:

• Hämatokrit (Zellpackungsvolumen).
• Mittlerer zellulärer Hämoglobingehalt (MCH).
• Mittlere zelluläre Konzentration von Hb (MCHC).

MCV, MCH und MCHC werden als Erythrozytenindices bezeichnet und beschreiben durch Volumen, Hb Gehalt Hb Konzentration und Veränderungen der Größe und Hämoglobinisierung die roten Blutzellen. Bei Anämien ist die Bestimmung des Anteils hypochromer roter Blutzellen (%HYPO) ein empfindlicherer Marker als die Erythrozytenindices.

15.2.1 Erythrozytenzahl

Die wesentliche Bedeutung der Erythrozytenzahl Messung, auch als Red blood cell count (RBC) bezeichnet, liegt in der Bestimmung abgeleiteter Parameter wie dem Hämatokrit und den Erythrozytenindices.

15.2.1.1 Indikation

In der Kombination mit den Erythrozytenindices:

• Zur Diagnostik und Differenzierung von Anämien.
• Diagnostik von Polyzythämien und Polyglobulien.

15.2.1.2 Bestimmungsmethode

Die analytischen Methoden der Hämatologie Analyzer sind Variationen der Flowzytometrie und Anwendung der elektrischen Widerstands- und/oder Impedanzmessung. Vielfach sind die Lasertechnologie als Lichtquelle und zytochemische Methoden integriert /1/.

15.2.1.2.1 Automatisiertes komplettes Blutbild

Prinzip: Das automatisierte komplette Blutbild (complete blood count; CBC) beginnt mit der Aspiration einer spezifischen Menge gut durchmischten Blutes durch den Hämatologie-Analysator. Die Probe wird aliquotiert und die Aliquots mit Verdünnungs- und Stabilisierungslösungen zur Bestimmung von Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten versetzt sowie mit einem Reagenz zur Lyse der Erythrozyten. Die aliquotierten Proben werden kanalisiert /2/:

• In eine Küvette zur spektrophometrischen Bestimmung von Hb, das entweder direkt spektrophotometrisch gemessen wird oder unter Anwendung der Cyanmethämoglobin-Methode.
• In spezifische Zählkammern, Flusszellen oder Bäder zur Bestimmung der Zellzahl und der Zellgröße. Die meisten Analyzer wenden die Streulicht Methodik an, andere die elektrische Impedanz Technologie.

Streulicht Technologie

Ein verdünntes Blutvolumen wird hydrodynamisch in einer Flusszelle fokussiert, die von einen engen Lichtstrahl durchleuchtet wird. Wenn eine Zelle den Lichtstrahl passiert wird das Licht gestreut. Das von jeder Zelle gestreute Licht wird von einem Photodetektor erfasst und in einen elektrischen Impuls umgewandelt, dessen Amplitude proportional dem Zellvolumen ist. Die Anzahl der generierten Impulse ist proportional zur Zellzahl. Die Messung des Streulichts erfolgt in den Winkeln von 2,2–3,5 Grad und von 5–15 Grad in Vorwärtsrichtung. Somit erfolgt gleichzeitig die Messung der Größe und des Hb-Gehalts des Erythrozyten /2/.

• Die Zahl der Erythrozyt und Thrombozyten wird durch Impulse bestimmt, die im Bereich von 2–20 fl (Thrombozyten) und von 30–180 fl (Erythrozyten) liegen.
• MCV und MCH werden direkt gemessen und ein Erythrogramm erstellt (Abb. 15.2-1 – Erythrogramm).
• Hämatokrit und MCHC werden über Formeln berechnet.
• Die Leukozytenzahl wird aus einer Suspension bestimmt, in der die Erythrozyten lysiert sind. Die Leukozyten werden fixiert oder vermittels des Gehaltes ihrer Enzyme, z.B. Myeloperoxidase, angefärbt. Die so behandelte Suspension wird in einer Flusszelle hydrodynamisch fokussiert. Passiert eine Zelle den Lichtweg wird das Licht gestreut und das Streulicht und die Lichtabsorption gemessen. Aus den ermittelten Daten ergibt sich die Zellzahl und einem zweidimensionalen Zytogramm wird die Zelldifferenzierung dargestellt. Siehe Abb. 15.2-2 – Erythrozytenverteilungsbreite.

Impedanz-Technologie

Eine spezifische Menge verdünnten Blutes fließt durch eine Apertur, die zwischen zwei Elektroden gelegen ist. Zellen durchfließen die Apertur und verursachen einen kurzen Anstieg der Impedanz, die in Form eines elektrischen Impulses registriert wird. Die Pulsamplitude ist proportional dem Zellvolumen und die Anzahl der Pulse proportional der Zellzahl /2/.

Die Zahl an Erythozyten und Thrombozyten wird aus der selben Zellsuspension ermittelt, aber getrennt durch Impulse der Zellgrößen (Thombozyten 2–20 fl, Erythrozyten > 36 fl).

Hämatokrit, MCH und MCHC werden über Formeln kalkuliert.

Die Verteilungsbreite derErythrozyten wird bestimmt (Abb. 15.2-2 – Erythrozytenverteilungsbreite).

Die Leukozytenzahl, wird in einer Zellsuspension bestimmt, in der die Erythrozyten lysiert sind, anhand der Impulse im Bereich > 35 fl. Die Differenzierung der Leukozyten erfolgt elektronisch aufgrund der elektrischen Pulse, die sie generieren. Unter Anwendung eines spezifischen Reagenzes schrumpfen die Leukozyten unterschiedlich und die entstandenen Zelltypen werden anhand eines Histogramms differenziert /1/.

15.2.1.3 Untersuchungsmaterial

• EDTA-Blut: 1 ml
• Kapillarblut (Heparin) aus Fingerbeere oder Ferse.

15.2.1.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /2, 3, 4/ und Tab. 15.2-1 – Referenzbereiche der Erythrozytenzahl.

15.2.1.5 Bewertung

Die Erythrozytenzahl ist als Einzelparameter diagnostisch wenig aussagekräftig. Erst in Kombination mit dem Hämatokrit kann, bezugnehmend auf die Erythrozytenmasse des Körpers, eine Unterscheidung in Erythrozytopenie, Erythrozytose oder normale Erythrozytenzahl erfolgen. Ursache der geringen Aussagekraft der Erythrozytenzahl zur Diagnostik einer Anämie oder Polyzythämie sind Änderungen des Plasmavolumens, die direkt die Erythrozytenzahl beeinflussen. Das ist z.B. der Fall bei Erhöhung des Plasmavolumens in der Schwangerschaft oder bei Störungen des Wasser- und Elektrolythaushalts. Abhängig von der Literaturangabe werden für Gesunde angeben /6/:

• Als Obergrenze der Erythrozytenmasse des Organismus, bestimmt mit radioaktiv markierten Eigenerythrozyten, 30–36 ml/kg KG.
• Als Untergrenze des Plasmavolumens, bestimmt mit radioaktiv markiertem Albumin, 33–39 ml/kg KG.

Für kachektische und fettsüchtige Personen gelten diese Angaben nicht.

Die Erythrozytenzahl dient in der Routinediagnostik im wesentlichen der Überprüfung der Plausibilität des roten Blutbildes. Denn nach der 3er-Regel gilt bei normalem Blutbild und bei normozytärer, normochromer Anämie folgende Beziehung:

Erythrozytenzahl (Mio/μl) × 3 = Hb-Wert (g/dl) × 3 = Hämatokritwert (%)

Die 3er Regel geht von der Annahme aus, dass sich die Konzentration des Hb linear mit dem Erythrozytenvolumen verändert, was aber nur bei gesunden Personen der Fall ist. Abweichungen von der 3er Regel treten bei pathologischen Ereignissen auf, z.B.:

• Der Eisenmangelanämie, da hypochrome Erythrozyten sich stärker verformen als normochrome und das Erythrozytenvolumen und somit der Hämatokrit bei der Impedanzmessung zu niedrig bestimmt wird.
• Dem β-Thalassämie Syndrom. Diese Patienten haben gewöhnlich eine milde Anämie, eine erhöhte Zahl roter Blutzellen, einen normalen oder leicht erniedrigten Hämatokrit und ein erniedrigtes MCV.
• Einer DNA Synthesestörung auf Grund von Folsäure- oder Vitamin B₁₂-Mangel, Alkoholismus oder durch eine chronische Lebererkrankung bedingte Anämie mit makrozytären roten Blutzellen.
• Einer hereditären Sphärozytose bei erhöhter Anzahl roter Blutzellen.
• Der Störung der Hb-Bestimmung durch Hyperlipidämie.
• Von Kälteagglutininen in der Probe. Die Erythrozytenzahl wird zu niedrig bestimmt.
• Durch eine starke Hämolyse der Probe; dadurch ist die Erythrozytenzahl inadäquat niedrig.

15.2.1.5.1 Anämie

Eine Anämie, z.B. durch nicht Volumen kompensierten akuten Blutverlust, ist in den ersten 24 h kaum an einem Abfall der Erythrozytenzahl oder des Hämatokrits erkennbar, da Erythrozyten und Plasma im gleichen Verhältnis verloren gehen. Erst nach 12–16 h kommt es durch eine Umverteilung des Körperwassers zwischen Extra- und Intrazellulärraum zum Abfall der Erythrozytenzahl.

Bei chronischer Anämie ist das Blutvolumen in der Regel normal, d.h. entsprechend einer Abnahme der Erythrozytenmasse hat das Plasmavolumen zugenommen. Die Erythrozytenzahl und der Hämatokrit sind gewöhnlich vermindert. Es kann aber bei ausgeprägter Mikrozytose, z.B. bei schwerer Eisenmangelanämie oder dem Thalassämie-Syndrom, die Erythrozytenzahl im Referenzbereich liegen oder wie bei der hereditären Sphärozytose sogar erhöht sein. Siehe auch weiterführend Beitrag 15.4 – Hämatokrit.

15.2.1.5.2 Anämie bei soliden Tumoren unter Chemotherapie

Die Anwendung von Erythropoetin stimulierenden Agentien (ESAs) zum Management einer Anämie unter Chemotherapie hebt den Hämoglobinwert an und reduziert die Gabe von Erythrozytenkonzentraten. Die ESA-Therapie kann aber auch Thrombosen verursachen. Die Empfehlungen der ESMO und der ASCO/ASH sind demzufolge /27, 28/:

• ESMO: Die Therapie mit ESA wird bei Patienten mit einer Anämie empfohlen, wenn der Hämoglobinwert unter 10 g/dL beträgt.
• ASCO/ASH: Eine ESA Therapie wird Tumorpatienten mit einer Anämie angeboten, wenn der Hämoglobinwert unter 10 g/dL beträgt und die Therapie nicht kurativ ist.

15.2.1.5.3 Polyzythämie

Zustände mit einer Erhöhung der Zahl an roten Blutzellen werden als Polyzythämie, Erythrozytose und im deutschen Sprachgebrauch auch als Polyglobulie bezeichnet. Unterschieden wird die absolute Polyzythämie, die auf einer Expansion der Erythropoese im Knochenmark beruht, von der relativen, die durch eine Verminderung des Plasmavolumens bedingt ist. Polyzythämien können angeboren oder erworben sein /6/. Bei der sekundären Polyzythämie resultiert die vermehrte Erythrozytenbildung aus einer erhöhten Bildung von Erythropoetin bei hypoxischen Patienten. Die angeborene Polyzythämie ist selten und geht bei Neugeborenen mit einem Hämatokrit über 0,65 und einem Hyperviskositäts Syndrom einher. Eine Polyzythämie, die nicht mit der Polycythämia vera verwechselt werden darf, liegt vor, wenn die Erythrozytenmasse mehr als 25 % des erwarteten Werts beträgt. Erhöht sind neben der Erythrozytenzahl der Hb-Wert und der Hämatokrit. Detaillierte Ausführungen zur Polyzythämie siehe Beitrag 15.4. Leichte Polyzythämien, die aus einer Vermehrung der roten Blutzellmasse und einer Verminderung des Plasmavolumens resultieren werden bei Rauchern beobachtet.

15.2.1.6 Hinweise und Störungen

Antikoagulanz

Empfohlen wird EDTA 1,5–1,8 mg/ml Blut /7/. Von den EDTA Salzen ist K₃EDTA das am wenigsten geeignete. Von den verwendbaren EDTA Salzen führt es mit Anstieg der Konzentration von EDTA zur stärksten Schrumpfung der Erythrozyten und bewirkt die größte Abnahme des MCV beim Stehenlassen des Blutes bis zur Messung. Erhöhung der Konzentration von EDTA führt generell zu einer Abnahme des MCV.

Probennahme

Bei der Blutentnahme in sitzender Körperhaltung nach zuvor mindestens 15 min Stehen ist die Erythrozytenzahl um 5–10 % höher als nach vorherigem mindestens 15 min Liegen /7/. Nach einer Stauzeit von mehr als 2 min resultiert ein Anstieg der Zellzahl von im Mittel 10 %, was etwa das 1–2 fache der maximal zulässigen Impräzision ausmacht. Blutentnahme unmittelbar nach körperlicher Leistung geht mit einer Erhöhung der Erythrozytenzahl von etwa 10 % einher. Alle die genannten Veränderungen sind Ausdruck einer Hämokonzentration. Im Vergleich zur venösen Blutentnahme liegen bei kapillärer Entnahme die Erythrozytenzahlen bei Erwachsenen um 1,8 % und bei Kindern um 6 % höher /8/.

Störfaktoren

Kälteagglutinine: Hochtitrige Kälteagglutinine führen bei Stehen der Probe bei Zimmertemperatur zur Ausbildung von Erythrozytenagglutinaten. Bei der Zählung mit Hämatologie-Analyzern werden die Erythrozyten falsch niedrig, das MCH (Hb/Erythrozytenzahl) zu hoch bestimmt. Der berechnete Hämatokrit (Erythrozytenzahl × MCV) ist folglich zu niedrig und die MCHC (Hb-Wert/Hämatokrit) zu hoch /9/.

Leukozyten: Diese werden bei der Erythrozytenzählung mitgezählt. Das ist zu vernachlässigen, so lange keine hohen Leukozytenzahlen vorliegen wie bei der chronisch myeloischen Leukämie. Die Leukozytenzahl muss dann subtrahiert werden.

Thrombozyten: Große Thrombozyten, z.B. bei essentieller Thrombozythämie, werden bei der Erythrozytenzählung miterfasst.

Intraindividuelle Variation

Innerhalb von 24 h 4 %, von Tag zu Tag 5,8 %, von Monat zu Monat 5,0 % /10/.

Stabilität

Bei Raumtemperatur (20 °C) und 4 °C 3 Tage, bei 37 °C 36 h, danach kontinuierlicher Abfall /11/.

15.2.2 MCV, MCH, MCHC, RDW, %HYPO

Die Beurteilung der Erythrozyten einer Probe zur Differenzierung von Anämien erfolgt durch die Messung oder Berechnung der Erythrozyten Indices /6/:

• MCV (Mean cell volume; mittleres Zellvolumen). Das MCV wird in femtoliter (fl = 10^–15 l) ausgedrückt und entweder vom Hämatologie-Analyzer direkt gemessen oder wie folgt berechnet:

• MCH (Mean cellular hemoglobin; mittlerer zellulärer Hämoglobingehalt) des Erythrozyten. Der MCH wird ausgedrückt in pg/Erythrozyt und vom Hämatologie-Analyzer nach folgender Gleichung berechnet:

• MCHC (Mean cellular hemoglobin concentration; mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration). Die MCHC wird in g/dl oder g/l roter Blutzellen ausgedrückt und wie folgt berechnet:

• RDW (Red cell distribution width; Erythrozyten­verteilungs­breite). Graphisch dargestellt wird die Verteilung des MCV einer Probe (Abb. 15.2-2 – Erythro­zyten­verteilungs­breite).
• Auch wird von einigen Hämatologie-Analyzern ein Erythrogramm erstellt, d.h. der Hämoglobingehalt der Erythrozyten gegen ihr Volumen aufgetragen (Abb. 15.2-1 – Erythrogramm).
• %HYPO, Anteil der hypochromen roten Blutzellen (RBC) mit einer Hb-Konzentration unter 280 g/l, angeben in % der RBC.

Auf Grund des MCV wird eine Anämie in normo-, mikro- und makrozytär klassifiziert und an Hand des MCHC in normo- und hypochrom. Hyperchrome Anämien gibt es nicht.

15.2.2.1 Indikation

• Differenzierung und therapeutische Beurteilung von Anämien.
• Früherkennung von Anämien (%HYPO).

15.2.2.2 Bestimmungsmethode

MCV

Siehe Beitrag 15.2.1.2 – Bestimmungsmethode.

Anteil der hypochromen Erythrozyten (%HYPO)

Die Bestimmung kann nur an bestimmten Hämatologie-Analyzern erfolgen. Jede rote Blutzelle wird zur Kugel transformiert, vermittels Laser Technologie Volumen (V), die Konzentration von Hb (CHC) bestimmt und der Hb Gehalt (CH) in pg berechnet nach der Gleichung: CH = CHC/V. Der Anteil der roten Blutzellen mit einem CH unter 28 pg wird registriert und als %HYPO angegeben. Ebenfalls wird der Anteil der mikrozytären roten Blutzellen (%MIKRO) und der makrozytären roten Blutzellen (%MAKRO) ermittelt /12/. Die %HYPO haben in der Beurteilung des Eisenstoffwechsels eine Bedeutung erlangt.

15.2.2.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 1 ml

15.2.2.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /2, 3, 5, 13, 14/ und Tab. 15.2-2 – Referenzbereiche der Erythrozytenindices.

15.2.2.5 Bewertung

Die Erythrozytenindices MCV, MCH, MCHC und RDW sind bedeutsam für /15/:

• Die Klassifizierung von Anämien.
• Die Erkennung einer latenten Anämie.
• Die ätiologische Abklärung von Anämien.

Das MCV sollte gemeinsam mit der RDW bewertet werden. So spricht bei mikrozytärer Anämie eine erhöhte RDW für eine Eisenmangelanämie, während eine normale RDW eher auf ein Thalassämie-Syndrom hinweist.

15.2.2.5.1 MCV

Die Bestimmung des MCV dient der diagnostisch wichtigen Einteilung der Anämien in normo-, mikro- und makrozytäre Formen. Beachtet werden muss, dass das MCV ein gemittelter Wert ist und kleine Populationen von mikro- oder makrozytären Erythrozyten nicht erkannt werden können.

Das MCV ist abhängig vom Gehalt an Hb und der Hydratation des Erythrozyten, d.h. der Osmolalität im Plasma. Stark hypochrome Erythrozyten unterliegen einer stärkeren Verformung als die mit normalem Hb Gehalt und der MCV wird somit zu niedrig bestimmt.

Normales MCV: Das MCV ist normal, wenn:

• Die Mehrzahl der Erythrozyten ein Zellvolumen im Referenzbereich hat, die RDW ist dann ≤ 15 %.
• Große und kleine Erythrozyten vorliegen, die RDW ist dann über 15 %. Eine solche Situation ist z.B. gegeben bei der immunhämolytischen Anämie (IHA) oder der mikro angiopathischen hämolytischen Anämie. Bei der IHA liegen zum einen Mikrosphärozyten vor, zum anderen Retikulozyten und polychromatische Erythrozyten mit hohem Zellvolumen. Das MCV kann als Mittel beider Zellpopulationen normal sein. Bei vergrößerter RDW sollte ein Blutausstrich angelegt werden, der in diesem Fall Anisozytose, Polychromasie und Mikrozytose zeigt. Bei disseminierter intravasaler Gerinnung können Fragmentozyten, die als kleine Erythrozyten gezählt werden und große polychromatische Erythrozyten vorliegen, das MCV aber innerhalb des Referenzbereichs sein.

Erniedrigtes MCV: Mikrozytose tritt bei Eisenmangel, Vitamin B₆-Mangel und Thalassämien auf. Häufigste Ursache ist der Eisenmangel. Beim Eisenmangel durchläuft die Erythropoese mehr Zellteilungen und mit jeder Teilung wird das Volumen des Erythrozyten kleiner. Die RDW ist über 15 %, im Blutausstrich liegen Mikrozytose und Anisozytose vor. Die Verbreiterung der RDW ist ein frühes Zeichen der Eisenmangelanämie.

Die hereditäre sideroblastische Anämie ist eine seltene mikrozytäre Anämie mit oft deutlich vermindertem MCV unter 60 fl. Oft wird sie als Thalassämie, insbesondere Thalassämia intermedia, fehl interpretiert.

Erhöhtes MCV: Eine Makrozytose tritt bei folgenden Zuständen auf:

• Regenerativ bei Behandlung einer Eisenmangelanämie, bedingt durch eine Retikulozytose.
• Chronischer Lebererkrankung. Etwa 20 % der Patienten mit nicht alkoholischer Lebererkrankung haben eine Makrozytose, ohne dass dies auf einen Folsäure- oder Vitamin B₁₂-Mangel oder eine Retikulozytose durch Blutung zurückgeführt werden kann.
• Alkoholismus. Der mittlere Anstieg liegt etwa 5 fl, d.h. 5–10 % über dem Mittelwert von Kontrollpersonen. Als Entscheidungsgrenze zur Beurteilung einer Alkoholabstinenz wird ein Grenzwert von ≥ 94 fl angesehen. Eine Normalisierung des MCV nach Alkoholabstinenz ist in der Regel nach 3–4 Monaten zu erwarten. Als Kontrollparameter des Alkoholentzugs ist das MCV auf Grund seiner langen Halbwertszeit ungeeignet /16/.
• Vitamin B₁₂- oder Folatmangel. Die DNA-Synthese ist vermindert und die Erythropoese durchläuft weniger Zellteilungen, deshalb haben die Erythrozyten ein größeres Volumen. Die Synthese von Hb ist nicht beeinträchtigt. Ein erhöhtes MCV kann benutzt werden, um die Diagnose eines Vitamin B₁₂- oder Folsäuremangels wahrscheinlicher zu machen, ein normales MCV schließt aber den Mangel nicht aus /17/. Wesentliche Ursache ist, dass etwa 20 % der Patienten mit Vitaminmangel auch einen Eisenmangel haben.
• Retikulozytose. Retikulozyten haben, abhängig von der Regenerativität der Erythropoese, ein 3–10 % größeres Volumen als Erythrozyten. Da Retikulozyten bei der Bestimmung des MCV mit erfasst werden, ist bei einer Retikulozytose ab etwa 15 % mit einem Anstieg des MCV zu rechnen.
• Myelodysplastisches Syndrom, hereditäre Stomatozytose.

15.2.2.5.2 MCH

In der Regel wird das Volumen der Erythrozyten mit 95 % der maximal möglichen Menge an Hb ausgestattet und somit ist bei der Mehrzahl der Anämien das MCH mit dem MCV korreliert. Mikrozytäre Anämien entsprechen demzufolge hypochromen, normozytäre den normochromen Anämien.

Normales MCH: Ist typisch für den Gesunden, aber auch häufig:

• Bei der Anämie chronischer Erkrankungen, z.B. Entzündungen, Infektionen, malignen Tumoren.
• Bei der Anämie bedingt durch chronische Nierenerkrankung und bei hämolytischer Anämie.

Niedriges MCH: Zeigt eine Verminderung des Hb-Gehalts der Erythrozyten an und ist z.B. typisch für Eisen-, Kupfer- und Vitamin B₆-Mangel. Im Blutausstrich weisen hypochrome Erythrozyten auf eine Eisen defiziente Erythropoese hin.

Erhöhtes MCH: Zustände mit Vermehrung des MCH erhöhen auch das MCV. Das betrifft makrozytäre Anämien wie z.B. Folat- und Vitamin B₁₂-Mangel. Bei der Regeneration einer Eisenmangelanämie unter Therapie kann es bei starker Retikulozytose zu einer Erhöhung des MCH kommen.

15.2.2.5.3 MCHC

Die MCHC ist ein Maß der Konzentration an Hb der Erythrozyten. Auf Grund des gleichsinnigen Verhaltens von Erythrozytenvolumen und dem Gehalt an Hb des einzelnen Erythrozyten bleibt der Wert des MCHC bei vielen Veränderungen des roten Blutbildes konstant. Abnormalitäten des Blutbildes, bedingt durch die Erythrozytenzählung, die Hb-Bestimmung, die Bestimmung von MCV oder des Hämatokrits führen zu einer fehlerhaften Kalkulation des MCHC.

Normale MCHC: Bei vielen Anämieformen ist die MCHC im Referenzbereich. Das ist nicht selten auch der Fall bei Anämien mit Eisen defizienter Erythropoese und starker Hypochromie. Da hypochrome Erythrozyten sich stark verformen werden sie mit der Impedanzmethode in ihrem Volumen noch kleiner bestimmt als sie schon sind, mit der Folge, dass eine normale MCHC gemessen wird. Bei der Streulichtmethode, bei der gekugelte Erythrozyten gemessen werden, ist der ermittelte CHCM jedoch richtig, da das Zellvolumen in seiner realen Größe erfasst wird.

Niedrige MCHC: Kann bei Mangelanämien vorkommen, z.B. Eisen-, Kupfer-, Vitamin B₆-Mangel. Wird fälschlicherweise ein zu niedriger Hb-Wert oder ein zu hoher Hämatokrit gemessen, ist die MCHC ebenfalls niedrig.

Erhöhte MCHC: Wird gefunden bei Sichelellanämie (Werte bis 450 g/l), hereditärer Sphärozytose, und bei hochtitrigen Kälteagglutininen. Siehe Beitrag 15.2.1.6 – Hinweise und Störungen.

RDW

Die RDW erlaubt die Beurteilung, ob die Erythrozyten eines Patienten isozytär oder anisozytär sind /18/. Sehr hohe RDW Werte werden bei akuten hämolytischen Anämien gemessen und sind das Zeichen einer Retikulozytose. Die Klassifizierung der Anämien auf Grund von RDW und MCV zeigt Tab. 15.2-3 – Klassifizierung der Anämien auf Grund von MCV und RDW. Nach den Ergebnissen der Third National Health and Nutrition Examination Survey 1988–1994 (NHANES III) ist die RDW bei Personen im mittleren Alter und bei alten Menschen ein Indikator des Mortalitätsrisikos. Personen ohne Karzinom oder kardiovaskuläre Erkrankung und einem RDW über 14,05 % hatten ein doppelt so hohes Mortalitätsrisiko wie diejenigen mit einem RDW unter 12,6 % /19/.

15.2.2.5.4 %HYPO

Die Bestimmung des Anteils hypochromer roter Blutzellen ist ein sensitiverer Marker als die Erythrozyten Indices zur Erkennung von Erythrozyten mit vermindertem Hb Gehalt und damit einer Eisen-restriktiven Erythropoese. So führen eine Verminderung des Hb Gehaltes der Erythrozyten bis zu 10 % weder zu einer deutlichen Veränderung des MCV, noch des MCH oder MCHC. Die Bestimmung der %HYPO zeigt eine Nachweisempfindlichkeit von 2 % hypochromer Erythrozyten bei akzeptabler Präzision. Ein beginnender Eisenmangel der Erythropoese wird deshalb frühzeitiger erkannt als durch die Bestimmung der Erythrozytenindices. Das ist auch der Fall unter Eisensubstitution. Eine Response wird durch den Abfall der %HYPO nach 2–3 Wochen angezeigt /20/.

Bei Personen mit niedrigem Ferritinwert ist die Reserve an Speichereisen leer. Ein normaler %HYPO in dieser Situation zeigt an, dass noch keine Eisen restriktive Erythropoese vorliegt und die Eisenversorgung der Erythropoese noch auf einem Niveau ist, das eine normale Hb Synthese der roten Blutzellen ermöglicht (latenter Eisenmangel; Eisenmangel ohne Anämie).

Patienten mit chronischem Nierenversagen sollten einen ausgeglichenen Eisenhaushalt haben, insbesondere unter Therapie mit Erythropoese stimulierenden Agenzien (ESA). Die European Best Practice Guidelines for the Management of Anemia in Patients with Chronic Renal Failure empfehlen eine minimale Ferritinkonzentration ≥ 100 μg/l (besser 200–500 μg/l), ein %HYPO unter 10 (besser unter 2,5) oder alternativ zum %HYPO eine Transferrinsättigung über 20 % (besser 30–40 %) /21/.

15.2.2.5.5 %MIKRO/%HYPO

Dieser Quotient ist eine Screening Untersuchung auf ein β-Thalassämie Syndrom, wenn der Anteil der mikrozytären roten Blutzellen über 20 % beträgt. Ein Quotient über 0,90 bei über 18 % mikrozytären Erythrozyten ist hinweisend /22/. Die diagnostische Sensitivität des Quotienten ist gut, die Spezifität mäßig.

15.2.2.5.6 %MAKRO

Der Anteil makrozytärer roter Blutzellen (%MAKRO) ist, wenn keine Retikulozytose vorliegt, ein früherer Indikator als das MCV bei folgenden Fragestellungen:

• Erkennung und Verlaufsbeurteilung einer Vitamin B₁₂- oder Folsäure-Mangelanämie.
• Beurteilung einer Alkoholabstinenz durch Kontrolle des Volumens der roten Blutzellen.

Die Klassifizierung der Anämien auf Grund von MCV, MCH und MCHC zeigt Tab. 15.2-4 – Klassifizierung der Anämien auf Grund von MCV, MCH und MCHC.

15.2.2.6 Hinweise und Störungen

MCV

Wird der untere Schwellenwert des Hämatologie-Analyzers zu hoch gesetzt, wird das MCV zu groß, da kleine Erythrozyten nicht mitgemessen werden. Sitzt der obere Schwellenwert zu hoch, werden Leukozyten mit erfasst. Das MCV stellt bei Präsenz mehrerer Erythrozytenpopulationen nur den arithmetischen Mittelwert dar, es können deshalb ohne Kenntnis der RDW insbesondere Mikrozytosen übersehen werden. Mit den Hämatologie Analyzern wird das MCV niedriger bestimmt als bei manueller Methodik, da bei letzterer der Hämatokrit auf Grund des Einschlusses einer geringen Menge Plasma zu hoch bestimmt wird.

Die Erythrozyten schwellen bei Raumtemperatur und 24 h Stehen um bis zu 10 % ihres urspünglichen Volumens an.

MCH

Bei starken Hypertriglyzeridämien und bei Leukozytenwerten über 50 × 10⁹/l wird durch Lichtabsorption und Lichtstreuung der Hb Wert und damit auch das MCH zu hoch bestimmt. Das ist auch der Fall bei intra- und extravaskulärer Hämolyse.

MCHC

Da die interindividuelle Variation der MCHC klein ist, kann diese gut zur Plausibilitätsprüfung serieller Blutbildmessungen herangezogen werden. Sie eignet sich zur Prüfung der analytischen Zuverlässigkeit eines Hämatologie Analyzers, z.B. durch den Vergleich des Mittelwertes von Tag zu Tag und zur Überprüfung der Einstellung der Schwellenwerte.

Erhöhte Werte von MCHC lösen im Labor einen Alarm aus. Entweder sind sie ein Artefakt oder sie beruhen auf einer pathologischen Genese. Sollte es ein Problem der analytischen Zuverlässigkeit des Hämatologie-Analyzers sein, sind sofort Korrekturen erforderlich, da die Zahl roter Blutzellen, die Hb-Konzentration oder der MCV-Wert falsch gemessen sein kann. Ursachen, die eine erhöhte MCHC verursachen können sind /25/:

• Eine falsch niedrige Erythrozytenzahl (Kälteagglutination)
• Aggutinate der Erythrozyten
• Lipämisches, hämolytisches oder ikterisches Plasma.
• Leukozytose /26/
• Sphärozytose
• Störungen der Elektrolyte des Plasmas.

Hyperglykämie

Blutglucosewerte über 600 mg/dl (33,3 mmol/l) bewirken durch eine Schwellung des Erythrozyten einen Anstieg des MCV und des Hämatokrits und einen Abfall der MCHC /23/.

Kälteagglutinine

Siehe Beitrag 18.11 – Kälteagglutinine, Kryoglobuline, Kryofibrinogen. Sie werden gehäuft gefunden bei /24/:

• Infektionen mit Mycoplasma pneumoniae. In diesem Fall sind hochtitrige Kälteagglutinine der Klasse IgM nachweisbar.
• Der Epstein Barr-Virus (EBV)-Infektion (infektiöse Mononukleose). Es handelt sich um Anti-i-Kälteagglutinine der Klasse IgM oder IgG.
• Malignen, lymphoproliferativen B-Zellerkrankungen wie der chronisch lymphatischen Leukämie oder anderen malignen Lymphomen. In diesen Fällen sind monoklonale Immunglobuline, insbesondere der Klasse M, für die Kälteagglutination der roten Blutzellen verantwortlich.

Erwärmen der Blutprobe auf 37 °C vor der Messung hebt die Kälteagglutination auf. Die Sicherung der Kälteagglutination kann durch einen Blutausstrich erfolgen. Bei 250 facher Vergrößerung wird die Agglutination der Erythrozyten bestätigt.

RDW

Die intraindividuelle Variation beträgt innerhalb von 24 h 1,7 %, von Tag zu Tag 5,9 % und von Monat zu Monat 5,3 % /10/.

Stabilität /11/

• Erythrozytenzahl: Bei RT und 4 °C 72 h.
• MCV: Bei 4 °C 3 Tage, bei RT 12 h, bei 37 °C 8 h.
• MCH: Bei 4 °C und RT 3 Tage, bei 37 °C 24 h.
• MCHC: Bei 4 °C 3 Tage, bei RT 7 h.
• RDW: Bei 4 °C 3 Tage, bei RT 7 h.

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15.3 Hämoglobin (Hb)-Konzentration

Lothar Thomas

Der Hb-Wert des Blutes ist von der Zahl der roten Blutzellen, ihrem Hb-Gehalt und dem Plasmavolumen abhängig. Zwischen Hb-Wert im Blut und der Erythrozytenmasse des Organismus besteht eine direkte Beziehung bei konstantem Plasmavolumen. Die Verminderung des Hb-Bestandes des Organismus wird als Anämie bezeichnet. Eine Anämie liegt vor, wenn die Erythrozytenmasse reduziert ist (normal Frauen 21–27 ml/kg KG, Männer 24–32 ml/kg KG) /1/. Da die Erythrozytenmasse nur mit radioaktiven Methoden gememessen werden kann, ist die Bestimmung des Hb-Werts in einem definierten Blutvolumen eine Alternative. Denn die Hb-Konzentration erfasst das Produkt aus Erythrozytenzahl und den Hb-Gehalt des Erythrozyten. Aus dem Hb-Wert wird eine Anämie erkannt, wenn das Blutvolumen normal ist. Das ist bei Anämien, die älter als 48 h sind, in der Regel der Fall. Denn bei diesen ist die Verminderung der Erythrozytenmasse durch eine Zunahme des Plasmavolumens ausgeglichen. Das Blutvolumen beträgt bei Neugeborenen 90 ml/kg KG und bei älteren Kindern und Erwachsenen 80 ml/kg KG.

15.3.1 Indikation

Diagnostik, Verlaufs- und Therapie-Beurteilung von Anämien, Polyglobulien und Polyzythämien.

15.3.2 Bestimmungsmethode

Hämiglobincyanid-Methode

Prinzip: In Lösung werden Fe²⁺ zu Fe³⁺ des Hb oxidiert durch Kaliumhexacyanoferrat [K₄Fe(CN)₆]. Es bildet sich Hämiglobin (Hi), das mit Cyanidionen (CN^–), die von Kaliumcyanid in der Lösung bereitgestellt werden, zu HiCN generiert (Tab. 15.3-1 – Bildung von Hämiglobincyanid aus Hämoglobin). HiCN hat ein breites Absorptionsmaximum um 540 nm und die Absorption von HiCN ist bei 540 nm proportional der Hb-Konzentration. Das Analysensystem wird mit einem sekundären HiCN Standard kalibriert. Die Standards enthalten 500–800 mg/l HiCN, so dass bei der gewöhnlichen Verdünnung der Blutprobe auf 1 : 251, der Standard äquivalent einer Hb-Konzentration von 125–200 g/l ist. Die Hämiglobincyanid Methode ist Referenzmethode /2/.Siehe auch Beitrag 15.2.1.2 – Bestimmungsmethode.

15.3.3 Untersuchungsmaterial

• EDTA-Blut (Dinatrium- oder Dikalium-EDTA): 1 ml
• Kapillarblut (heparinisierte Kapillare): 0,02–0,05 ml

15.3.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /3, 4, 5, 6/ und Tab. 15.3-2 – Referenzbereich von Hämoglobin.

15.3.5 Bewertung

Die Hb-Bestimmung ist die wichtigste Untersuchung zur Diagnostik, Verlaufs- und Therapie-Beurteilung der Anämie. Häufige Ursachen von Anämien zeigt Abb. 15.3-1 – Häufigkeit der Ursachen von Anämien.

15.3.5.1 Diagnostik der Anämie

Der Begriff Anämie beschreibt eine Verminderung der Hb-Konzentration, bedingt durch /7, 8/:

• Eine absolute Verminderung der Erythrozytenzahl, z.B. bei der Anämie chronischer Erkrankungen.
• Abnahme des Hb-Gehaltes der Erythrozyten. Das kann der Fall sein bei leicht verminderter Zellzahl, z.B. Eisenmangelanämie oder erhöhter Zellzahl, z.B. heterozygote β-Thalassämie.
• Eine Zunahme des Plasmavolumens mit relativer Verminderung der Erythrozytenzahl bei normaler oder sogar erhöhter Erythrozytenmasse, z.B. im letzten Drittel der Schwangerschaft. In diesem Fall wird von einer Pseudoanämie gesprochen.

Die Erkennung der Anämie ist ein wichtiger Aspekt in der ärztlichen Diagnostik. Aber die Entscheidung, ob ein Patient anämisch ist im Vergleich zum Hb-Wert in der Bevölkerung ist nicht unproblematisch /9/. Empfohlene untere Grenzwerte sind gezeigt in Tab. 15.3-3 – Untere Grenzwerte der normalen Hb-Konzentration Erwachsener.

Die Grenzwerte für die Anämie bei Kindern werden abhängig vom Alter bewertet. Die Grenzwerte des Centers for Disease Control (CDC) der USA sind aufgeführt /10/ in Tab. 15.3-4 – Untere Grenzwerte für Anämie bei Kindern in den USA .

Für bestimmte Personengruppen wie Raucher oder in Abhängigkeit von Lebensumständen (Aufenthalt in Höhenlagen) sind Anpassungen des Hb-Wertes erforderlich. Siehe:

• Tab. 15.3-5 – Korrektur für Anämie bei längerem Aufenthalt in Höhenlagen
• Tab. 15.3-6 – Korrektur für Anämie bei Rauchern

15.3.5.2 Ausmaß der Anämie

Das Ausmaß der Anämie wird beurteilt abhängig von der Hb-Konzentration in /11/:

• Mild; unterer Referenzbereichswert bis > 100 g/l.
• Moderat 100–>80 g/l.
• Schwer 80–65 g/l.
• Lebensbedrohend; unter 65 g/l.

15.3.5.3 Klinische Symptome der Anämie

Die klinischen Symptome, die der Patient wahrnimmt, sind kalte und blasse Haut, Müdigkeit, Herzklopfen, geringe Belastbarkeit, Depression, Störung der kognitiven Funktion und eine generelle Verminderung der Lebensqualität. Bei einer schweren Anämie, wenn sich der Hb-Wert in etwa halbiert hat, kann es zur kardialen Dekompensation mit Stauungsinsuffizienz des Herzens kommen, da der koronare Blutfluss sein Maximum erreicht hat. Diese Situation ist besonders kritisch bei Patienten mit präexistenter koronarer Herzerkrankung. Auch kann bei schwerer Anämie, auf Grund einer Verminderung des renalen Blutflusses, eine leichte Proteinurie resultieren /12/.

Die Schwere der klinischen Symptome ist vom Ausmaß der Anämie und weiteren Faktoren abhängig /12/:

• Dem physiologischen Status des Patienten. Es haben jüngere Gesunde weniger und leichtere Symptome als alte Menschen.
• Der Komorbidität. So führen schon leichte Absenkungen des Hb-Werts bei multimorbiden oder bettlägerigen Patienten zu stärkeren Beschwerden wie Schläfrigkeit, Stürzen beim Aufstehen, Claudicatio oder pectanginösen Beschwerden.
• Der Geschwindigkeit des Auftretens der Anämie. Langsam sich entwickelnde Anämien werden von scheinbar gesunden Personen häufig erst in körperlichen oder psychischen Stresssituationen wahrgenommen.

15.3.5.4 Häufigkeit der Anämie

In Europa und den USA haben etwa 1 % der erwachsenen Männer und 3–5 % der erwachsenen Frauen eine Anämie, für Afrika sind die Zahlen 27 % und 48 % sowie 40 % und 57 % für Südostasien. Die häufigsten Ursachen sind Mangel- und Fehlernährung sowie der Befall mit dem Hakenwurm /13/. Durch Eisenmangel sind etwa die Hälfte der Anämien bedingt, die Zahl der Menschen mit Anämie durch Eisenmangel soll weltweit über 500 Millionen betragen, die Zahl derjenigen mit Eisenmangel ohne Anämie ist etwa 3 fach so hoch.

15.3.5.5 Anämietoleranz

Junge gesunde Personen mit Normovolämie

Sie zeigen keine Hinweise auf eine kritische Verminderung der O₂-Versorgung bis zu einem Hb-Wert von 50 g/l. Ab ≤ 60 g/l können aber EKG-Veränderungen und Störungen der kognitiven Funktion auftreten. Hb-Werte von 50–45 g/l sind die absolute Indikation zur Substitution mit Erythrozytenkonzentraten (EK).

Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen (CVD)

Patienten mit stabiler CVD tolerieren Hb-Werte von 70–80 g/l ohne hypoxische Schäden. Werte unter 70 g/l erhöhen die Morbidität und Mortalität.

Operative Patienten /14/

Ein präoperativer Hb-Wert ≤ 100 g/l ist mit einer erhöhten perioperativen Mortalität assoziiert. Das ist bei einem perioperativen Hb-Abfall auf ≤ 100 g/l bei Patienten ohne kardiovaskuläre Erkrankung (CVD) nicht der Fall. Das Risiko der Mortalität ist am Größten, wenn bei Patienten mit CVD der Abfall intraoperativ ≥ 40 g/l beträgt. Bezugnehmend auf alle Patienten ist ein perioperativer Hb-Abfall bis 70 g/l zwar mit einer erhöhten Morbidität, nicht aber mit erhöhter Mortalität verknüpft. Aber jeder Abfall um 10 g/l unter 70 g/l erhöht das Risiko der Mortalität 1,5 fach.

Patienten ohne CVD und einem präoperativen Hb-Wert von 60–90 g/l und nur geringem präoperativen Blutverlust haben eine Odds-Ratio von 1,4 für Mortalität im Vergleich zu denjenigen mit präoperativen Hb-Werten > 120 g/l (siehe auch Tab. 15.4-2 – Referenzbereiche des Hämatokrits).

Intensivpatienten

Beatmete Intensivpatienten mit Polytrauma und Sepsis scheinen nicht von einer Transfusion auf Hb-Werte > 90 g/l zu profitieren. Nur bei massiven Blutverlusten oder diffuser Blutungsneigung scheint ein Hb-Wert > 100 g/l zur Stabilisierung der Blutgerinnung beizutragen.

15.3.5.6 Einteilung der Anämien

Die Einteilung der Anämien kann erfolgen:

• Entsprechend der Pathogenese. Diese Einteilung ist jedoch problematisch, da bei vielen Formen der Anämie mehrere Mechanismen zur Pathogenese beitragen.
• An Hand der Morphologie der Erythrozyten in mikrozytär, normozytär und makrozytär, bzw. nach dem Hb-Gehalt der roten Blutzellen in hypochrome und normochrome Formen. Diese Einteilung hat sich in der Differentialdiagnostik der Anämien durchgesetzt.
• Nach der Regenerativität der Erythropoese in hypo- , normo- und hyperregenerative Anämien.
• Nach der Verlaufsform in akute und chronische.
• In angeborene und erworbene Anämien.

Die Einteilung der Anämien nach der Regenerativität der Erythropoese zeigt Tab. 15.3-7 – Einteilung der Anämien nach der Regenerativität der Erythropoese.

Akute Anämie

Eine akute Anämie, z.B. durch Blutverlust, ist durch den Hämatokrit, die Erythrozytenzahl und die Hb-Konzentration erst nach 24 h zu erfassen, da in den ersten Stunden keine ausreichend kompensatorische Zunahme des Plasmavolumens erfolgt.

Chronische Anämie

Bei Patienten mit chronischer Anämie ist das Blutvolumen annähernd normal, da entsprechend der Verminderung der Erythrozytenmasse das Plasmavolumen zugenommen hat. Als Folge liegt eine Verminderung der Erythrozytenzahl und eine Abnahme von Hämatokrit und Hb-Wert vor.

Relative Anämie

Es besteht ein Zustand mit normaler Erythrozytenmasse, aber das gesamte Blutvolumen ist auf Grund einer Erhöhung des Plasmavolumens vermehrt. Ursache ist eine regulative Änderung im Wasser- und Elektrolyt-Haushalt, z.B. in der Schwangerschaft. Im Unterschied zur chronischen Anämie, bei der im Serum gewöhnlich ein normales Totalprotein gemessen wird, ist bei der relativen Anämie (Pseudoanämie) das Totalprotein erniedrigt oder niedrig-normal, ausgenommen ist der M. Waldenström.

Aplastische Anämie

Die aplastische Anämie beruht auf dem Mangel des Knochenmarks Blut zu bilden. Der hämatopoetische Defekt ist eine mangelnde Funktion des Endorgans, die aus unterschiedlichen pathophysiologischen Mechanismen resultiert. Die Zellularität des Knochenmarks ist vermindert, peripher besteht eine Panzytopenie  /73/.

Differenzierung der Anämien

Die häufigste Form der Anämien ist die mikrozytäre hypochrome Anämie. Es handelt sich um eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die angeboren oder erworben sein kann. Sie wird besonders diagnostiziert bei Kindern und Heranwachsenden, Frauen vor der Menopause und Schwangeren (meistens auf Eisenmangel beruhend) /64/.

15.3.5.6.1 Mikrozytäre hypochrome Anämien

Die mikrozytäre Anämie kann beruhen auf /64/:

• Einem Eisenmangel
• Einem Defekt in den Globingenen (Hämoglobinopathie, Thalassämie)
• Einem Defekt der Hämsynthese
• Einem Defekt in der Eisenverfügbarkeit oder der Eisenaufnahme der erythroiden Vorläuferzellen

Die mikrozytäre Anämie kann sideroblastische bedingt sein, eine Störung in die mehrere Gene involviert sind.

Genetisch bedingte Mikrozytosen, die auf einer Störung der Hämsynthese beruhen sind /64/:

• Die sideroblastische Anämie (siehe Tab. 15.3-9)
• Die erythropoetische Protoporphyrie (siehe Tab. 14.6-6)
• Die kongenitale erythropoetische Porphyrie (siehe Tab. 14.6-6).

Genetisch bedingte Mikrozytosen, die ihre Ursache in einer mangelnden Eisenverfügbarkeit haben sind /64/:

• Die Eisenmangelanämie (siehe Tab. 7.1-2)
• Die Ferroportin Erkrankung
• Die hereditäre Atransferrinämie (siehe Tab. 7.1-9)
• Die hereditäre Acoeruloplasminämie (siehe Tab. 7.1-9)

Zur Beurteilung und Differenzierung der Anämien sollten folgende Tabellen Beachtung finden:

• Tab. 15.3-8 – Blutzellstatus bei bestimmten Personen- und Patientengruppen,
• Tab. 15.3-9 – Klassifikation und Differenzierung der mikrozytären Anämien,
• Tab. 15.3-10 – Hämatologische Daten bei Patienten mit β-Thalassämie-Syndrom,
• Tab. 15.3-11 – Klassifikation und Differenzierung der normozytären Anämien,
• Tab. 15.3-12 – Ursachen hämolytischer Anämien,
• Tab. 15.3-13 – Laborbefunde bei Sichelzellanämie-Syndromen,

15.3.5.6.2 Makrozytäre Anämien

Der Mangel von Folat oder Vitamin B12 ist verantwortlich für die Ausbildung einer megaloblastären Anämie, die bei jedem der Vitaminmängel auftritt. Eine mangelnde Synchronie zwischen der Reifung des Zytoplasmas und des Zellkerns führt zur Makrozytose, zur Ausbildung eines unreifen Zellkerns und zu hypersegmentierten Granulozyten im peripheren Blut. Das dysplastische und hyperzelluläre Knochenmark kann als eine akute Leukämie fehl interpretiert werden. Die ineffektive Erythropoese führt zu einer Hämolyse im Knochenmark mit der Freisetzung von LDH. Klinische und labordiagnostische Befunde der megaloblastären Anämie sind aufgeführt in:

• Tab. 15.3-14 – Klassifikation und Differenzierung der makrozytären Anämien

Siehe auch:

• Kapitel 13.3 –Vitamin B12 Mangel
• Kapitel 13.4 –Folatmangel

15.3.5.6.3 Diagnostik der Anämien

Zur Differenzierung einer Anämie sind folgende Untersuchungen wichtig:

• Hämatokrit als Maß zur Beurteilung des Erythrozytenanteils am Blutvolumen.
• Erythrozytenmorphologie, also MCV, MCH oder Blutausstrich, zur Erkennung des Eisenmangels, einer DNA-Synthesestörung (Vit. B₁₂-, Folsäuremangel) oder Formveränderungen der Erythrozyten.
• Retikulozytenzahl oder Retikulozytenindex (RI) als Maß der Regenerativität der Erythropoese. Anhand des RI werden die Anämien in normo-, hypo- und hyperregenerative Formen eingeteilt.
• Retikulozyten-Indizes wie der Hb-Gehalt der Retikulozyten (CHr oder Ret-H_e) zur Beurteilung einer akut aufgetretenen Eisen-restriktiven Erythropoese.
• Ferritin als Indikator des Speichereisens.
• Zink Protoporphyrin zur Diagnose eines Eisenmangels der Erythropoese
• Transferrinsättigung (TSAT) und der lösliche Transferrinrezeptor (sTfR) zur Beurteilung des verfügbaren Funktionseisens.
• sTfR Konzentration in Bezug zum Wert des Hämatokrits zur Feststellung einer intrinsischen Hypoproliferation der Erythropoese. Siehe auch Beitrag 7.4 – Soluble Transferrinrezeptor).
• Erythropoetin (EPO) Konzentration in Bezug zum Wert des Hämatokrits, zur Beurteilung einer adäquaten Stimulierung der Erythropoese. Siehe auch Abb. 15.10-1 – Erwarteter Erythropoetin-Konzentrationsbereich in Abhängigkeit vom Hämatokrit)
• EPO im Serum und Beurteilung der Ratio observed/predicted (O/P), siehe auch Beitrag 7.4 – Löslicher Transferrinrezeptor. Eine O/P-Ratio unter 0,8 weist auf eine inadäquat niedrige EPO Stimulation hin und ein Wert über 1,2 auf eine hyperproliferative Erythropoese, bedingt durch verstärkte EPO Stimulation.
• C-reaktives Protein zur Feststellung einer Infekt- und Entzündungsanämie.
• Haptoglobin zur Diagnostik einer hämolytischen Anämie.

Die meisten Anämien beruhen auf einer Kompromittierung der Erythropoese, sind also die Folge von:

• Chronischer Erkrankung, z.B. von systemischer Entzündung, Infektion, solidem malignen Tumor, Leukämie, Lymphom.
• Organerkrankungen, z.B. von Niere, Leber, Schilddrüse oder Dünndarm.

Eine Untersuchung des Knochenmarks ist gewöhnlich nicht erforderlich:

• Bei allen Anämien durch Kompromittierung der Erythropoese, ausgenommen Lymphom und Leukämie.
• Bei allen mikrozytären Anämien, mit Ausnahme bei Verdacht auf sideroblastische Anämie.

15.3.5.6.4 Mechanismen der Anämiekompensation

Die Symptome der Anämie sind von Faktoren wie Schweregrad, Zeitraum des Auftretens, dem Alter und dem physiologischen Status des Patienten abhängig /12/. In Ruhe benötigt der Organismus 20–300 ml O₂ pro Minute. Beim Gesunden überschreitet die gelieferte O₂ Menge das 2–4 fache der Erfordernis. Bei einem Herzminutenvolumen von 5 Litern und einer Sauerstoffsättigung von 99 % beträgt die minütliche Anlieferung von O₂ 1032 ml. Ein isolierter Abfall des Hb auf 100 g/l resultiert nur noch in einer Anlieferung von 688 ml pro Minute und bei einem Hb-Abfall auf 50 g/L sind es noch 342 ml in der Minute /15/.

Der Organismus hat folgende Mechanismen der Anämie zu begegnen und die Sauerstoffversorgung zu gewährleisten /12/:

• Erhöhung des Herzminutenvolumens, was sehr effektiv, aber metabolisch aufwändig ist
• Erhöhung der Atemfrequenz
• Änderung der Affinität des Häms zum O₂. Die rote Blutzelle generiert verstärkt 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG), wodurch die Affinität des Häms zum O₂ vermindert und vermehrt O₂ an die Gewebe abgegeben wird. Die Verschiebung der Sauerstoff Dissoziationskurve nach rechts kann bis zur Hälfte das Anämie-bedingte O₂ Defizit kompensieren.
• Verminderung des pH im Kapillarblut und den Geweben, wodurch eine bessere Dissoziation des O₂ vom Hb erfolgt und auch eine Vasodilatation.
• Verstärkte Bildung von Erythropoetin und Anregung der Erythropoese. Siehe Tab. 15.10-1 – Referenzbereiche für Erythropoetin).
• Bevorzugte Durchblutung sensitiver Organe auf Kosten von weniger vitalen Organen.

15.3.5.7 Erhöhung der Transportkapazität für Sauerstoff

Mit Zunahme einer volumämischen Anämie erhöht sich das Herzminutenvolumen, und das beruht vornehmlich auf der Zunahme des Schlagvolumens. Die Zunahme des Herzschlags kann variabel erhöht sein. Bis zu einem Hb-Wert von 75 g/l resultiert die hämodynamische Kompensation im Wesentlichen auf einer Zunahme des Herzminutenvolumens. Liegt ein noch stärkerer Hb-Abfall oder zusätzlich erschwerende Bedingungen vor, ist die Herzmuskulatur der begrenzende Faktor. In einer solchen Situation wird die utilisatorische Kompensation, also die Verschiebung der Oxyhämoglobinkurve, zum wichtigsten Kompensationsmechanismus.

Bei der utilisatorische Kompensation kommt es zur extremen Ausnutzung der Sauerstoffreserven. Sie erreicht in den meisten Organen mehr als 90 %, was einem Absinken der O₂-Sättigung des Blutes von normal 150 ml/l auf 10 ml/l entspricht. Die utilisatorische Kompensation geschieht nicht beim akuten Blutverlust, sondern erst nach mehreren Tagen durch die vermehrte Bildung von 2,3-DPG und seine Wirkung am Hb (Abb. 15.3-2 – Struktur und Funktion von Hämoglobin). Auf Grund des vermehrten 2,3-DPG-Gehalts des Erythrozyten kommt es zu einer Abnahme der O₂-Affinität zum Hb und konsekutiv zu einer Rechtsverlagerung der Hb-O₂-Dissoziationskurve mit einer vermehrten O₂-Dissoziation in die Gewebe (siehe Abb. 15.4-4 – Wirkung des 2,3-Diphosphoglycerats auf die O2-Sättigungskurve). Dadurch wird die Hälfte des durch eine moderate Anämie verursachten Sauerstoffdefizits kompensiert.

15.3.5.8 Sauerstoffbindung durch Hämoglobin

Der Sauerstofftransport von Hb ist von der Hb-Konzentration und der Hb-O₂-Affinität abhängig. Letztere bestimmt das Ausmaß der O₂-Beladung und der O₂-Abgabe vom Hb-Molekül /16/. Die Abhängigkeit der Sauerstoffsättigung des Hb vom PO₂ im Blut wird durch die Hb-Affinitätskurve beschrieben (Abb. 15.3-3 – O2-Affinitätskurve). Die Kurve ist charakterisiert durch P₅₀, den Wert, bei dem Hb zu 50 % mit O₂ gesättigt ist.

Die physiologische Bedeutung eine variablen Hb-O₂-Affinität liegt in der adäquaten Anpassung der O₂-Bindung damit sowohl die O₂-Beladung in der Lunge, als auch die Freisetzung in den Geweben optimal aufeinander abgestimmt sind. Eine Verschiebung der Hb-O₂-Bindungskurve nach links begünstigt die O₂-Aufnahme, eine Verschiebung nach rechts bedeutet eine Verminderung der O₂-Aufnahme und eine Begünstigung der O₂-Abgabe in den Geweben.

Die Hb-O₂-Bindungskurve wird verschoben /16/:

• Nach Rechts durch Azidose, eine hohe erythozytäre 2,3- DPG Konzentration und eine erhöhte Körpertemperatur.
• Nach links durch eine Alkalose, die Hypokapnie, ein vermindertes erythrozytäres 2,3-DPG und eine verminderte Körpertemperatur.

Effekt des pH-Wertes

Die Wirkung des pH auf die HbO₂-Affinität beruht auf der Abhängigkeit des pH von Änderungen des pK-Werts ionisierbarer Aminosäurereste auf das Hb-Molekül. Azidose stabilisiert die Desoxyform des Hb-Moleküls und vermindert die HbO₂-Affinität (Bohr-Effekt) /16/.

Wirkung des CO₂

Eine wesentliche Wirkung von CO₂ auf die HbO₂-Affinität beruht dem pH-Wert der Zelle. Ein weitere Effekt ist, dass der Anstieg von CO₂ bei konstantem pH die Hb-O₂-Bindungskurve nach rechts verschiebt aufgrund einer reversiblen Bildung von Carbamat aus CO₂ und den N-terminalen alpha- und beta-Ketten des Hb-Moleküls /16/.

15.3.5.8.1 Sauerstoffverfügbarkeit bei Anämie

Die Erythrozyten sind mit einem Gehalt an 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG) ausgestattet, der etwa 10³ mal höher ist als der Gehalt anderer Zellen des Organismus /16, 79/. Das 2,3-DPG wird auf einem Seitenweg der Glykolyse in den roten Blutzelle gebildet. Alkalose stimuliert die Glykolyse und erhöht die Konzentration in den Erythrozyten, während Azidose den Gehalt reduziert. Das Enzym, das die 2,3-DPG-Synthese katalysiert, ist die 2,3-DPG-Mutase, während die 2,3-DPG-Phosphatase den Abbau katalysiert.

2,3-DPG bindet spezifisch an Desoxy-Hb und reduziert dort die fraktionelle Sauerstoffsättigung. Dadurch verschiebt sich die Sauerstoffbindungskurve nach rechts. Die Funktion von 2,3-DPG in der Bindung und Freisetzung von O₂ am Hb-Molekül ist in Abb. 15.4-4 – Effekt von 2,3-Diphosphoglycerat (2,3 DPG) auf die O₂-Sättigung aufgezeigt.

Alle Patienten mit Anämie haben einen erhöhten Gehalt an 2,3-DPG in den Erythrozyten, was die Anlieferung von O₂ erhöht (PO₂). Bei anämischen Patienten mit einem bestimmten Sauerstoffpartialdruck ist die O₂-Sättigung vermindert. Bei einem venösen PO₂ von 40 Torr beträgt die O₂-Sättigung etwa 80 % und etwa 20 % des O₂ im Blut liegen ungebunden vor. Demgegenüber ermöglicht bei Patienten mit einer Anämie, bei denen der Gehalt der Erythrozyten an 2,3-DPG erhöht ist, eine höhere Fraktion (etwa 30 %) von O₂ ungebunden zu lassen.

Beispiel /79/: Bei einer Person mit einem Hb-Wert von 150 g/L beträgt die Sauerstoffkapazität von 100 ml Blut etwa 20 ml. Aber die Erythrozyten des Patienten haben einen höheren Gehalt an 2,3-DPG und eine niedrigere Affinität für O₂. In diesem Fall werden etwa 3 ml O₂ freigesetzt und das Defizit an Erythrozyten kompensiert.

Die Desoxygenierung erhöht die Syntheserate und vermehrt die 2,3-DPG Konzentration der roten Blutzelle. Im Generellen binden organische Phosphate bevorzugt an die Desoxyform des Hb mit einer Affinität, die 100 fach höher ist als zum Oxy-Hb. Die Bindung stabilisiert die Desoxyform des Hb. Zur Funktion von 2,3-DPG auf Bindung und Freisetzung von O₂ vom Hb-Molekül ist siehe Abb. 15.4-4 – Effekt von 2,3-Diphosphoglycerat auf die O₂-Sättigung.

15.3.5.8.2 Befunde bei hypoxämischer Anämie

Auf eine anämische Hypoxie weisen /16/: Tachykardie, Hypotonie, O₂-Extraktion > 50 %, gemischt-venöse O₂-Sättigung < 50 %, zentral-venöse O₂-Sättigung < 60 %, gemischt-venöses PO₂ < 32 mmHg und eine Lactatazidose (Azidose und Lactat > 2 mmol/l).

15.3.5.9 Polyzythämie und Polyglobulie

Bei Personen kaukasischer Abstammung ist es nicht sinnvoll den Verdacht auf eine Polyzythämie oder Polyglobulie aufrecht zu erhalten, wenn bei Frauen der Hb-Wert < 165 g/l bzw. der Hämatokrit < 0,50 und bei Männern der Hb-Wert < 180 g/l bzw. der Hämatokrit < 0,55 beträgt /1/. Siehe auch Beitrag. 15.4 – Hämatokrit.

15.3.6 Hinweise und Störungen

Antikoagulation

Für venöses Blut 1,5–2,2 mg EDTA (Dikalium- oder Dinatriumsalz) pro ml, die Endkonzentration an EDTA ist 3,7 bzw. 5,4 μmol/l /2/.

Bestimmungsmethode

Die Hämiglobincyanid Methode wird gestört, wenn die photometrische Messung mit Quarzkuvetten erfolgt. Blanking gegen das Reagenz beseitigt das Problem. Ein weiteres Problem sind Trübungen des Ansatzes. Ultrafiltration reduziert die Trübung, so dass die für die Referenzmethode geforderte Ratio der Absorption A⁵⁴⁰/⁵⁰⁴ ≥ 1,59 ist /17/.

Lipämie und Leukozyten

Trübes Blut führt zur Hb-Erhöhung um bis zu 30 g/l, durch Trübung der HiCN-Lösung /2/. Leukozyten-Werte > 100 × 10⁹/l können den gleichen Effekt wie die Lipämie haben /2/.

Thrombozyten

Werte > 700 × 10⁹/l bewirken eine Trübung der HiCN-Lösung und täuschen falsch-hohe Hb-Werte vor /2/.

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15.4 Hämatokrit (Hkt)

Lothar Thomas

Der Hkt beziehungsweise das Zellpackungsvolumen (Packed Cell Volume; PCV) ist das Maß des Verhältnisses des Volumens der roten Blutzellen zum Gesamtvolumen einer Probe venösen oder kapillären Blutes. Das Verhältnis wird nach entsprechender Zentrifugation gemessen und als Fraktion angegeben, also 0,42 anstatt 42 %. Der Hkt und die Erythrozytenzahl werden zur Berechnung des MCV eingesetzt und vermittels Hkt und dem MCH wird die MCHC berechnet /1/.

15.4.1 Indikation

• Diagnostik von Anämie oder Polycythämie.
• Abschätzung der Veränderungen bei Hämodilution und Hämokonzentration.
• Bezugsgröße zur Beurteilung der Anämie adäquaten Erythropoetinbildung; siehe Beitrag 15.10 – Erythropoetin.
• Determinante eines erhöhten Thomboserisikos bei Erythrozytose

15.4.2 Bestimmungsmethode

Mikrohämatokrit-Methode

Empfohlen werden wegwerfbare Borsilatglaskapillaren Typ I, Klasse B oder Natronkalk-Kapillaren, Typ II von 75 mm Länge und einem Innendurchmesser von 1,15 mm. Die Wanddicke soll 0,20 mm betragen. Folgende Anforderungen sind an die Zentrifugation gestellt /1/:

• Mikrohämatokrit Zentrifuge mit einem Rotorradius über 8 cm.
• Maximale Geschwindigkeit soll innerhalb 30 sec erreicht werden.
• Relative Zentrifugalkraft (10.000–15.000) × g an der Peripherie für 5 min, ohne dass die Temperatur von 45 °C überschritten wird.

Berechnung der relativen Zentrifugalkraft: Siehe Tab. 15.4-1 – Formeln zur Bestimmung und Berechnung des Hämatokrits.

Berechnung des Hkt mit der Mikromethode: Siehe Tab. 15.4-1.

Hämatologie Analyzer

Prinzip: Siehe auch Beitrag 15.2.1.2 – Bestimmungsmethode. Im einfachsten Falle erfolgt, wie in der Gleichung dargestellt, die Kalkulation des Hkt aus RBC × MCV. Der RBC (Red Blood Count) ist die Zahl der roten Blutzellen. Einige Hämatologie Analyzer bestimmen die Summe der elektronischen Impulse und dividieren sie durch die Anzahl der Impulse. Die Berechnung erfolgt nach folgender Gleichung in Tab. 15.4-2 – Referenzbereiche des Hämatokrits.

Die Ergebnisse der HämatologieAnalyzer werden auf die Mikrohämatokrit Methode abgestimmt.

15.4.3 Untersuchungsmaterial

• Vollblut (Dinatrium-EDTA, Trikalium-EDTA oder Heparin als Antikoagulanz): 1 ml
• Kapillarblut (heparinisierte Kapillare): 0,05 ml

15.4.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8/ und Tab. 15.4-2 – Referenzbereiche des Hämatokrits.

15.4.5 Bewertung

Der Hkt ist eine einfache Methode zur Erkennung von Anämie, Erythrozytose und Polyzythämie. Er ist zusätzlich nützlich zur Erkennung von Änderungen bei Hämodilution und Hämokonzentration. Der Hkt ist abhängig von:

• Der Erythrozytenmasse des Organismus. Diese beträgt bei Frauen 17–32 ml/kg Körpergewicht und bei Männern 20–36 ml/kg Körpergewicht /9/.
• Dem mittleren Zellvolumen der Erythrozyten.
• Dem Plasmavolumen, dessen Referenzbereich 30– 45 ml/kg Körpergewicht beträgt.

15.4.5.1 Verminderung des Hkt

Neben dem Hb-Wert ist die Verminderung des Hkt ein Kriterium zur Diagnostik der Anämie. Ausgenommen sind Patienten:

• Mit Hyperhydratation, z.B. postoperativ mit geringem Blutverlust aber überkompensierter Volumensubstitution. Es liegt dann bei noch normaler Erythrozytenmasse eine Vergrößerung des Plasmavolumens vor, man spricht dann von Pseudoanämie.
• Mit akuter Blutung, bei denen der Erythrozytenverlust noch nicht durch eine Zunahme des Plasmavolumens ausgeglichen ist, pathophysiologisch schon eine Anämie vorliegt, aber noch nicht durch eine Abnahme und Hb und Hkt angezeigt wird.

Bei gesunden normovolumämischen Erwachsenen kann der Hkt auf 0,15–0,20 abfallen bevor es zu einer akuten Mangelversorgung des Herzens, angezeigt durch einen Anstieg der kardialen Lactatbildung, kommt. Erst bei einem Abfall auf 0,18, entsprechend einem Hb-Wert von etwa 60 g/l, treten stärkere Störungen der kardialen Funktion bei gesunden Personen auf. Auch beim Fetus und Neugeborenen muss der Grad der Anämie sehr schwer sein, bevor es zu kardialen Funktionsstörungen kommt /10/.

Eine erhöhte Inzidenz postoperativer kardialer Komplikationen wird bei Patienten mit peripheren vaskulären Erkrankungen gefunden, wenn der Hkt unter 0,29 beträgt /11/. Bei Hämodialysepatienten sind kardiale Erkrankungen die häufigste Todesursache. Eine Erhöhung des Hkt von unter 0,30 in den Bereich von 0,30–0,38 vermindert die Herzinfarktinzidenz um 30 % im Zeitraum von 30 Monaten /12/.

Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz und einem Hkt ≤ 0,24 haben ein 51 % höheres Risiko der Mortalität und 17 % höheres Risiko der Wiedereinweisung in die Klinik, als diejenigen mit einem Hkt von 0,40–0,44. Obwohl die Anämie ein unabhängiger Risikofaktor ist, spielen die Komorbiditäten der Patienten ebenfalls eine wichtige Rolle /13/.

Der Hkt ist bedeutsam in der primären Hämostase. Eine Verminderung führt zur Reduktion der Blutviskosität und Plättchenadhäsion und bei einem Hkt von unter 0,30 kann die Blutungszeit verlängert sein /14/. Es wird deshalb angenommen, dass höhere Hkt-Werte bei Dialysepatienten eher zu einer Aktivierung des Hämostasesystems führen. Unter veno-venöser Hämofiltration bei Patienten mit akuter Niereninsuffizienz führt ein Hkt über 0,30 nicht häufiger zu einer Aktivierung des Hämostasesystems als ein Wert darunter /15/.

Erkrankungen und Zustände mit Hkt-Verminderung zeigt Tab. 15.4-3 – Erkrankungen und Zustände mit einem verminderten Hkt.

Bei Patienten mit akutem Blutverlust hängt die Anzahl der erforderlichen Blutkonserven von der Differenz des gewünschten zum aktuellen Hkt ab. Eine Kalkulation zeigt die Tab. 15.4-4 – Kalkulation der erforderlichen Blutkonserven in Abhängigkeit vom aktuellen Hkt.

15.4.5.2 Erhöhung des Hkt

Erhöhungen des Hkt bei Frauen über 0,48 und bei Männern über 0,51 beruhen auf:

• Einer absoluten Vermehrung roter Blutzellen, vorkommend bei Erythrozytose und Polyzythämie.
• Einer Verminderung des Plasmavolumens, z.B. bedingt durch Exsikkose.

Klinisch besteht ein Assoziation zwischen hochnormalem bzw. erhöhtem Hkt, einer erhöhten Blutviskosität und Gefäß- und Stoffwechselerkrankungen und Thrombosen. So haben:

• Nach der Framingham-Studie Kaukasier mit einem Hkt über 0,50 ein 2–6-fach höheres relatives Schlaganfallrisiko über den Untersuchungszeitraum von 87 Monaten als Personen mit niedrigeren Werten /16/.
• Im Puerto Heart Program Personen der urbanen Bevölkerung mit einem Hkt über 0,49 ein doppelt so hohes Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung innerhalb von 8 Jahren als Personen mit einem Hkt unter 0,42 /17/.
• Nach einer Studie in Großbritannien ansteigende Hkt-Werte eine Assoziation zur Entwicklung eines Diabetes Typ 2 /18/. Das Risiko nimmt mit dem Anstieg des Hkt signifikant zu. So haben Personen mit einem Hkt über 0,48 ein 4 fach höheres relatives Risiko als diejenigen mit einem Hkt unter 0,42.

15.4.5.3 Erythrozytose

Die Erythrozytose ist als eine absolute Vermehrung der Erythrozytenmasse definiert und kann, muss aber nicht mit einer Erhöhung des Hkt einhergehen (Abb. 15.4-1 – Einteilung der Erythrozytosen). Ein Anstieg des Hkt oder des Hb-Werts weisen auf eine Erythrozytose hin. Ein Hkt über 0,51 bei Männern und über 0,48 bei Frauen wird als oberhalb des Referenzbereichs angesehen. Die initiale Klassifizierung der Erythrozytose beruht darauf, ob ein primärer Prozess (auch bekannt als familiäre oder kongenitale Polyzythämie) vorliegt oder, ob die vermehrte Bildung von Erythrozyten sekundärer Natur ist. Dabei wird die Erythrozytenproduktion von anderen Vorgängen angetrieben /19/.Einige Kliniker wenden die Ausdrücke Polyzythämie und Erythrozytose synomym an. Das ist aber nicht richtig, denn die Polyzythämie bezieht sich auf eine erhöhte Anzahl von hämatologischen Zellen im Blut, also Erythrozyten, Granulozyten oder Thrombozyten. Kompliziert ist die Angelegenheit bei der Polycythämia vera, ein Typ der chronisch myeloischen Leukämie, der aber nur die rote Zellreihe betrifft.

15.4.5.3.1 Primäre Erythrozytose

Die primäre Erythrozytose, auch als primäre familiäre oder kongenitale Polyzythämie (PFCP) bezeichnet, ist eine Pathologie der erythroiden Vorläuferzellen, die hypersensitiv für Erythropoetin sind /19, 20/. Die PFCP ist charakterisiert durch die isolierte Erhöhung der erythrozytären Zellmasse bei einer subnormalen Konzentration von Erythropoietin im Serum. Siehe auch Tab. 15.4-5 – Erkrankungen und Zustände mit Erhöhung des Hämatokrits.

Kongenital bedingte Störungen, die EPO-Bildung betreffend, können sein:

• Defekte des EPO-Signalweges (EPO-Rezeptormutationen).
• Hoch Sauerstoff affine Hämoglobine.
• Mangel der Bisphosphorglycerat-Mutase
• Mutation von Genen des Sauerstoff messenden Systems.

15.4.5.3.2 Sekundäre Erythrozytose /19, 20/

Sekundäre Erythrozytosen resultieren aus Ursachen, die nicht intrinsischer Natur (Knochenmark-bedingt) sind, sondern auf einer reaktiv vermehrten Produktion von EPO beruhen. Die Antwort der erythroiden Vorläuferzellen auf EPO ist in der Regel normal. Die erhöhte EPO-Produktion kann z.B. eine physiologische Antwort auf eine Gewebshypoxie sein. Siehe auch Tab. 15.4-5 – Erkrankungen und Zustände mit Erhöhung des Hämatokrits.

Ätiologisch gibt es eine Vielzahl von Ursachen:

• Durch eine zentrale Hypoxie bedingt; eine verminderte Sauerstoffversorgung führt zur erhöhten Produktion von Erythropoetin und Erythrozytose.
• Lokal bedingt, durch eine renale Hypoxie.
• Eine pathologische Erythropoetin Produktion, z.B. bei Meningeom, zerebellarem Hämangioblastom, Hepatom, Adenom der Nebenschilddrüse.
• Exogene Verabreichung von Erythropoetin stimulierenden Agentien ESA (EPO-Doping).

15.4.5.4 Verminderung des Plasmavolumens

Die Verminderung des Plasmavolumens bei normaler Erythrozytenmasse verursacht eine relative Erythrozytose. Die Verminderung des Plasmavolumens beruht auf Störungen des Elektrolyt- und Wasserhaushaltes. Diese können bedingt sein durch /27/:

• Ungenügende Flüssigkeitszufuhr, z.B. Kleinkinder, alte Menschen, Schwerkranke.
• Insensiblen Wasserverlust, z.B. Schwitzen.
• Durchfälle und Erbrechen.
• Polyurie, z.B. durch Störungen des ADH-Durstmechanismus, Diuretikaabusus, Diabetes mellitus.
• Einnahme von Medikamenten zur Verbesserung der kardialen Funktion.
• Rauchen. Raucher können eine relative, absolute oder kombinierte Polyzythämie haben.
• Abusus von Alkohol, Tee, Koffein- und Cola haltigen Getränken.

15.4.6 Hinweise und Störungen

Blutentnahme

Zu langes Stauen (über 2 min) verursacht eine deutliche Zunahme des Hkt. Die größte prozentuale Abweichung nach 6 min Stauung ist 8,5 % /22/.

Antikoagulanz

Werden höhere EDTA Konzentrationen als die empfohlenen (siehe Beitrag 15.3 – Hämoglobin-Konzentration) verwendet, nimmt der MCV ab und es resultiert ein falsch-niedriger Hkt /2/.

Probe

Arterielles Blut hat einen um etwa 0,02 (5 %)höheren Hkt als venöses /2/.

Bestimmungsmethode

Die Mikrohämatokritmethode wird zwar nur selten durchgeführt, ist aber Referenzmethode. Auf Grund von eingeschlossenem Plasma sind die Werte dieser Methode um etwa 2 % höher als bestimmt mit den Hämatologie-Analyzern. Die Unterschiede sind noch höher bei abnormen Erythrozyten, z.B. Sichelzellen, Thalassämie, Eisenmangel, Sphärozyten, Makrozyten /2/.

Bei der Hkt Bestimmung mit Hämatologie Analyzern werden falsch hohe Werte bei hohen Retikulozyten- und Leukozytenzahlen berechnet, da deren höhere Zellvolumina in den Hkt eingerechnet werden. Falsch niedrige Werte werden bestimmt bei in vitro-Hämolyse, Autoagglutination und Mikrozytose.

Kompakt Analyzer, die für die bed-side-Messung des Hkt eingesetzt werden, messen den Hkt über die Leitfähigkeit des Blutes. Bei Patienten mit erhöhter Plasmaosmolalität wird der Hkt zu niedrig bestimmt /23/.

Stabilität

Bis zu 24 h bei Raumtemperatur oder 4 °C, wenn mit mechanisierten Blutzellzählgeräten bestimmt wird. Zentrifugation innerhalb von 6 h bei der Mikrohämatokrit-Methode /2/.

Leukämie

Der weiße Leukozytenpellet muss bei Auswertung der Mikrohämatokritmethode unberücksichtigt bleiben /1/.

Intraindividuelle Variation

Der VK beträgt innerhalb eines Tages 4,6 %, von Tag zu Tag 4,1 % und von Monat zu Monat 3,4 % /24/.

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15.5 Dyshämoglobine

Lothar Thomas

Erhöhte Konzentrationen der Dyshämoglobine

• Methämoglobin (Hämiglobin),
• Carboxyhämoglobin und
• Sulphhämoglobin

schränken die Transportkapazität des arteriellen Blutes für Sauerstoff ein. Diese Hämoglobin (Hb)-Fraktionen werden nicht bei Messung der Sauerstoffsättigung des Blutes mit Blutgasanalysatoren erfasst. Dadurch kann es zu erheblichen Fehlinterpretationen der funktionellen Sauerstoffversorgung der Gewebe kommen /1/.

15.5.1 Methämoglobin (metHb), Hämiglobin (Hi)

MetHb ist eine oxidierte Hb-Form. Viele Medikamente und oxidierende Chemikalien können eine Methämoglobinämie und auch eine Hämolyse bewirken.

15.5.1.1 Indikation

Zyanose und Verdacht auf:

• Toxische Methämoglobinurie.
• Hereditäre Methämoglobinämie.
• Verminderung der arteriellen Sauerstoffsättigung, die aus klinischer Sicht primär nicht erklärbar ist.

15.5.1.2 Bestimmungsmethode

Prinzip: Hi hat in schwach saurer Lösung ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei 630 nm. Zur Erhöhung der Spezifität wird eine Differenzmessung nach Zusatz von KCN durchgeführt. Der Zusatz von Cyanid bewirkt die Entstehung von Hämiglobincyanid, das bei 630 nm keine Absorption hat. Eine Bestimmung von Methämoglobin durch simultane Mehrwellenlängen Messungen ist beschrieben /2/.

15.5.1.3 Untersuchungsmaterial

Kaliumoxalat-Blut, EDTA-Blut, Heparin-Blut: 1 ml

Für die Bestimmung wird Hämolysat eingesetzt (1 Teil Vollblut und 5 Teile A. bidest).

15.5.1.4 Referenzbereich

Hi 0,2–1,0 % /3/

15.5.1.5 Bewertung

Das Fe²⁺ von Häm im Hb Molekül wird in vivo laufend zu Fe³⁺ oxidiert und es entsteht metHb. Dessen Reduktion zu Hb erfolgt durch die NADH abhängige Methämoglobinreduktase. Im kleinen Rahmen ist auch eine nicht enzymatische Reduktion von metHb durch Ascorbinsäure und reduziertes Glutathion möglich. Eine Methämoglobinämie vermindert die Bindungskapazität für Sauerstoff, da Fe³⁺ den Sauerstoff nicht mehr reversibel binden kann.

Von einer Methämoglobinämie wird gesprochen, wenn mehr als 1 % des Hämoglobineisens in oxidierter Form (Fe³⁺ ) vorliegt.

An eine Methämoglobinämie ist zu denken, wenn die arterielle Sauerstoffsättigung eines Patienten, gemessen mit der Pulsoximetrie nur etwa 85 % beträgt.

15.5.1.5.1 Hereditäre Methämoglobinämie

Es handelt sich um ein autosomal rezessiv vererbtes Leiden, bei dem ein Mangel der NADH abhängigen Met-Hb-Reduktase vorliegt, die Aktivität ist unter 20 %. Der metHb-Anteil im Blut beträgt 8–40 %, es kann eine schokoladenbraune Farbe annehmen. Der heterozygote Met-Hb-Reduktase Mangel geht nicht mit einer Methämoglobinämie einher /4/.

Neugeborene haben nur eine geringe Aktivität der NADH abhängigen Met-Hb Reduktase und sind deshalb anfällig für eine Methämoglobinämie. So kann die Gabe von Pharmaka oder von Nitrat haltigem Wasser, das im Gastrointestinaltrakt in Nitrit umgewandelt wird, eine Methämoglobinämie verursachen. Die klinischen Zeichen einer angeborenen Methämoglobinämie sind Zyanose und neurologische Störungen.

15.5.1.5.2 Toxische Methämoglobinämie

Bei der toxischen Methämoglobinämie ist die Aktivität der NADH abhängigen Met-Hb-Reduktase normal. Die Methämoglobinämie tritt auf /3, 5/:

• Bei Personen, die einen direkten Kontakt mit Oxidantien haben, z.B. Arbeiter in der chemischen Industrie und Schweißer.
• Bedingt durch Pharmaka, die Hb direkt in Hi umwandeln oder indirekt eine Umwandlung durch die Bildung von Sauerstoffradikalen in der Zirkulation fördern. Substanzen, die eine Methämoglobinämie verursachen können, sind aufgeführt in Tab. 15.5-1 – Substanzen, die eine Methemoglobinämia induzieren können. Die klinischen Symptome sind abhängig vom Anteil des metHb am Hb (Tab. 15.5-2 – Korrelation klinischer Symptome mit dem metHb Anteil). Die Behandlung umfasst die Gabe von Sauerstoff und die Infusion von Methylenblau zur Reduktion des Fe³⁺ zu Fe²⁺. Es werden in einer 10-minütigen Infusion 1 mg Methylenblau/kg Körpergewicht gegeben.

15.5.1.6 Hinweise und Störungen

Stabilität

MetHb ist instabil in intakten Erythrozyten und kann enzymatisch zu Hb transformiert und in HbO₂ umgewandelt werden. Das ist der Fall, wenn das Blut länger als 2 h mit Dikalium-EDTA, Lithium-Heparin oder Kaliumoxalat als Antikoagulanz vor der Messung steht. Fluorid sollte nicht eingesetzt werden, da seine Interaktion mit metHb zu falsch-niedrigen Werten für Gesamt-Hb und metHb führt /1/. Wird die Blutprobe mit 5 Teilen A. bidest verdünnt und die Erythrozyten hämolysiert, ist eine Stabilität von mindestens 45 h gewährleistet.

Störfaktoren

Hypertriglyceridämie und Hyperbilirubinämie stören die metHb-Bestimmung. Bei der Mehrwellenlängenmessung stören Triglyceride erst ab 1.000 mg/dl (11,4 mmol/l) und Bilirubin ab 10 mg/dl (171 μmol/l) /6/.

15.5.2 Carboxyhämoglobin (COHb)

Kohlenmonoxid ist ein farb-, geruch- und geschmackloses, nicht reizendes Gas, das bei unvollständiger Verbrennung von Kohlenstoff haltigen Materialien anfällt. Häufige Ursachen sind die Inhalation des Rauchgases von Feuer, Automobilabgasen, schlecht ventilierte Verbrennung in Kohle-, Gas- oder Ölöfen, Zigarettenrauch und Methylenchlorid /5/. Silent Killer ist der häufigste Spitzname für CO.

15.5.2.1 Indikation

Unspezifische Symptome wie Grippe-ähnliche Symptomatik, Kopfschmerz, Synkope, erstmalig auftretende Krämpfe und Anamnese der Kohlenmonoxid-Exposition.

15.5.2.2 Bestimmungsmethode

Methoden zur Bestimung von C0 /9/

• CO Monitor: Es wird das Volumen von CO in der Ausatmungsluft gemessen kurz vor dem Schluss der Ausatmung und der Anteil gemessen als Millionstel (ppm). Es erfolgt danach eine Berechnung auf den Hämoglobin(Hb)-Wert.
• COHb-Bestimmung: COHb wird spektrophotometrisch bei unterschiedlichen Wellenlängen bestimmt. Unterschiedliche Korrekturfaktoren werden angewendet um Störungen zu eliminieren wie z.B. Bilirubin oder Triglyzeride. Es erfolgt die Messung bei drei Wellenlängen, z.B. 415 nm, 380 nm und 450 nm /17/ oder 575 nm, 562 nm und 598 nm.
• Totales CO (TBCO) im Blut: Die Messung von TBCOHb ermöglicht das gesamte CO zum Zeitpunkt der Probennahme zu bestimmen. Die Probe enthält CO das an Hb gebunden ist und freies im Blut gelöstes CO. Ein Nachteil von TBCO ist, dass die Bestimmung nur mittels GC-MS/MS durchführbar ist.
• HPLC kombiniert mit der Absorptionsspektrometrie: Es ist möglich alles CO in der Probe zu bestimmen. Das Verfahren wird in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst werden COHb und freies CO von einander getrennt durch HPLC, das freie CO wird mit Essigsäure, H₂0₂ und Tetramethylbenzidin versetzt. Es resultiert eine blaue Farbe, deren Intensität photometrisch gemessen wird.

15.5.2.3 Untersuchungsmaterial

Vollblut (EDTA, Oxalat, Heparin): 5 ml

Das Probengefäß ist so zu füllen, dass eine möglichst kleine Luftsäule über dem Blut steht.

15.5.2.4 Referenzbereich

15.5.2.5 Bewertung

Der CO-Gehalt in der freien Natur ist unter 0,001 % (10 ppm), ist aber in urbanen Regionen höher. Die vom Körper absobierte CO-Menge ist vom Atemminutenvolumen, der Dauer der CO-Exposition und der CO-Konzentration der Umgebung abhängig. Beim Kochen mit Gas erreicht die Raumkonzentration einen Wert von 100 ppm, ein Zigarettenraucher setzt sich 400–500 ppm aus und der Auspuffdampf eines Benzinmotors kann 10.000 ppm CO enthalten. Bei Exposition von 70 ppm über 4 h wird ein COHb Gehalt von 10 % erreicht und bei 350 ppm von 40 % /9/. Die CO-Konzentration am Arbeitsplatz soll in den USA bei einem 8-stündigem Arbeitstag 50 ppm nicht überschreiten /9/.

Die häufigsten Quellen der CO-Vergiftungen sind die Abgase von Verbrennungsmotoren sowie falsch oder defekt installierte Heiz- und Kochgeräte auf Verbrennungsbasis. Unfälle mit Gasbadeöfen, Heizungen im Winterbetrieb von Campingwagen und Standheizungen bei PKW und LKW haben deshalb eine hohe Inzidenz. Der MAK-Wert (maximale Arbeitsplatz-Konzentration) ist in Deutschland auf 30 ppm (33 mg/m³) festgesetzt /8/.

Die pathologische Wirkung von CO beruht auf einer Veminderung der O₂-Transportkapazität des Blutes, der Reduzierung der O₂-Extraktion in den Geweben und einer direkt toxischen Wirkung von CO auf die Zelle. Bei niedrigen Werten wirkt CO als Neurotransmitter (siehe Beitrag 19.2 – Oxidativer Stress) und moduliert Inflammation, Zellproliferation und Apoptose /10/. Die CO-Affinität für Hb ist 240 fach höher als für O₂ und die Oxyhämoglobin Dissoziationskurve ist links verschoben (siehe Abb. 15.4-4 – Wirkung des 2,3-Diphosphoglycerats auf die O2-Sättigungskurve). CO wird vorwiegend in den Lungen gebunden und verursacht eine Blockade der O₂-Diffusion in Lunge und Muskulatur, denn CO dissoziiert weniger rasch vom Hb als O₂. Der Nachweis von COHb weist immer auf eine verminderte O₂ Verfügbarkeit der Gewebe hin, die nicht durch die Bestimmung des Hb-Werts erkannt wird und klinisch weitaus bedeutsamer ist als ein entsprechender anteiliger Hb-Abfall /10/.

Die klinische Symptomatik in Abhängigkeit von der COHb-Konzentration ist aufgeführt in Tab. 15.5-3 – COHb-Konzentration und klinische Symptomatik.

15.5.2.5.1 COHb bei Gesunden

Die COHb Werte von Nichtrauchern betragen 1–3 %. und resultieren aus endogener Produktion und aus der Umgebung. Erhöhungen dieses Untergrunds bei Nichtrauchern bis auf etwa 3 % sind vorwiegend durch Passivrauchen, weniger durch Umweltverschmutzung bedingt. Tabakrauch hat einen CO-Gehalt von 4 % und die meisten Raucher haben in Abhängigkeit von der Anzahl der täglich gerauchten Zigaretten ein COHb Gehalt im Blut von 3–8 %. Bestimmte Berufsgruppen, z.B. nicht-rauchende Feuerwehrleute, haben um 1–2 % höhere COHb-Werte als Nichtraucher. Die Halbwertszeit der Elimination des COHb beträgt etwa 4 h bei Atmung in Raumluft und 1 h bei Atmung von 100 % O₂ /9/.

15.5.2.5.2 Konstant leichte CO-Erhöhungen

Hat die Atemluft einen konstanten CO-Anteil von 25 ppm, kommt es zu einem COHb-Gehalt im Blut von 3,5 % und bei 50 ppm zu 6–8 % /9/. Schon kurzfristige, geringe CO-Anteile in der Atemluft, die zu COHb Werten von 2–6 % führen, können bei Patienten mit Atherosklerose unter Belastung pectanginöse Beschwerden und Arrhythmien auslösen /11/.

15.5.2.5.3 Schwangerschaft und Rauchen

CO passiert die Plazenta komplett und kleine Mengen COHb im mütterlichen Blut haben eine erhebliche Auswirkung auf den Fetus. Das fetale Hb hat eine hohe O₂-Affinität (P₅₀, 19,4 mmHg) im Vergleich zum Hb des Erwachsenen (P₅₀, 26,3 mm Hg auf Meereshöhe), wodurch die O₂-Aufnahme aus dem mütterlichen hypoxischen Uterusblut begünstigt wird. Im steilen Teil der HbO₂-Dissoziationskurve beträgt die fetale O₂-Sättigung nur 75–80 %. Daher ist der Fetus schon für kleine Schwankungen in der O₂-Sättigung anfällig /10/. Raucht z.B. eine Schwangere täglich ein Päckchen Zigaretten, kann der COHb-Anteil 6 % und mehr betragen. Dadurch wird der mütterliche P₅₀ von 26 auf 23 mmHg gesenkt und der O₂-Partialdruck im Uterusblut von 38 auf 32 mmHg, was zu einer Verminderung des Diffusionsgradienten in Richtung Plazenta führt. Als Folge vermindert sich im Nabelschurblut der O₂-Partialdruck von 28 auf 22 mmHg, die fetale arterielle O₂-Sättigung nimmt von 75 % auf 58 % ab und der Fetus kommt in eine O₂-Mangelversorgung /12/.

15.5.2.5.4 Vergiftung mit CO

Die klinischen Symptome einer akuten Vergiftung mit CO sind Kopfschmerz, Übelkeit, Konfusion, Stupor und Koma. Bei leichten Vergiftungen mit COHb Werten bis 25 % vermitteln die Patienten den Eindruck eines grippalen Infektes /9/.

Kopfschmerz, Übelkeit und Müdigkeit sind auch die Beschwerden bei chronischer Vergiftung. Jedoch besteht weiterhin noch eine erhebliche Beeinträchtigung des intellektuellen Verhaltens mit Konzentrationsschwäche und kognitiven Störungen. Mehr als 40 % der Patienten mit chronischer CO-Exposition haben auch noch 3 Jahre nach deren Beendigung neurologische Probleme. Oft wird an eine CO-bedingte Symptomatik nicht gedacht und entsprechende Untersuchungen unterbleiben.

Der klinische Schweregrad der CO-Vergiftung korreliert oft schlecht mit dem COHb Anteil im Blut und wird eher von der Dauer der CO-Vergiftung bestimmt. So kann ein Patient, der kurzfristig einer hohen CO-Konzentration ausgesetzt ist, keine klinische Symptomatik haben, während ein Patient der längerfristig der gleichen Menge ausgesetzt ist eine schwere Symptomatik aufweisen kann /9/.

Fünf Schweregrade der CO-Vergiftung sind klassifiziert, wobei ein COHb-Anteil über 50 % als potentiell tödlich erachtet wird (Tab. 15.5-3 – COHb Konzentration und klinische Symptomatik). Das oft kirschrote Aussehen von Blut und Gewebe ist ein unzuverlässiges Zeichen und wird nur bei schwersten CO-Vergiftungen gefunden.

In der forensischen Medizin weist ein COHb-Gehalt von über 50 % auf eine CO-Vergiftung als primäre Todesursache hin. Werte von 10–50 % zeigen an, dass Rauch inhaliert wurde und CO ein Faktor der Todesursache sein könnte, dass aber das Opfer noch lebte, als der Brand begann.

Pathophysiologisch wird die schlechte Korrelation zwischen CO-Vergiftung und den klinischen Effekten erklärt durch die Kombination von

• Hypoxie durch die Bildung von COHb und
• eine direkte toxische Wirkung von CO auf zellulärer Ebene.

Die Effekte von CO sind nicht nur auf den Zeitraum kurz nach der Exposition beschränkt, sondern nach einer scheinbaren Besserung kommt es innerhalb einer Latenz von 2–40 Tagen zu neurologischen Symptomen mit Gedächtnisverlust, Konfusion, Ataxie, Krämpfen Urin- und Stuhlinkontinenz, Desorientierung und psychiatrischen Symptomen /9/.

15.5.2.5.5 Erhöhter endogener CO-Anfall

Endogenes CO fällt bei dem Abbau von Hb, Myoglobin sowie Enzymen mit Hämstruktur, z.B. Peroxidase, Katalase oder Cytochrom c, an. Die endogene CO-Bildung ist verantwortlich für die physiologische COHb Konzentration im Blut. Erhöhte endogen bedingtes COHb tritt bei Zuständen mit starker Hämolyse oder Myolyse auf. Auch bei Patienten mit COPD sind im Stadium IV die COHb Werte höher als im Stadium II und III /13/. Beim Ikterus des Neugeborenen werden Werte bis zu 12 % COHb gemessen.

Bei der Sichelzellanämie bewirkt endogenes CO eine Verschlechterung der Situation:

• Auf Grund der verkürzten Lebenszeit der Erythrozyten fällt verstärkt CO und damit COHb an.
• COHb erhöht die Affinität anderer Bindungsstellen für O₂ (Haldane-Effekt). Es kommt zu einer Linksverschiebung der O₂-Sättigungskurve und macht sie weniger S-förmig, aber stärker hyperbolisch. Siehe Abb. 15.4-4 – Wirkung des 2,3-Diphosphoglycerats auf die O2-Sättigungskurve. Bei der Sichelzellanämie ist die Folge, dass weniger Desoxyhämoglobin zur Verfügung steht und die Erythrozyten die verstärkte Tendenz zur Sichelbildung haben. Siehe auch Tab. 15.3-9 – Klassifikation und Differenzierung der mikrozytären Anämien /14/.

15.5.2.6 Hinweise und Störungen

Probe

Die Blutentnahme sollte mit einem luftdicht verschraubbaren Röhrchen erfolgen. Zur Lagerung im Labor soll über dem antikoagulierten Blut ein möglichst geringer freier Luftraum sein /15/.

Bestimmungsmethode /9/

• COHb-Bestimmung: Obwohl COHb ein direkter Biomarker des Ausgesetztseins mit CO ist, kann der COHb-Wert niedrig sein bei Personen, bei denen der Verdacht auf eine CO Vergiftung besteht oder bei Patienten bei denen ein höherer Wert erwartet wird.
• CO-Monitor: CO wird in der Ausatmungsluft bestimmt, und zwar kurz vor dem Ende des Ausatmens. Gemessen wird das Volumen von CO.
• Totales CO (TBCO) im Blut: Ein CO-Anstieg kann neben einer CO-Vergiftung auch durch folgende Effekte bedingt sein: erhöhten oxidativen Stress, veminderte Funktion der Mitochondrien, Enzündungsreaktion im Gehirn.
• Die Kohlenstoffmonoxid-Pulsoximetrie sollte nicht als Screeningmethode auf eine CO-Kontamination eingesetzt werden, da die Nachweisempfindlichkeit zu gering ist. Die Pulsoximetrie spielt eine Rolle außerhalb der Klinik, wenn es darum geht, rasch eine CO-Vergiftung festzustellen /27/.

Störfaktoren

Hypertriglyceridämie führt bei der spektrophotometrischen Bestimmung zu falsch hohen Werten, da eine konstante Absorption hinzu addiert wird. Auch täuscht die Methämoglobinämie zu hohe Werte von COHb mit dieser Methode vor /6, 15/.

Stabilität

Die Aufbewahrung von Vollblut soll im Kühlschrank oder tiefgefroren erfolgen, eine stärkere Lichtexposition der Probe unterbleiben. Der Gehalt des CO der Probe kann Wochen bis Jahre bei 3 °C oder tiefgefroren konstant bleiben /15/.

15.5.3 Freies Hämoglobin

Zell-freies Hämoglobin (freies Häm, Plasmaprotein-gebundenes Häm und freies Hämoglobin) im Plasma können eine Gewebeschädigung bei hämolytischen Erkrankungen auslösen. Zell-freies Hämoglobin ist ein potentieller Fänger von Stickstoffmonoxid (NO), aktiviert Entzündungen und bewirkt Redoxreaktionen, die zu einem oxidativen Stress führen können. Neben dem oxidativen Stress wird auch TLR4 aktiviert und das in Gang gesetzte Inflammationsgeschehen führt zu einer ausgedehnten Gewebeschädigung. Beim TLR4 handelt es sich um ein Membranprotein. Es gehört zur Familie der Toll-like Rezeptoren und ist ein Bestandteil der Pattern recognition Familie. Zur quantitativen Bestimmung von Zell-freiem Hämoglobin muss dieses vom Total-Hämoglobin des Blutes getrennt werden.

15.5.3.1 Indikation

Hämolytische Erkrankungen

• Extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO)
• Kardiopulmonaler Bypass
• Dialyse
• Sichelzell-Erkrankung.

15.5.3.2 Bestimmungsmethode

Spektralphotometrische Methoden

Prinzip: Messung des Hb bei verschiedenen Wellenlängen und Einsatz unterschiedlicher Korrekturverfahren zur Elimination von Störfaktoren, z.B. von erhöhtem Bilirubin oder erhöhten Triglyceriden. Durchgeführt wird eine dreifach Wellenlängen Messung, z.B. bei 415 nm, 380 nm, 450 nm /16/ oder bei 578 nm, 562 nm und 598 nm /17/.

Immunnephelometrie

Verwendet wird polyklonales Antiserum vom Kaninchen, gerichtet gegen humanes Hämoglobin A. Es besteht keine Kreuzreaktivität mit Myoglobin /18/.

HPLC kombiniert mit Absorptions-Spektrophotometrie

Prinzip: Die Methode arbeitet in zwei Schritten. Zuerst wird Protein gebundenes und freies Hb mittels HPLC getrennt. Die Fraktion des freien Hb wird mit Essigsäure, H₂O₂ und Tetramethylbenzidin versetzt. Es bildet sich ein blauer Farbstoff, der mittels Absorptions-Spektrophotometrie bei 600 nm gemessen wird.

Betrachtung des Plasmas

Sichtbar wird die intravasale Hämolyse ab einer Konzentration des freien Hb von etwa 300 mg/l /19/.

15.5.3.3 Untersuchungsmaterial

Heparinplasma, Citratplasma: 1 ml

15.5.3.4 Referenzbereich

15.5.3.5 Bewertung

Am Ende ihrer Lebenszeit werden gealterte Erythrozyten vom retikuloendothelialen System (RES), vor allem der Milz und des Knochenmarks phagozytiert. Dabei wird ein kleiner Teil des Hämoglobins in das Plasma freigesetzt, dissoziiert zum Dimer, wird an Haptoglobin gebunden und zur Katabolisierung wieder in das RES zurück transportiert.

Die tägliche Hämolyse von 1 % der Erythrozytenmasse, entsprechend etwa 3 g Hb, zusätzlich zum normalen Erythrozytenabbau, führt zum vollständigen Verschwinden von Haptoglobin aus dem Plasma und der Nachweisbarkeit von freiem Hb /21/.

Der Anstieg des freien Hb ist ein empfindlicherer Indikator der intravasalen Hämolyse als der Anstieg der LDH. So verursacht bei einer LDH Aktivität von 165 U/l erst eine Hämolyse, die zu einer freien Hb-Konzentration von 800 mg/l führt, einen Anstieg der LDH um 58 % und damit über den oberen Referenzbereichswert /22/.

Die Bestimmung des freien Hb ist eine wichtige Messgröße zur Beurteilung des Ausmaßes der Hämolyse, z.B. bei Herzklappenprothese, extrakorporalem Kreislauf beim herzchirurgischen Eingriff, Hämoglobinopathie, erythrozytärem Membran- und Enzymdefekt, Intoxikation von Arzneimitteln und Schwermetallen, Malaria.

Die Einordnung der Untersuchungen zum Nachweis einer intravasalen Hämolyse nach ihrer diagnostischen Sensitivität ergibt, unter der Voraussetzung, dass keine Akute-Phase Reaktion vorliegt, folgende Reihenfolge:

Haptoglobin nicht nachweisbar > Retikulozytenerhöhung > Erhöhung des freien Hämoglobins > LDH Erhöhung > Bilirubin Erhöhung.

Bei leichter akuter Hämolyse ist nur das Haptoglobin erniedrigt, etwa 3 Tage später erfolgt ein leichter Anstieg der Retikulozyten. Bei mittelgradiger Hämolyse erfolgt ein Anstieg des freien Hb und evtl. der LDH, insbesondere der Isoenzyme 1 und 2.

Eine schwere Hämolyse zeigt immer eine Erhöhung von LDH und wenn die Hämolyserate über 5 % ist, entsprechend einer täglichen Hb-Freisetzung von über 15 g, kommt es auch zu einer Erhöhung des unkonjugierten Bilirubins.

Die Abgrenzung der in vivo- von der in vitro-Hämolyse kann durch die Bestimmung von Kalium und Haptoglobin erfolgen. Eine hämolytische Probe mit Erhöhung des Kaliums und normalem Haptoglobinwert ist verdächtig auf das Vorliegen einer in vitro-Hämolyse.

Siehe auch Tab. 15.5-4 – Hämolyse und freies Hämoglobin im Plasma.

15.5.3.6 Hinweise und Störungen

Antikoagulanz

EDTA darf nicht als Antikoagulanz verwendet werden. Im EDTA-Plasma ist freies Hb etwa 20-fach höher als im Heparinplasma. Serum sollte nicht untersucht werden, da bei der Gerinnung Hb aus den Erythrozyten austritt. Ohne Vorliegen einer intravasalen Hämolyse kann im Serum die Konzentration des freien Hb bis 100 mg/l betragen /18/.

Probe

Die Blutentnahme sollte mit einem luftdicht verschraubbaren Röhrchen erfolgen. Zur Lagerung im Labor soll über dem antikoagulierten Blut ein möglichst geringer freier Luftraum sein /15/.

Bestimmungsmethode /9/

• COHb-Bestimmung: Obwohl COHb ein direkter Biomarker des Ausgesetztseins mit CO ist, kann der COHb-Wert niedrig sein bei Personen, bei denen der Verdacht auf eine CO Vergiftung besteht oder bei Patienten bei denen ein höherer Wert erwartet wird.
• CO-Monitor: CO wird in der Ausatmungsluft bestimmt, und zwar kurz vor dem Ende des Ausatmens.Gemessen wird das Volumen von CO.
• Totales CO (TBCO) im Blut: Ein CO-Anstieg kann neben einer CO-Vergiftung auch durch folgende Effekte bedingt sein: erhöhten oxidativen Stress, veminderte Funktion der Mitochondrien, Entzündungsreaktion im Gehirn.
• Die Pulsoximetrie kann nicht zum Nachweis von CO eingesetzt werden, denn sie ist nicht epfindlich genug. Ihre Anwendung ist gerechtfertigt, wenn der Verdacht auf eine CO-Vergiftung besteht /27/.

Störfaktoren

Hypertriglyceridämie führt bei der spektrophotometrischen Bestimmung zu falsch hohen Werten, da eine konstante Absorption hinzu addiert wird. Auch täuscht die Methämoglobinämie zu hohe Werte von COHb mit dieser Methode vor /6, 15/.

Stabilität

Die Aufbewahrung von Vollblut soll im Kühlschrank oder tiefgefroren erfolgen, eine stärkere Lichtexposition der Probe unterbleiben. Der Gehalt des CO der Probe kann Wochen bis Jahre bei 3 °C oder tiefgefroren konstant bleiben /15/.

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15.6 Retikulozytenzahl und -indices

Lothar Thomas

Die Bestimmung von Retikulozyten im peripheren Blut ist ein Indikator der erythropoetischen Aktivität des Knochenmarks. Die automatisierte Analytik der Retikulozyten umfasst die Bestimmung der Retikulozytenzahl und von Retikulozyten-Indices wie:

• Das Zellvolumen.
• Die zelluläre Konzentration und den Gehalt an Hämoglobin (CHr, Ret_He)
• Das Reifungsmuster der Retikulozyten.

15.6.1 Der Retikulozyt

Der Retikulozyt ist eine unreife rote Blutzelle (RBC) ohne Zellkern. Es handelt sich um eine Übergangszelle vom orthochromatischen Erythroblasten zum kernlosen, reifen Erythrozyten. Der Retikulozyt ist eine RBC, deren RNA-Gehalt noch so hoch ist, dass dieser fluoreszenzoptisch im Durchflusszytometer oder panoptisch im Mikroskop erkannt wird. Um mit mikroskopischer Technik als Retikulozyt identifiziert zu werden, muss die Zelle mindestens zwei blaugefärbte RNA Partikel enthalten, die mikroskopisch ohne Feinfokussierung der Zelle sichtbar sind. Die Partikel sollen nicht am Rand der Zelle liegen, um eine Verwechslung mit Heinz Körpern zu vermeiden /1/.

Die morphologische Klassifikation des Retikulozyten unterscheidet folgende Gruppen /2/:

• Gruppe 0; Normoblasten und Megaloblasten, die beide einen Kern und ein dichtes perinukleäres Retikulum enthalten.
• Gruppe 1; Retikulozyten mit einem Retikulum in Form dichter Klumpen.
• Gruppe 2; Retikulozyten mit einem kranzförmigen Retikulum.
• Gruppe 3; Retikulozyten mit einem diffus verstreuten Retikulum.
• Gruppe 4; Retikulozyten mit einem Retikulum in Form verstreuter Granula und Fragmente. Hier ist das Endstadium des Reifungsprozesses erreicht. Der Retikulozyt verliert die Granula und Fragmente nach und nach und wird zum reifen Erythrozyten.

Bei gesunden Personen gehört im Blut nur ein kleiner Teil Retikulozyten den Gruppen 1 und 2, etwa 30 % der Gruppe 3 und über 60 % der Gruppe 4 an /3/. Bei der hyperregenerativen Erythropoese kommt es zu einer Vermehrung von Retikulozyten der Gruppen 1 und 2 und im Blutausstrich zu einer Polychromasie der Erythrozyten /4/.

15.6.1.1 Reifung der Retikulozyten

Bei Reifung der roten Blutzellen im Knochenmark erfolgt mit Reduzierung der Zellgröße eine zunehmende Kondensation nukleären Chromatins und einer Abnahme der Kerngröße /5, 6/. Wird der Kern pyknotisch, erfolgt die Ausstoßung. Parallel nimmt die Hb Synthese zu. In den Erythroblasten werden die Globinketten in den RNA haltigen Polyribosomen und das Häm in den Mitochondrien gebildet. Die Verknüpfung beider Bestandteile erfolgt mitochondrial /5/.

Die RNA enthaltenden Ribosomen können bis zu 4 Tage in der kernlosen roten Blutzelle im Knochenmark verbleiben. Während dieser Zeit kommt es zur kontinuierlichen Abnahme der Polyribosomen und auch der Hb Bildung. Der Retikulozyt hat ein größeres Zellvolumen als reife Erythrozyten. Da die Hb Synthese noch nicht beendet ist, färbt der Erythrozyt sich nach Pappenheim oder Giemsa-Wright polychromatisch an. Das Auftreten polychromatischer Erythrozyten im peripheren Blut reflektiert die vorzeitige Freisetzung von Erythrozyten aus dem Knochenmark und zeigt eine gesteigerte Erythropoese an /4/.

Die primäre Retikulozytenreifung im Knochenmark erfolgt normal 3 Tage. Dann verlässt der Retikulozyt das Mark und vollendet innerhalb von 1 Tag seine Reifung im peripheren Blut. Mit dem Verlust der Protein synthetisierenden Polyribosomen hört auch die Hb-Bildung auf und die Transformation vom Retikulozyten zum Erythrozyten ist vollzogen /5/.

Nach Pyknose des Kerns können Retikulozyten mit Supravitalfarbstoffen wie Brilliant-Kresylblau oder Neu-Methylenblau angefärbt werden. Gefärbt wird die RNA der Polyribosomen. Eine Darstellung der RNA erfolgt auch mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Thiazolorange, Acridinorange oder Pyronin Y /6/.

15.6.1.2 Störungen der Retikulozytenreifung

Beim akute Blutverlust mit Abfall des Hb Werts unter 80 g/l kommt es zu einer Stresssituation des Knochenmarks und es resultiert eine stark hyperregenerative Erythropoese. Das führt zu folgenden Veränderungen der Reifung:

• Die Retikulozyten verbleiben keine 3-4 Tage, sondern nur 1,5 Tage im Knochenmark und ihre endgültige Reifung vollzieht sich im Blut. Sie sind dann 1,7–3 Tage in der Zirkulation anstatt 0,8–1,2 Tage /7/. Es resultiert eine Erhöhung der Retikulozytenzahl mit einem Shift der Retikulozyten in die Reifungsgruppen 1 bis 3.
• Im peripheren Blut erscheinen Stress-Retikulozyten. Es handelt sich um Retikulozyten mit einem großen Volumen und hohem RNA-Gehalt (Makroretikulozyten). Die aus ihnen entstehenden Erythrozyten haben eine verkürzte Lebenszeit /8/.

15.6.2 Retikulozytenzahl und abgeleitete Indices

Die absolute Retikulozytenzahl und die von ihr abgeleiteten Kenngrößen Retikulozyten-Index und Retikulozyten-Produktionsindex sind Indikatoren der erythropoetischen Aktivität und ermöglichen Rückschlüsse zu deren Effektivität.

15.6.2.1 Indikation

• Beurteilung der erythropoetischen Aktivität nach Diagnose einer Anämie.
• Abgrenzung der hämolytischen oder posthämorrhagischen Anämie (hyperregenerativ) von der Anämie chronischer Erkrankungen (hyporegenerativ).
• Therapiemonitoring (Eisenmangelanämie, megaloblastäre Anämie).
• Untersuchung auf frühe Regeneration nach Knochenmark- oder Stammzell Transplantation.
• Monitoring der Therapie mit Erythropoese stimulierenden Agentien (ESA).

15.6.2.2 Bestimmungsmethode

Es können bestimmt werden:

• Retikulozytenzahl.
• Retikulozyten-Index (Hämatokritkorrektur).
• Retikulozyten-Produktions-Index (Shift-Korrektur).

15.6.2.2.1 Retikulozytenzählung

Mikroskopische Retikulozytenzählung

Prinzip: Durch Färbung unfixierter Zellen mit Vitalfarbstoffen entsteht im unreifen Erythrozyten ein netzförmiges Präzipitat, die Substantia reticulo filamentosa. Dazu wird Vollblut mit einem Vitalfarbstoff (Brillant-Kresyl-Blau oder Neu-Methylenblau) zu gleichen Teilen gut vermischt und auf mehreren Objektträgern ausgestrichen. Nach Lufttrocknung werden unter dem Mikroskop mit Ölimmersion und Okularblende alle Zellen mit bläulichen, fadenförmigen oder granuliertem Präzipitat auf 1.000 Erythrozyten ausgezählt /9/. Die Angabe erfolgt in Prozent.

Automatisierte Retikulozytenzählung

Allen automatisierten Analysensystemen gemeinsam ist das Prinzip der Durchflussmessung, bei der die einzelne Zelle eine Messzelle passiert, die von einem Lichtstrahl durchquert wird. Die Färbung der Retikulozyten geschieht vor der flowzytometrischen Sortierung der Zellen. Einige Analyzer wenden ein Detektionsprinzip an, das auf Lichtabsorption oder Lichtstreuung beruht, basierend auf den Präzipitaten in den Retikulozyten. Andere verwenden fluoreszierende Retikulozytenreagenzien /10/.

Fluoreszenz-aktivierte Zytometrie: Ein Fluoreszenzfarbstoff, z.B. Thiazolorange, Acridinorange, Pyronin Y, bindet an RNA des Retikulozyten. Das Ausmaß der Fluoreszenzemission, die durch Anregung des gebundenen Farbstoffes erzeugt wird, verhält sich proportional dem RNA Gehalt des Retikulozyten und invers zu seiner Reifungsstufe /6/.

Durchflusszytometrie: Die Detektion von Retikulozyten basiert auf dem Prinzip, dass die durch das Fixier- und Färbereagenz bewirkte Präzipitation und Färbung Licht absorbiert oder streut. Als Farbstoffe werden z.B. Methylenblau oder Oxazin verwendet /10/.

Retikulozytenzahl

Die Retikulozytenzahl wird angegeben als:

• Absolute Zahl pro Volumeneinheit.
• Relative Zahl in % (Retikulozytenzahl/100 Erythrozyten).

Berechnung der absoluten aus der relativen Zahl:

• Retikulozyten/μl = Retikulozyten (%) × Eythrozytenzahl (μl) /9/.

15.6.2.2.2 Retikulozyten-Index, RI (Hämatokritkorrektur)

Die Retikulozytenzahl kann, in Relation zu den Erythrozyten, dadurch erhöht sein, dass mehr Retikulozyten im Blut sind oder, dass das Blut weniger Erythrozyten enthält /9/. Deshalb muss die gemessene Retikulozytenzahl auf einen Hämatokrit (Hkt) von 0,45 (45 %) korrigiert werden. Die Korrektur erfolgt nach der Gleichung in Tab. 15.6-1 – Hematokrit-und Shift-Korrektur.

15.6.2.2.3 Retikulozyten-Produktionsindex (Shift-Korrektur)

Retikulozytenwerte, die auf den Hkt korrigiert sind, geben die Retikulozytenproduktion nicht richtig wieder, denn die Retikulozytenzahl kann durch die vorzeitige Freisetzung aus den Knochenmark verändert sein (Shift) /9/. Wenn Shift-Zellen (polychromatische Erythrozyten) in der Färbung nach Wright im Ausstrich erkannt werden, muss eine empirische Korrektur der roten Blutzellreifung erfolgen. Die Reifungszeit beträgt abhängig vom Hkt:

• 1 Tag bei Hkt 0,45 (45 %).
• 1,5 Tage bei Hkt 0,35 (35 %).
• 2 Tage bei Hkt 0,25 (25 %).
• 3 Tage bei Hkt 0,15 (15 %).

Die Kalkulation des Shifts bzw. des Retikulo­zyten­produktions-Index (RPI) zeigt Tab. 15.6-1. Hat der Patient einen Hkt korrigierten Retikulozyten-Index (RI) von 10 % und einen Hkt von 25 %, so ist der RPI 10/2 = 5. Ein Shift des RPI > 3 wird als eine adäquate erythropoetische Antwort angesehen, ein Wert < 2 ist inadäquat. Die erwarteten unteren Grenzwerte einer adäquaten erythropoetische Antwort in Abhängigkeit vom Hkt zeigt Tab. 15.6-2 – Erwartete untere Grenzwerte von RPI und Retikulozytenzahl in Abhängigkeit vom Hkt.

15.6.2.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 1 ml

15.6.2.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 15.6-3 – Retikulozyten-Referenzbereiche.

15.6.2.5 Bewertung

Die Bestimmung der Retikulozytenzahl absolut und relativ sowie des RI und RPI sind wichtige Indikatoren der erythropoetischen Aktivität des Knochenmarks und der Verkürzung der Erythrozytenlebenszeit.

15.6.2.5.1 Absolute Retikulozytenzahl

Die Aussage der Retikulozytenzahl pro Volumen ist ein Maß der Effektvität des Knochenmarks zur Bildung von Erythrozyten. Das gilt für eine normoregenerative Erythropoese (Steady state), die hyperregenerative und die hyporegenerative /15/.

15.6.2.5.2 Relative Retikulozytenzahl

Die Aussage der Retikulozyten in % der Erythrozyten ist ein Maß der Erythrozytenlebenszeit. Sie ermöglicht bei chronischen Anämien im Steady state eine Abschätzung der Erythrozytenlebenszeit-Verkürzung. Je höher die Retikulozyten (%), desto niedriger die Lebenszeit /15/.

15.6.2.5.3 Retikulozyten-Index (RI)

Der RI ermöglicht im steady state bei chronischen Anämien eine Abschätzung der Verkürzung der Lebenszeit der Erythrozyten im Vergleich zu normal. Je höher der RI, desto kürzer ist die Lebenszeit.

15.6.2.5.4 Retikulozyten-Produktions-Index (RPI)

Ein erhöhter Retikulozytenwert ist ein Indikator für /15/:

• Die erhöhte Bildung von Erythrozyten bei Verkürzung der Erythrozytenlebenszeit.
• Eine verlängerte Verweildauer der Retikulozyten im peripheren Blut.

Der RPI reflektiert die Steigerung oder Verminderung der Erythropoese um ein Vielfaches der Norm. Eine Steigerung der Reaktivität der Erythropoese ist bei ESA Stimulierung bis um das 8 fache möglich. Eine Hyporeaktivität liegt vor, wenn nur eine Steigerung der Reaktivität von weniger als 2 fach möglich ist. Bei fallendem Hkt nimmt die Erythropoetin stimulierte Reaktivität der Erythropoese zu. Bei hyperreaktiver Erythropoese ist die Reifungszeit der Retikulozyten im Knochenmark proportional zur Absenkung des Hkt verkürzt, und die Verweilzeit im periphere Blut verlängert. Die Hkt abhängige längere Verweildauer im Blut wird durch den RPI berücksichtigt /1/. Ohne Korrektur der verlängerten Verweilzeit wird bei zunehmender Anämie die Erythrozytenbildung durch die absolute Retikulozytenzahl zu hoch eingeschätzt und die Erythrozytenlebenszeit durch die relative Retikulozytenzahl zu niedrig. Mindestwerte des RPI und der Retikulozytenzahl, die bei intakter Markfunktion erzielt werden sollten sind in Tab. 15.6-2 – Erwartete untere Grenzwerte von RPI und Retikulozytenzahl in Abhängigkeit vom Hkt angegeben /16/. Bei einem Hkt von 0,35 weist ein RPI um ≥ 2 auf eine regenerative, ein RPI ≥ 3 auf eine hyperregenerative Erythropoese hin. Ein RPI < 2 zeigt eine hyporegenerative Erythropoese, z.B. Anämie chronischer Erkrankungen durch Entzündung, Infektion, malignen Tumor oder eine intrinsische Hypoplasie der Erythropoese an.

15.6.2.5.5 Retikulozytose

Bei einem Hämatokrit unter 0,30 muss der RPI bestimmt werden, da sonst zu häufig eine Retikulozytose diagnostiziert wird /15/.

Eine wichtige Bedeutung kommt der Retikulozyten­bestimmung bei den normozytären Anämien zu (Abb. 15.6-1 – Diagnostische Hinweise bei normozytären Anämie durch Bestimmung der Retikulozyten). Eine Retikulozytose bei makrozytärer Anämie weist auf den anbehandelten Folat- oder Vitamin B₁₂-Mangel hin (Abb. 15.6-2 – Diagnostische Hinweise bei makrozytärer Anämie durch Bestimmung der Retikulozyten­) /17/. Bei den mikrozytären Anämien sollte die Retikulozytenzahl erst dann bestimmt werden, wenn der Wert des Ferritins oder der Transferrinsättigung keine eindeutige Aussage liefern (Abb. 15.6-3 – Diagnostische Hinweise bei mikrozytärer Anämie durch ­Bestimmung der Retikulozyten). Erkrankungen und Zustände mit Retikulozytose zeigt Tab. 15.6-4 – Erkrankungen und Zustände mit Retikulozytose.

15.6.2.5.6 Retikulozytopenie

Sie ist das Zeichen einer hyporegenerativen Erythropoese und kommt vor bei:

• Mangelanämien, z.B. Eisen-, Kupfer-, Vitamin B₆-, Vitamin B₁₂- und Folatmangel.
• Der Anämie chronischer Erkrankungen (Infektion, chronische Entzündung, maligner Tumor) auf Grund einer durch inflammatorische Zytokine induzierten Hypoproliferation der Erythropoese /18/.
• Der chronischen Niereninsuffizienz. Bedingt durch eine ineffektive Wirkung von Erythropoetin ist die Proliferation der Erythropoese vermindert /19/.
• Dem myelodysplastischen Syndrom (MDS). Die Anämie beim MDS ist hypoproliferativ mit einer peripheren Retikulozytopenie trotz eines hyperzellulären Marks mit bis zu 90 % ineffektiver Erythropoese /20/. Häufig ist die Konzentration des löslichen Transferrinrezeptors erhöht.
• Den kongenitalen dyserythropoetischen Anämien. Es werden drei Typen unterschieden. Sie haben eine moderate Anämie mit einem Hb-Wert um die 90 g/l bei verminderter bis normaler Retikulozytenzahl /21/.

15.6.2.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Mikroskopische Methode: Die mikroskopische Auswertung des Blutausstrichs ist ungenau und hat einen intralaboratoriellen VK von etwa 25 % und einen interlaboratoriellen von 25–50 %, wenn die Retikulozytenzahl auf 1.000 Erythrozyten bestimmt wird /9/. Bei der Färbung der Ausstriche werden auch Howell-Jolly Körperchen, Heinz Körper und Malariaparasiten mit erfasst /9/.

Hämatologie-Analyzer: Die Zählungenauigkeit ist geringer, da etwa 10.000 Zellen gezählt werden. Der interlaboratorielle VK für eine Retikulozytose über 2,5 % beträgt 24 % und ist etwa halb so groß wie bei der mikroskopischen Zählung bei gleichem Retikulozytenanteil /26/.

Gestört wird die flowzytometrische Methode durch Howell-Jolly Körperchen, kernhaltige rote Blutzellen, Sichelzellen, Riesenthrombozyten, Kälteagglutinine, Parasiten (Malaria, Babesiose), Plättchenklumpen. Die zytometrischen Methoden unterscheiden sich systematisch auf Grund der Verwendung unterschiedlicher Farbstoffe /27/.

Stabilität

Abhängigkeit von der Färbe- und Bestimmungsmethode. Bei 20 °C Abfall nach 24 h, bei 4 °C Lagerung bis zu 72 h und mehr /27/.

15.6.3 Retikulocyte Maturity Index und Immature Reticulocyte Fraction

Der Reticulocyte Maturity Index (RMI) und die Immature Reticulocyte Fraction (IRF) sind arbiträre Messgrößen zur Quantifizierung der Reifungsstufen der Population von Retikulozyten. Die Untersuchung beruht auf der Bestimmung der Konzentration der RNA in der Substantia granulo- filamentosa der Retikulozyten. Gemessen wird die Intensität des Absorptions- oder Fluoreszenzsignals. Unreife Formen haben im Vergleich zu reifen Formen einen höheren Gehalt an RNA. Eine Zunahme unreifer Retikulozyten im Blut führt zum Anstieg von RMI und IRF.

15.6.3.1 Indikation

Beurteilung der erythropoetischen Aktivität:

• Bei Anämien.
• Nach Knochenmark Transplantation und nach Chemotherapie.

15.6.3.2 Bestimmungsmethode

Reticulocyte Maturity Index (RMI)

Hämatologie Analyzer zur Retikulozytenzählung nutzen die Eigenschaften von spezifisch und schnell an Nukleinsäuren bindende Stoffe wie Ethidiumbromid, Auramin O (Sysmex), CD4K530 (Abbott), Oxacin 750 (Siemens) oder Neu-Methylenblau (Beckman Coulter). Die Lichtenergie eines Lasers wird z.B. von den Fluoreszenzfarbstoffen Auramin O oder Ethidiumbromid absorbiert und das nach Anregung emittierte Lichtsignal in Relation zu einem Streulichtsignal in einem Koordinatensystem aufgetragen. Gewöhnlich wird die Population der Retikulozyten durch entsprechende Schwellenwertsetzung in die drei Reifungsstufen Low Fluorescence Reticulocytes (LFR), Medium Fluorescence Reticulocytes (MFR) und High Fluorescence Reticulocytes (HFR) unterteilt (Abb. 15.6-4 –Einteilung der Retikulozyten in Reifungsstadien) /28/.

Gesunde Personen haben gewöhnlich nur Retikulozyten der LFR Fraktion. Im Gegensatz zu den Fluoreszenzmethoden wird bei anderen Hämatologie Analyzern die Absorption von Neu-Methylenblau gemessen oder die Eigenschaft von Oxacin 750 genutzt, nach Bindung an die RNA seine Farbe und damit die Absorption zu ändern.

Immature Reticulocyte Fraction (IRF)

Das Verhältnis der unreifen Fraktion zu allen Retikulozyten wird gebildet [IRF% = HFR (%) + MFR (%)].

15.6.3.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 1 ml

15.6.3.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 15.6-5 – RMI and IRF Referenzbereiche.

15.6.3.5 Bewertung

Das Reifungsstadium der Retikulozyten im peripheren Blut ist vorwiegend abhängig von:

• Dem Schweregrad der Anämie.
• Dem Eisen-, Vitamin B₁₂- und Folsäurestatus.
• Der Stimulation mit Erythropoetin.
• Der Einbeziehung des Knochenmarks in ein inflammatorisches Geschehen.

Der RMI oder IRF zeigen keine klare Beziehung Bildung der Erythozyten oder Verkürzung und ihrer Lebenszeit. Sie weisen aber unter nicht Steady-state Bedingungen frühzeitig auf eine beginnende Regeneration oder Suppression der Erythropoese oder deren Ansprechen auf eine Therapie mit ESA hin /15/. Die diagnostische Wertigkeit des RMI in Kombination mit der Retikulozytenzahl ist gezeigt in Tab. 15.6-6 – Diagnostische Bedeutung von Retikulozytenzahl und Retikulozyten-Reifungsindex /32/.

15.6.3.5.1 Akute Blutung

In Abhängigkeit vom Abfall des Hb ist die Reifungszeit der Retikulozyten im Knochenmark verkürzt, es treten vermehrt unreife Retikulozyten in das Blut über. RMI und IRF nehmen zu auf Grund eines erhöhten Anteils von MFR und HFR /10/.

Bei größeren akuten Blutverlusten steigen beide Messgrößen schon nach 5–8 h an, während der Anstieg der Retikulozyten erst nach 24–48 h signifikant ist.

15.6.3.5.2 Renale Anämie, perniziöse Anämie, myelodysplastisches Syndrom

Die Reifungszeit der Retikulozyten im peripheren Blut ist verlängert. Patienten mit diesen Erkrankungen haben eine niedrige Retikulozytenzahl bei erhöhtem RMI und IRF /10/.

15.6.3.5.3 Knochenmark Transplantation

Bei der allogenen und heterologen ­ Trans­plantation des Knochenmarks und Chemotherapie wird ein Anstieg der HFR, z.B. über 2 %, als Indikator einer Erholung des Marks angesehen /30/. Erreicht am 21. Tag nach Transplantation die Retikulozytenzahl einen Wert von 15 × 10⁹/l und die HFR einen Wert von 0,5 × 10⁹/l, zeigt dies das Funktionieren des Transplantates zu 100 % an /32/.

Gegenüber dem Anstieg polymorphkerniger Granulozyten und der Retikulozytenzahl zeigen RMI und IRF jedoch keine eindeutigen Vorteile /31/.

15.6.3.6 Hinweise und Störungen

Unreife Retikulozyten sind unterschiedlich definiert. In einigen Studien wird darunter nur die Fraktion der HFR verstanden, in anderen die Summe von HFR und MFR. Zur Ermittlung der IRF werden die HFR- und die MFR-Fraktion herangezogen /31/.

Bestimmungsmethode

Die Methoden an den verschiedenen Hämatologie Analyzern sind nicht vergleichbar, da keine Standardpräparation von Retikulozyten zur Verfügung steht und jeder Hersteller unterschiedlich kalibriert. Da die HFR Fraktion normalerweise nur wenige Prozent der Retikulozyten ausmacht, werden bei 50.000 gezählten roten Blutzellen etwa 500 Retikulozyten sein, von denen nur wenige in das Fenster HFR fallen. Es kann deshalb zu erheblichen Störungen mit falsch positivem HFR Ergebnis kommen durch große Blutplättchen, Leukozyten, Erythroblasten, Erythrozyten mit Malariaparasiten oder Howell-Jolly Körperchen /31/.

15.6.4 Retikulozytenindices

Die Retikulozytenanalytik wurde von der Zählung der Retikulozyten erweitert um die Bestimmung der Retikulozytenindices (Volumen, Hämoglobinkonzentration und Hämoglobingehalt) /33/.

15.6.5 Mittleres zelluläres Volumen der Retikulozyten (MCVr)

Während der Reifung der erythropoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark nimmt deren Volumen kontinuierlich ab. Beim Retikulozyten erfolgen die stärksten Abnahmen:

• Im Knochenmark vom Stadium 0 (orthochromatischer Erythroblast) zum Stadium 1 (Retikulozyt mit einem Retikulum in Form eines dichten Klumpens), auf Grund des Verlusts des Zellkerns.
• Im Blut beim Übergang vom Stadium 4 (Retikulozyt mit einem Retikulum mit wenigen Granula oder Fragmenten) in die reifen Erythrozyten. Im Blut ist der Retikulozyt mit einem Durchmesser von 8,5 μm etwa 1–1,5 μm größer als der Erythrozyt und mit einem MCVr von im Mittel 106 fl im Vergleich zum mittleren MCV der Erythrozyten von 88 fl auch um etwa 20 % voluminöser.

15.6.5.1 Indikation

• Verdacht auf Stresserythropoese nach akuter Blutung, mangelnder Sauerstoffversorgung, Überstimulierung des Knochenmarks durch Therapie mit ESA.
• Beurteilung des therapeutischen Ansprechens bei Mangelanämie (Eisen, Folsäure, Vitamin B₁₂).

15.6.5.2 Bestimmungsmethode

Prinzip: Zur Messung am Advia 120 Hämatologie Analyzer wird EDTA Blut mit einem Retikulozyten Reagenz verdünnt. Es handelt sich um Natriumdodecylsulfat, das die roten Blutzellen in eine sphärische Form zwingt. Die Retikulozyten werden mit Oxazin 750 angefärbt. Da sie eine größere Lichtabsorption haben als die Erythrozyten, können sie von diesen abgetrennt werden. Vermittels flowzytometrischer Analyse wird durch Messung der Streuung von Laserlicht das Zellvolumen und die Hb-Konzentration der Retikulozyten ermittelt /31/.

Bei den Hämatologie Analyzern von Sysmex wird das MCV der Retikulozyten aus der Vorwärtsstreuung der Fluoreszenz markierten Retikulozyten abgeleitet.

15.6.5.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 1 ml

15.6.5.4 Referenzbereich

Erwachsene /34/: 92–120 fl

15.6.5.5 Bewertung

Die Verminderung des MCVr ist typisch für die Anämie durch Eisenmangel, die Erhöhung für die Folsäure- und Vitamin B₁₂-Mangelanämie. Makroformen der Retikulozyten treten bei Stresssituation der Erythropoese, z.B. bei akuter Hypoxie auf.

15.6.5.5.1 Stress Erythropoese

Makroformen der Retikulozyten haben ein MCVr, das um mehr als 27 % größer ist als das der Erythrozyten /4/. Das MCVr kann im Vergleich zum MCV der Erythrozyten bis zu 3-fach erhöht sein. Makroformen der Retikulozyten treten unter Situationen durch Stress auf und werden auch als Stressretikulozyten bezeichnet.

Im Blutausstrich können Stress Retikulozyten als polychromatische Erythrozyten nachweisbar werden. Sie treten auf:

• 5–8 h nach stärkeren akuten Blutungen.
• Beim Aufenthalt in großer Höhe.
• Als Antwort der erfolgreichen Therapie einer Eisenmangel-Anämie in der frühen Phase (ersten 2–3 Tage).
• Als Response auf eine Therapie mit Erythropoese stimulierende Agentien (ESA). Die Gabe von ESA führt bei Personen mit normalem Eisenstatus und ohne Akute-Phase Reaktion zu einem Anstieg der Retikulozytenzahl und des MCVr, die Hb-Konzentration des Retikulozyten (CHCMr) nimmt jedoch ab. Entwickelt sich bei Personen mit nicht ausgeglichenen Eisenstatus eine Eisen-restriktive Erythropoese, so kommt es zu keinem Anstieg des MCVr und es werden kleine Retikulozyten gebildet.

15.6.5.5.2 Hämolytische Anämie

Bei akuter und massiver hämolytischer Anämie, z.B. einer Autoimmunhämolyse, kann es zu einer verstärkten endogene Synthese von Erythropoetin mit erheblicher Stimulation der Erythropoese und Ausbildung einer Eisen-restriktiven Erythropoese kommen. Als deren Folge resultiert eine inadäquat niedrige Retikulozytenbildung. Das MCVr ist erniedrigt und es resultiert eine Inversion des Verhältnisses MCVr/MCV, das normalerweise über 1,0 ist /35/. In Phlebotomie-Untersuchungen wurde gezeigt, dass diese Situation etwa 2 Tage nach Erniedrigung der Transferrin-sättigung auftritt.

15.6.5.5.3 Folsäure- und Vitamin B12-Mangelanämie

Bei beiden Anämien besteht eine Makrozytose der Erythrozyten und der Retikulozyten und das Verhältnis MCVr/MCV ist über 1,0. Bei Behandlung der Anämie zeigt eine Inversion des Verhältnisses das Ansprechen des Marks an. Ursache ist die früherzeitige abnehmende Makrozytose der Retikulozyten als die der Erythrozyten. In einer Studie /35/ hatten nach 17-tägiger Behandlung mit Vitamin B₁₂ die gebildeten Retikulozyten einen MCVr von 108,8 fl, während der MCV noch 109,8 fl betrug, da die meisten Erythrozyten schon vor Beginn der Therapie gebildet worden waren.

15.6.6 Hämoglobingehalt der Retikulozyten (CHr, Ret-H_e)

Retikulozyten haben einen höheren Flüssigkeitsgehalt, einen um 1–3 pg höheren Hb-Gehalt und ein bis zu etwa 20 % größeres Volumen als Erythrozyten. Die Folge ist, dass sie hypochromer als die Erythrozyten sind.

15.6.6.1 Indikation

• Diagnostik der Eisen restriktiven Erythropoese.
• Beurteilung des Behandlungserfolgs einer Eisenmangelanämie.
• Monitoring des Eisenbedarfs der Erythropoese unter Therapie mit ESA.

15.6.6.2 Bestimmungsmethode

Am Advia 120 wird die Hb-Konzentration des einzelnen Retikulozyten (CHCMr) gemessen und der Hb-Gehalt (CHr in pg) nach der Gleichung CHr = MCVr × CHCMr berechnet /31/. Zusätzlich kann der Hb-Gehalt der Retikulozytenfraktion (RFHb) nach der Gleichung RFHb = Retikulozytenzahl × CHr ermittelt werden.

An Sysmex Hämatologie Analyzern wird der Ret-H_e bestimmt. Die Intensität des Vorwärtsstreulichts von Fluoreszenz markierten Retikulozyten korreliert mit ihrem Hb-Gehalt. Die Angabe erfolgt in pg /36/.

15.6.6.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 1 ml

15.6.6.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 15.6-7 – Referenzbereiche für Retikulozyten-Hämoglobin.

15.6.6.5 Bewertung

CHr und Ret-H_e sind Marker zur Bestimmung des aktuellen Eisenbedarfs der Erythropoese. Ein Wert unter 28 pg zeigt eine Eisen restriktive Erythropoese an. Beginnt diese, nehmen CHr und Ret-H_e innerhalb von 48–72 h ab. Andere Marker wie die %HYPO oder biochemische Marker des Eisenstoffwechsels zeigen frühestens nach 10–20 Tagen Veränderungen, der MCV und MCH der Erythrozyten erst nach 2–3 Monaten.

15.6.6.5.1 Eisenmangel

Die Erkennung eines Eisenmangels, bevor es zur Entwicklung einer mikrozytären hypochromen Anämie kommt, ist wichtig zur Vermeidung systemischer Komplikationen des Eisenmangels. Klassische biochemische Parameter zur frühen Diagnostik des Eisenmangels sind die Bestimmung von Ferritin, der Transferrinsättigung und des löslichen Transferrinrezeptors im Serum. Bei Kindern, Jugendlichen im Wachstumsschub, Ausdauersportlern, Frauen im menstruationsfähigen Alter und Mehrfachblutspendern kann der Ferritinwert als Indikator eines Eisenmangels kritisch sein, da diese Personen schon niedrige Werte trotz noch ausreichenden Eisenversorgung haben /41/.

Bei gesunden Personen, die mit ESA behandelt wurden, konnte gezeigt werden, dass die Abnahme von CHr und Ret-H_e frühe Indikatoren eines Eisenmangels der Erythropoese sind /42/. Schon 3–5 Tage nach Beginn der Therapie mit ESA kam es zu einem signifikanten Abfall des CHr bzw. Ret-H_e.

In der Diagnostik des Eisenmangels bei Kindern hat der CHr einen höheren Vorhersagewert als die biochemischen Marker des Eisenmangels /43/.

Der Anteil hypochromer Retikulozyten (CHCMr unter 270 g/l), der normalerweise unter 25 % beträgt, ist ebenfalls ein früher Indikator einer Eisen restriktiven Erythropoese. Mit Progression des Eisenmangels nehmen der CHr bzw. Ret-H_e ab und der Anteil hypochromer Retikulozyten zu.

15.6.6.5.2 Funktionseisen Mangel

Der funktionelle Eisenmangel ist ein Status der Eisen-verarmten Erythropoese beruhend auf ungenügender Mobilisation von Eisen aus den Speichern bei einem erhöhten Bedarf an Eisen. Die Anämie beim funktionellen Eisenmangel bildet sich aus durch eine Steigerung der Erythropoese, bedingt durch eine endogene oder exogene Stimulation der Erythropoese. Es besteht eine Imbalance zwischen der Eisenanforderung des Knochenmarks und der Eisenverfügbarkeit. Eisen wird in den Makrophagen des retikuloendothelialen Systems sequestriert. Die Eisenspeicher sind normal oder erhöht (Ferritin 100–299 μg/l) in Kombination mit einer Transferrinsättigung unter 20 %.

Beim Funktionseisen Mangel liegt also eine Situation vor, mit einem Eisenbedarf des Knochenmarks, der die Freisetzung von Eisen aus den Speichern und die Transportkapazität von Transferrin überschreitet. Als Folge werden hypochrome Retikulozyten und Erythrozyten gebildet. Der Hb-Gehalt des Retikulozyten (CHr, Ret_He) ist vermindert /44/.

Bei Hämodialysepatienten unter Therapie mit ESA ist die Verlaufsbeurteilung von CHr und Ret_He ein besserer Indikator der Eisenversorgung als die biochemischen Marker des Eisenstoffwechsels (Ferritin, Transferrinsättigung).

Ein CHr und Ret_He unter 28 pg zeigen eine Eisen restriktive Erythropoese an /41/:

• Bei Tumorpatienten, bedingt durch Blutung, Hämolyse und zytostatische Therapie.
• Bei der Anemia of chronic disease (ACD). Ausgelöst durch eine Inflammation induziert IL-6 in den Hepatozyten die Synthese des Peptids Hepcidin, das eine verstärkte Eisenretention in den Makrophagen und eine verminderte intestinale Eisenabsorption bewirkt. Dadurch wird der Eisenturnover vermindert mit der Folge einer Eisen restriktiven Erythropoese, die sich bei 5–10 % der ACD Patienten entwickelt. Die Retikulozyten und Erythrozyten haben einen verminderten Hb-Gehalt, meist aber noch einen normalen MCV-Wert.
• Bei Dialysepatienten, der Grenzwert der Eisen restriktiven Erythropoese beträgt 29 pg /45/.

Ein Mangel an Funktionseisen liegt auch vor, wenn der CHr oder Ret_He kleiner als der MCH-Wert der Erythrozyten ist (CH-Inversion) /37/.

15.6.6.5.3 Diagnostisches Diagramm

Die Entstehung des Eisenmangels und des Mangels an Funktionseisen in Abhängigkeit von der Speichereisen-Reserve kann anhand des diagnostischen Diagramms in Abb. 15.6-5 – Diagnostisches Diagramm zur Beurteilung, Monitoring und Therapie des Eisenstatus erkannt und verfolgt werden. In dem Diagramm dient der Ferritin-Index (sTfR/log¹⁰ Ferritin) als Indikator der Speichereisen-Reserve (Eisenangebot), da er eine gute Korrelation zum histologisch darstellbaren Eisen des Knochenmarks zeigt. Der CHr bzw. Ret_He sind Indikatoren des Eisenbedarfs der Erythropoese /41/. In einer Studie /46/ war bei klassisch serieller Bestimmung von hämatologischen und Parametern und Markern des Eisenstoffwechsels primär eine Differenzierung der Anämie in 32 % der Fälle nicht möglich, bei Anwendung des Diagramms aber nur zu 14 %. Das Konzept des Diagramms und die Behandlungsvorschläge der verschiedenen Anämieformen haben sich in einer Therapiestudie an Tumorpatienten als wertvoll erwiesen /47/.

15.6.6.5.4 Sichelzellanämie

Bei der Sichelzellanämie ist die Hb-Konzentration des Retikulozyten (CHCMr) erhöht und in der Regel über 380 g/l. Unter Therapie mit Hydroxyharnstoff kommt es in den ersten 2 Wochen zu einem Abfall der CHCMr auf Grund einer verbesserten Hydratisierung der Sichelzellen, die dadurch nicht mehr so stark zur Sichelzellbildung neigen /48/.

Patienten mit einer Sichelzellanämie haben im Vergleich zu Gesunden einen 2–3 fach höheren Hb-Gehalt der Retikulozytenfraktion (RetHb). Der Hb-Gehalt der roten Blutzellfraktion (RbcHb) ist vermindert. In einer Studie /49/ betrugen die RetHb-Werte von Kontrollpersonen 1,76 ± 0,69 g/l und bei Patienten mit SS4α 6,5 ± 4,2 g/l. Die RbcHb/RetHb Ratio ist ein wichtiger Indikator der Sichelzellanämie. Bei Gesunden und auch bei der Eisenmangelanämie ist die Ratio ≥ 50, bei der Sichelzellanämie < 50. Das RbcHb wird berechnet durch die Subtraktion des RetHb vom Gesamt-Hb.

15.6.6.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

CHr und Ret-H_e sind mit den Hämatologie Analyzern Advia 120 von Siemens und Sysmex Analyzern zu bestimmen, der CHCMr nur am Advia 120. Alle Angaben beziehen sich deshalb auf diese Systeme.

Stabilität

Bei Lagerung der Blutprobe nimmt nach 60 min das MCVr zu und die CHCMr ab, aber CHr und Ret-H_e sind für mindestens 24 h stabil /31/.

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15.7 Hämoglobinopathien

Elisabeth Kohne

Das Hämoglobin (Hb) des Menschen besteht aus der Hauptkomponente HbA und mehreren Minorkomponenten, von denen nur das HbA₂ genetisch determiniert ist, während die sogenannten modifizierten Hämoglobine HbA_1a, HbA_1b und HbA_1c unter exogenen Einflüssen erst sekundär im Erythrozyten entstehen.

Während der Fetalzeit werden zunächst die embryonalen Hämoglobine Hb Gower 1, Hb Gower 2 und Hb Portland gebildet, die ab der 5.–7. Gestationswoche von HbF abgelöst werden. Reife Neugeborene haben etwa 80 % HbF und 20 % HbA. Im Verlauf des ersten Lebenshalbjahrs vollzieht sich allmählich die Umschaltung von Hb, bis nach dem 12. Lebensmonat der bleibende Status des Erwachsenen erreicht wird.

Gemeinsames Strukturprinzip aller Hämoglobine ist deren Zusammensetzung aus 4 Häm Molekülen und den Proteinanteilen (Globin), bestehend aus jeweils zwei Paaren identischer Polypeptidketten /1, 2, 3/. Siehe Tab. 15.7-1 – Normale menschliche Hämoglobine.

Der Begriff Hämoglobinopathien umfasst hereditäre Störungen der Bildung des Blutfarbstoffs, die je nach zugrunde liegendem Defekt klassifiziert werden als

• Thalassämie Syndrome (Synthesemangel des normalen Hämoglobins)
• Anomale Hämoglobine (Strukturvarianten des Hb).

Synthesemangel und Strukturvarianten des Hb werden durch Mutationen und/oder Deletionen der α- und β-Gene verursacht. Wenn Gendefekte eine mangelnde Synthese von Hämoglobin verursachen, kommt es zur Ausbildung einer Thalassämie. In diesen Fällen ist die Hämoglobinstruktur normal. Kommt es zur Bildung von Hb mit veränderter Struktur, resultiert ein anomales Hb. Es gibt auch Misch- oder Kombinationen beider Störungen, z.B. HbSC-Krankheit, HbS-β-Thalassämien oder HbE-α-Thalassämien. Die Erscheinungsformen, die Pathophysiologie und das Krankheitsbild der einzelnen Hb-Muster ist unterschiedlich und somit auch eine klare Einteilung schwierig /2, 4/.

Epidemiologie der Hämoglobinopathien

Hämoglobinopathien gehören mit etwa 7 % Anlageträgern als häufigste monogene Erbkrankheiten zu den großen Gesundheitsproblemen der Weltbevölkerung. Ursprünglich erstreckten sich die wichtigen Verbreitungsgebiete über den Mittelmeerraum, weite Teile Asiens und Afrikas. Von dort ausgehend hat die globale Migration eine Verbreitung in alle Welt gezeitigt. In weiten Teilen Europas werden die Hb-Defekte heute als endemische Krankheiten eingestuft (Tab. 15.7-2 – Prävalenz der Hämoglobinopathie-Genträger) /4, 5/. Auch in Deutschland haben die Hämoglobinopathien erheblich zugenommen und stellen ein Versorgungs relevantes Problem in der Medizin dar. Am häufigsten sind die Thalassämien und Sichelzell Syndrome /4, 5, 6/. Epidemiologische Studien zur Prävalenz gibt es nicht, jedoch wird rechnerisch auf der Basis derzeit verfügbarer Anhaltszahlen von 1 % Genträgern einer Hämoglobinopathie bezogen auf die heute in Deutschland lebende Bevölkerung ausgegangen /4/. Eine Zusammenstellung der hierzulande wichtigsten Hämoglobinopathien in der Reihenfolge ihrer Häufigkeit befindet sich in Tab. 15.7-3 – Wichtige Hämoglobinopathien in Deutschland /5/.

Labordiagnostik

Art und Umfang der Labordiagnostik ergeben sich je nach der Fragestellung, die aus der Anamnese (angeborene Störung/Erkrankung, Familie, ethnische Abstammung), sowie aus den klinischen und hämatologischen Daten resultiert. Bei im Referenzbereich liegenden Werten aller hämatologischen Parameter ist eine Hämoglobinopathie ausgeschlossen. Wenn andererseits die Hämoglobin Analyse bei ganz bestimmten hämatologischen Befunden im Referenzbereich liegende Werte ergibt, muss eine Erweiterung und Spezifizierung des labordiagnostischen Programms in Betracht gezogen werden.

Besonderheiten

Bemerkenswert und typisch für Einwanderungsländer wie Deutschland ist die große Vielfalt der Defekte und hämatologischen Symptome, entsprechend der sehr differenten ethnischen Zusammensetzung der heute hierzulande lebenden Bevölkerung. Die Erscheinungsformen variieren von leichten Hypochromien und Mikrozytosen mit oder ohne Anämie bis hin zu komplexen Krankheitsbildern mit vielfältigen Konstellationen /5/. Diese Besonderheiten bedeuten für die Labormedizin eine große Herausforderung hinsichtlich Methodenarsenal und Kenntnissen zur Interpretation der Befunde.

15.7.1 Indikation

• Mikrozytär hypochrome Anämien nach Ausschluss eines Eisenmangels.
• Chronisch hämolytische Anämien.
• Gefäßverschlusskrisen ungeklärter Ätiologie bei Patienten aus HbS- und/oder HbC-Verbreitungsgebieten.
• Durch Medikamente induzierte Anämien.
• Hämatologisch bedingte Erythrozytosen und/oder Zyanosen.
• Hydrops fetalis Syndrom ungeklärter Ätiologie.
• Genetische- und präventivmedizinische Fragestellungen: Familienuntersuchung, Partnerdiagnostik für genetische Beratungen
• Pränatale Diagnostik.

Die ungezielte Durchführung einer Hämoglobinanalyse bei jeder Anämie ist nicht sinnvoll und wirtschaftlich nicht zu rechtfertigen, schon gar nicht bei Personen ohne Migrationshintergrund.

Indikation zur DNA-Analyse

Im Rahmen der Thalassämie-Diagnostik:

• Genetische Typisierung der β-Thalassämia major.
• Molekulare Diagnose der β-Thalassämia intermedia.
• Kombination verschiedener Thalassämie Formen oder von Thalassämien mit Hb Strukturanomalien.
• Verdacht auf stumme β-Thalassämie Anlageträger.
• Diagnostik der α-Thalassämien.
• Genetische und präventivmedizinische Fragestellungen.

Diagnostik von Hb-Strukturanomalien:

• Identitätsbestimmung seltener Anomalien.
• Zur Klärung bei gegebenem Verdacht, jedoch fehlender elektrophoretischer oder chromatographischer Trennung.
• Bei genetischen und präventivmedizinischen Fragestellungen.
• Kombinationsformen verschiedener Hämoglobinopathien untereinander oder mit Thalassämien.

DNA-Analysen sollen bzw. dürfen nur bei Fragestellungen durchgeführt werden, die mit der konventionellen Hb-Analyse nicht geklärt werden können.

15.7.2 Bestimmungsmethode

Die Laboruntersuchungen der Hämoglobinopathien bestehen aus der hämatologischen Basisdiagnostik, klinisch-chemischen Untersuchungen und Analytik der Hämoglobine. Bei gegebener Indikation werden molekulargenetische Untersuchungen zur Bestimmung des jeweils zugrunde liegenden Gendefektes eingesetzt. Das Standardprogramm zur Labordiagnostik von Hämoglobinopathien ist aufgelistet in Tab. 15.7-4 – Standardprogramm zur Labordiagnostik von Hämoglobinopathien.

Bei Bedarf kann die Zuhilfenahme eines Speziallabors erforderlich sein, zumal auch aus wirtschaftlichen Gründen selbst größere Labors den personellen Aufwand und die Ausstattung auf diesem speziellen, ursprünglich rein hämatologischen Gebiet in Grenzen halten werden.

Als Untersuchungsplan für das praktische Vorgehen zur kompletten Analytik der Hämoglobinopathien hat sich der ein Stufenplan bewährt. Siehe Abb. 15.7-1 –Plan für die stufenweise Labordiagnostik der Hämoglobinopathien

15.7.2.1 Hämatologische Basisdiagnostik

Bei Verdacht auf eine Hämoglobinopathie ist die Bestimmung des vollständigen roten Blutbildes mit Retikulozytenzahl, Hb-Wert, Erythrozytenzahl und den Erythrozytenindices MCH, MCV und MCHC obligat. Gute Hinweise liefert auch der RDW Wert (red cell distribution width; Erythrozytenverteilungsbreite), der als Maß für eine Anisozytose beim Eisenmangel meist erhöht ist, während bei den Minor Thalassämien normale RDW Werte gesehen werden (Abb. 15.7-2 – Anwendung der RDW Werte zur Diagnostik der Thalassämia minor).

Diagnostisch wertvolle Informationen werden durch die Beurteilung von Präparaten des Blutausstrichs erhalten, weil die Thalassämien und die meisten Hämoglobinstruktur-Anomalien charakteristische Veränderungen der Erythrozytenmorphologie aufweisen /2/.

15.7.2.2 Klinisch-chemische Untersuchungen

Diese umfassen Parameter des Eisenstatus, den Wert des Ferritins und die Transferrinsättigung, des weiteren (je nach Fragestellung) die Hämolyse-Parameter Bilirubin, Haptoglobin, LDH und den Coombs-Test.

15.7.2.3 Hämoglobinanalysen

Siehe auch Lit. /2, 7, 8, 9, 10, 11, 12/

Hb-Elektrophorese

Bei der üblichen Routine-Elektrophorese (Mikrozonen-Elektrophorese) werden Zelluloseazetatfolien als Trägermedium und ein alkalisches Tris-EDTA-Borat-Puffersystem mit pH 8,5 verwendet (Abb. 15.7-3 – Trennschema normaler und anomaler Hämoglobine; Mikrozonen-Elektrophorese). Hiermit werden nicht normale Hämoglobinfraktionen allerdings nur dann von den normalen abgetrennt, wenn ein elektrischer Ladungsunterschied gegeben ist. Mit der sauren Agarosegel-Elektrophorese in Maleinsäurepuffer pH 6,1 als ergänzende Elektrophorese Technik können Hämoglobine getrennt werden, die im alkalischen System gemeinsam wandern.

HPLC

Eine optimale Methode zur Trennung normaler und abnormer Blutfarbstoffe ist die HPLC (Kationen- und Anionenaustauscher-Systeme). Die HPLC ist auch die Methode der Wahl für quantitative Analysen aller trennbaren Hb-Fraktionen.

15.7.2.4 Bestimmung von HbF und HbF-Zellen

Die klassische Methode zur exakten Quantifizierung des HbF-Anteils ist die Alkalidenaturierung. Zum Nachweis von HbF-Zellen auf in Blutausstrichen (Frage fetomaternale Transfusion, unklare HbF Vermehrungen) dient die Säure-Elutionsmethode /2/. HbA wird aus den Erythrozyten durch einen Zitronensäure-Puffer bei pH 3,2 eluiert während HbF in der Zelle verbleibt und fixiert wird. Im Falle eines negativen HbF-Nachweises ist der Vorgang der Alkalidenaturierung nicht erforderlich. HbF-Bestimmungen können mit hinreichender Genauigkeit auch über die HPLC durchgeführt werden, hierbei werden höhere Werte als mit der Alkalidenaturierung gemessen. Siehe Abb. 15.7-3 – Trennschema normaler und anomaler Hämoglobine; Mikrozonen-Elektrophorese.

15.7.2.5 HbS-Löslichkeitstest

Der Löslichkeitstest ist notwendig zur Abgrenzung des HbS von anomalen Hämoglobinen mit identischer Wanderung in der Elektrophorese, wie HbD oder HbG. In einem Hämolysat zu dem Dithionit zur Entfernung von O₂ hinzugefügt wurde, ist HbS das einzige Hämoglobin das präzipitiert und eine deutliche Trübung bewirkt /2/.

15.7.2.6 Identifizierung anomaler Hämoglobine

Die häufigen Varianten HbS, HbC, HbE und HbD repräsentieren in der täglichen Laborpraxis mehr als 90 % aller Strukturanomalien des Hb /2, 7, 8, 10, 11/. Diese können in der Regel durch die Auswertung der elektrophoretischen Wanderung bzw. der chromatographischen Eigenschaften direkt diagnostiziert werden, bei Bedarf unter Einbeziehung chemischer Testverfahren, z.B. des Löslichkeitstests. Zur Identifizierung der seltenen pathologischen Varianten des Hb werden DNA Analysen eingesetzt.

Molekulargenetische Untersuchungen sollten sich aber auf diejenigen Anomalien von Hb beschränken, die mit den Methoden der konventionellen Hb-Analyse nicht geklärt werden können.

15.7.2.7 DNA-Analysen

Die molekulargenetischen Verfahren sind Tab. 15.7-5 – Basisinformation zu den molekulargenetischen Methoden aufgeführt /13/.

15.7.3 Untersuchungsmaterial

Es werden antikoagulierte Erythrozyten benötigt. Optimal ist EDTA-Blut (in beschichteten Probengefäßen), das bei Bedarf gleichzeitig für die Bestimmung des Blutbildes einschließlich der Erythrozytenmorphologie und für die Erythrozytenenzyme geeignet ist. EDTA-Blut kann ohne wesentlichen Qualitätsverlust einige Tage gelagert werden. Für die routinemäßigen Untersuchungen sind 5 ml Blut ausreichend, größere Volumina werden bei starker Anämie benötigt.

15.7.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 15.7-6 – Referenzbereich der Hämoglobine.

15.7.5 Bewertung

Allgemein bedeutsame Kriterien sind das Alter des Patienten, die ethnische Abstammung, die Familienanamnese und die hämatologischen Befunde. Die Grundformen. der Hämoglobinopathien sind dargestellt in Tab. 15.7-7 – Grundformen der Hämoglobinopathien.

Die Bewertung einer Hämoglobin Analyse umfasst:

• Die Beurteilung quantitativer Veränderungen der normalen Komponenten von Hb, wie sie in Form der HbA₂- und/oder der HbF Vermehrung typisch sind für die Thalassämien.
• Den Ausschluss oder die Sicherung einer anomalen Variante, im positiven Fall auch deren Identifizierung und Quantifizierung. In jedem Fall muss die Frage geklärt werden, ob das nachgewiesene anomale Hämoglobin für die Symptomatik der Krankheit verantwortlich ist oder einen Zufallsbefund ohne krankmachende Bedeutung darstellt.

15.7.5.1 Thalassämie Syndrome

Dieser Begriff beinhaltet alle Mangelzustände der normalen Hämoglobinsynthese. Thalassämien sind weltweit die häufigsten monogenetischen Erkrankungen. Mutationen der Globingene verursachen den Mangel oder das Fehlen von Globinketten und resultieren in einer Thalassämie. Die Mutationen erfolgen in den Genen, die alpha-, beta-, gamma- und delta-Globine kodieren. Insgesamt ist die Synthese von Hämoglobin gestört. Die verschiedenen Genotypen bei der Thalassämie verursachen unterschiedliche Phänotypen. Die Phänotypen variieren von der Thalassämia minor zur Thalassämia major mit milder bis schwerer Anämie. Ehepartner, die beide eine Thalassämie haben, spielen eine große Rolle in der Verbreitung der Thalassämien. Denn die Wahrscheinlichkeit, dass das Kind eines Thalassämie-Ehepaars eine Thalassämia major erwirbt, beträgt 25 %. Unter autosomal rezessiven Bedingungen haben alpha- und beta-Thalassämien die größte Bedeutung. Heterozygote Thalassämieträger sind nicht komplett gesund, denn sie haben Symptome der mikrozytären hypochromen Anämie, die eine Differenzierung zwischen milder Thalassämie, Eisenmangelanämie und refraktärem Eisenmangel erfordert /10, 11, 14, 15, 16/.

15.7.5.1.1 α-Thalassämien

Die α-Thalassämien sind monogene genetische Erkrankungen und beruhen auf einem Defekt der α-Globingene auf dem kurzen Arm des Chromosoms 16. Hämoglobin (Hb) Bart’s hydrops fetalis ist die schwerste Form der α-Thalassämien. Auf der molekularen Ebene, resultieren die α-Thalassämien aus einer teilweisen (α⁺) oder kompletten (α⁰) Deletion oder seltener Mutation eines oder mehrerer Globingene (αα/αα).

Sie kommen vorwiegend in Afrika, den Arabischen Nationen, und in Südost-Asien vor. Sie werden klinisch manifest vor der Geburt. Siehe Tab. 15.7-8 – Zusammenstellung wichtiger Kriterien der α-Thalassämien.

Es gibt vier wichtige Krankheitsbilder der α-Thalassämie anhand der Gene die betroffen sind.

• Die klinisch inapparente α-Thalassämia minima (heterozygote α⁺-Thalassemie, –α/αα). Sie wird diagnostiziert durch die milde Hypochromie bei einer geringen Erniedrigung des Hb-Wertes.
• Die α-Thalassemia minor (heterozygote α⁰-thalassemia, ––/αα, or homozygote α⁺-Thalassemie, –α/–α) mit milder Anämie, Hypochromie und Mikrozytose.
• HbH Erkrankung (compound heterozygote α⁺/α⁰-Thalassämie mit drei inaktiven α-Genen, ––/–α); moderate Hypochromie, hämolytische Anämie mit Splenomegalie. Anämische Krisen sind bedingt durch virale Infektionen und Oxidantien (Medikamente). Komplikationen sind kardiale Probleme, Gallensteine, Unterschenkelgeschwüre und ein Folsäuremangel.
• Hb-Bart’s Hydrops fetalis (homozygote α⁰-Thalassämie) ist die schwerste Form der α-Thalassämien mit schwerer hämolytischer Anämie schon im Uterus bedingt durch einen Synthesemangel der α-Globinketten (––/––). Der Hydrops fetalis ist mit dem Leben nicht vereinbar. Sind beide, Vater und Mutter des Kindes Träger eines α-Globingendefektes haben sie zu 25 % die Chance ein Kind mit Hb-Bart’s Hydrops fetalis zu zeugen, und das bei jeder Schwangerschaft /18/.

15.7.5.1.2 β-Thalassämien

Die β-Thalassämien beruhen auf einer insuffizienten (β⁺) oder abwesenden (β⁰) Bildung von β-Globinketten (Tab. 15.7-9 – Zusammenstellung wichtiger Kriterien der β-Thalassämien). Die Ursachen sind Mutationen im β-Globingen. Die meisten Patienten kommen aus dem Mittelmeerraum, Südosteuropa, den Arabischen Ländern und Asien. Die hämatologischen Symptome manifestieren im Alter von 3–6 Monaten aufwärts.

15.7.5.1.3 β-Thalassämia minor

Ausgangspunkt dieser heterzygoten β-Thalassemie für die Bewertung bildet das rote Blutbild mit den Erythrozyten-Indices MCV und MCH. Die signifikanten Laborparameter der β-Thalassämia minor sind erhöhte HbA₂- und/oder erhöhte HbF-Werte. Liegt der MCH-Wert unter 27 pg und der HbA₂-Wert über 3,5 % wird die Diagnose der heterozygoten β-Thalassämie (Thalassämia minor) gestellt. Die Mehrzahl der β-Thalassämie-Anlageträger haben MCH Erniedrigungen auf 23–19 pg und HbA₂-Werte von 4,0–6,0 %, HbA₂ Erhöhungen auf 6,5–8,0 % kommen vor. In etwa 30 % findet sich gleichzeitig eine HbF-Vermehrung auf 1–3 %, seltener auf über 3,0–15 %. Zu beachten sind die alterssabhängig höheren HbF-Werte bei jungen Kindern mit β-Thalassämia minor. Der Eisenstatus (Ferritin, Transferrin-Sättigung) ist in der Regel normal. Ausnahmen, d.h. ein Eisenmangel bei der β-Thalassämia minor kann bei Kindern und in der Schwangerschaft vorkommen. Ein gleichzeitiger Eisenmangel kann den HbA₂-Wert vorübergehend falsch zu niedrig erscheinen lassen. Im Zweifel ist eine Kontrolle nach Ausgleich des Eisenmangels erforderlich.

15.7.5.1.4 β-Thalassämia major

Es handelt sich um eine homozygote oder gemischt heterozygote β-Thalassemie Diese Erkrankung manifestiert sich frühestens ab einem Alter von etwa drei bis fünf Monaten. Die Anämie ist bei Diagnosestellung variabel, meist liegt der Hb Wert unter 8 g/dl. Die Anämie ist immer hypochrom mit einem MCH-Wert ≤ 22 pg. Der MCV liegt zwischen 50 und 60 fl. Im Blutausstrich sieht man eine, thalassämische Erythrozytenmorphologie mit einer signifikanten Poikilozytose. Die Hämoglobinanalyse zeigt variable Anteile an HbA, HbF und HbA₂. Ganz generell kann man davon ausgehen, dass bei einer HbF-Erhöhung zwischen 20 und 98 % zusammen mit der typischen klinisch-hämatologischen Symptomatik eine Thalassämia major oder Thalassämia intermedia vorliegt.

Der Transfusionsstatus des Patienten muss in die Beurteilung einbezogen werden. Ein zunehmend häufigeres diagnostisches Problem ergibt sich bei Patienten mit behandelter Thalassämia major, d.h. unter Dauertransfusionstherapie. Hierbei lassen sich die spezifisch-diagnostischen Laborparameter der Major Thalassämie nicht mehr nachweisen, vielmehr wird ein Normalbefund erhoben. Eine Diagnosesicherung ist nur mittels DNA-Analyse möglich. Diese Fragestellung betrifft vor allem jugendliche Patienten oder junge Erwachsene, die im Rahmen des Familiennachzugs nach Deutschland kommen.

15.7.5.1.5 β-Thalassämia intermedia

Der Begriff kennzeichnet zunächst eine klinische Diagnose bei Patienten mit einem Hämoglobinmuster wie bei der Thalassämia major, die durch einen fehlenden oder geringeren Transfusionsbedarf auffallen. Die diagnostische Abgrenzung zur Majorthalassämie erfolgt eine Zeit lang durch regelmäßige klinisch-hämatologische Kontrollen. Bei Bedarf wird eine DNA-Analyse durchgeführt. Dabei wird entweder eine hohe Restaktivität der β-Globingene nachgewiesen oder man findet eine klassische Thalassämia major, jedoch mit zusätzlichen Einflussfaktoren, das sind vor allem eine hereditäre HbF-Persistenz oder eine α-Thalassämie.

15.7.5.1.6 Diagnostische Bedeutung einer HbF-Vermehrung

Eine klinisch harmlose, häufig angeborene HbF-Vermehrung ist die hereditäre HbF-Persistenz. Auf die spezifisch diagnostische Bedeutung erhöhter HbF-Werte bei den β-Thalassämien wurde hingewiesen. Auch die δβ-Thalassämien sind durch hohe HbF-Werte gekennzeichnet. Bei der Sichelzellkrankheit hat ein hoher HbF-Wert eine positive prognostische Bedeutung. Unabhängig von den Hämoglobinopathien können HbF-Vermehrungen als Sekundärphänomen bei zahlreichen hämatologischen Erkrankungen vorkommen /2/.

15.7.5.2 Anomale Hämoglobine (Hämoglobin­struktur­varianten)

Diese Gruppe der autosomal dominant vererbten Hämoglobinopathien beruht auf Defekten in der Struktur von veränderten Aminosäuresequenzen in den α- oder β-Ketten. Der Kliniker muss unterscheiden zwischen klinisch harmlosen Hämoglobinanomalien und denjenigen, die eine Erkrankung verursachen. Letztere werden in folgende vier Gruppen eingeteilt /2, 5, 10, 11, 17/:

• HbS: Varianten mit der Tendenz zur Aggregation unter Bildung von Sichelzellen, z.B. Sichelzell Syndrom.
• HbE: Varianten mit einer abnormen Hämoglobinbildung.
• Instabile Hämoglobine, z.B. Hb Köln: Varianten mit der Tendenz zur Präzipitation und Hämolyse.
• Varianten mit einem abnormen Transportvermögen für O₂ und kongenitale Polyzythämien (Hb Johnstown) oder Varianten mit kongenitaler Zyanose wie beispielsweise abnorme Methämoglobine und HbM Anomalien (HbM Iwate).

Die Formen in den letzten beiden Gruppen verursachen eine schwere Erkrankung bei heterozygoten Merkmalsträgern.Bei homozygoten Merkmalsträgern ist die Klinik fatal. Die klinisch bedeutsamsten anomalen Hämoglobine sind HbS, HbE und HbC. Die große Gruppe der seltenen Hämoglobinopathien kommen über die gesamte Welt verstreut isoliert vor. Sie sind meistens vergesellschaftet mit Hämoyse, Polyzythämie oder Zyanose. An solche Hämoglobinopathien sollte gedacht werden, wenn keine andere mögliche hämatologische Erkrankung sich diagnostisch ergeben hat. Sie stehen in der Diagnostik der Hämoglobindefekte an erster Stelle und umfassen mehr als 90 % der Anomalien. Im Routinelabor weniger alltäglich sind HbD- und HbG-Varianten, HbO Arab, HbG und HbJ. Alle anderen Blutfarbstoffdefekte, z.B. die instabilen Hämoglobine (Hb Köln, Hb Zürich) sind extrem selten, sie kommen bei Deutschen und Ausländern mit gleicher Frequenz, d.h. nur bei Einzelpersonen oder in einzelnen Familien vor und sind nicht Bestandteil der Standard Hämoglobindiagnostik /5/. Siehe auch Tab. 15.7-10 – Klinische Klassifikation der wichtigsten pathologischen Hämoglobinvarianten.

15.7.5.2.1 HbS und Sichelzellkrankheit

Der Begriff Sichelzell Krankheit umfasst den gesamten Formenkreis, der durch das pathologische HbS bedingten Hämoglobin Krankheiten (mit einem HbS-Anteil von über 50 %). Folgende im Zusammenhang mit dem Sichelzell-Hb verursachten Krankheiten werden unter dieser Bezeichnung zusammengefasst: Die homozygote HbS-Hämoglobinopathie (HbSS), die HbS-β-Thalassämie (HbS-β⁺- oder HbS-β⁰), die Sichelzell HbC-Krankheit (Hb SC) und die selteneren Kombinationsformen HbSD, HbSO-Arab und HbS-Lepore. Die häufigsten Manifestationsformen der Sichelzell Krankheit sind die HbS-Homozygotie und die HbS-β⁰- und HbS-β⁺-Thalassämien /1, 2, 17/.

Kardinalsymptome und diagnostische Kriterien

Die klinischen Symptome beginnen vor der dem ersten Lebensjahr mit chronisch hämolytischer Anämie und Entwicklungsstörungen. Die wesentliche Symptomatik sind Schmerzkrisen (Sichelzellkrisen), die den Rücken, die Extremitäten, den Thorax, Abdomen und das zentrale Nervensytem betreffen. Auch sind die Patienten empfindlich für Infektionen. Die Präsenz von HbS ist die problematischste aller Hämoglobinopathien. Die Sichelzellen führen zu einer Verminderung der O₂-Versorgung, Gefäßverschlüssen und Infarzierungen mit Nekose von Geweben und kommt in Organen vor (Haut, Leber, Milz, Knochen, Niere, Retina, Zentralnervensystem). Die chronisch hämolytische Anämie wird relativ gut toleriert. Aplastische Krisen mit schwerer Anämie werden nach viralen Infekten gesehen.

HbS wird primär mit der konventionellen Hb-Analyse diagnostiziert. Besondere Indikationen zur DNA-Analytik sind Kombinationsformen von HbS mit anderen Anomalien, mit β-Thalassämien oder α-Thalassämien und Fragestellung zur Pränataldiagnostik.

HbS-Heterozygotie

Heterozygote HbS-Träger sind klinisch nicht beeinträchtigt und haben ein normales Blutbild. Die Diagnose basiert auf dem Nachweis einer HbS Fraktion in typischer Position auf der Elektrophorese, deren mittels HPLC bestimmter quantitativer Anteil niedriger ist als der von HbA und im Mittel etwa 35–40 % vom gesamten Blutfarbstoff ausmacht. HbS Werte unter 30 % sind verdächtig auf einen gleichzeitig bestehenden Eisenmangel oder auf eine koexistierende α-Thalassämie. In beiden Fällen ist der MCH erniedrigt.

HbS-Homozygotie

Die Konzentration von Hb im Blutbild beträgt meistens 6–9 g/dl. Im Blutausstrich finden sich Sichelzellen und Targetzellen. Bei der Hb-Elektrophorese wird bei HbSS (homozygote Form) kein normales HbA nachgewiesen. Der Anteil von HbF variiert und liegt gewöhnlich bei 5–15 %. Höhere HbF-Anteile kommen oft vor.

HbS-β-Thalassämien

HbS-β-Thalassämien sind in Deutschland nicht selten. Das hämatologische Erscheinungsbild ähnelt demjenigen der Sichelzellkrankheit. Die Abgrenzungsmerkmale zur HbS-Homozygotie bestehen in einer Mikrozytose und Hypochromie. Die Differenzierung der HbS-β^o-Formen von den HbS-β⁺-Formen erfolgt im einfachsten Fall durch den Nachweis einer HbA-Fraktion bei der HbS-β⁺-Kombination, während bei der HbS-β⁰-Form kein HbA vorhanden ist. Die Diagnose kann mittels Hb-Analyse oder molekulargenetisch gesichert werden (Tab. 15.7-11 – Diagnostische Charakteristika von Sichelzell-ß-Thalassämien).

Hinweise zu den HbS--β-Thalassämien:

• Ein erhöhtes HbA₂ bei HbS-Heterozygotie ist kein Merkmal für eine HbS-β-Thalassämie.
• HbS-β-Thalassämien sind Sichelzell Krankheiten mit variablen klinischen Symptomen, sie dürfen nicht als eine Art Thalassämie gedeutet werden.

15.7.5.2.2 HbE und HbE-Krankheit

HbE ist eine häufige Hb-Variante in Südostasien. Das Krankheitsmuster ist der β-Thalassämie vergleichbar. HbE ist instabil, was bedeutet, dass eine Hämolyse bei viralen Infekten und bedingt durch Medikamente auftreten kann. HbE kommt oft mit einer Thalassämie vergesellschafet vor, was sich in einer schweren Form, vergleichbar der Major Form einer Hämoglobinopathie manifestiert /1, 2, 10, 11/.

HbE-Heterozygotie

Es besteht eine leichte, variable Hypochromie (MCH 25 pg) und Mikrozytose. Der Anteil an HbE liegt in der Regel bei 30–45 %, der Rest ist HbA. Das HbF ist nicht erhöht. Bei niedrigeren Konzentrationen an HbE muss immer an das gleichzeitige Vorkommen eines Eisenmangels oder einer α-Thalassämie gedacht werden.

HbE-Homozygotie (HbE-Krankheit)

Typisch ist die Hypochromie mit Mikrozytose (MCH 20 pg, MCV 65 fl) bei ausgeprägter Erythrozytose. Weiterhin Präsenz von reichlich Targetzellen. Der Anteil an HbE beträgt ca. 95 %; der Rest ist HbF und HbA₂. Elektrophoretisch wandert HbE identisch mit HbO, HbC und HbA₂. Molekulargenetische oder spezielle elektrophoretische, immunologische und chromatographische Methoden, insbesondere die HPL-Chromatographie erlauben eine Differenzierung dieser Anomalien.

HbE in Kombination mit anderen Anomalien

Die Kombination mit der β-Thalassämie (HbE-β-Thal), führt zu einer mittelschweren bis schweren hypochromen und dyserythropoetischen Anämie, die der Thalassämia intermedia bzw. Thalassämia major entspricht. In der Kombination mit der α-Thalassämie ist der Anteil an HbE, abhängig von der Zahl inaktiver α-Globingene, deutlich erniedrigt, die Hypochromie ist stärker ausgeprägt. Siehe auch:

• Tab. 15.7-12 – Klinische Klassifizierung der wichtigsten pathologischen Hämoglobinvarianten
• Tab. 15.7-7 – Grundformen der Hämoglobinopathien.

15.7.5.2.3 HbC-Anomalie und HbC-Krankheit

HbC Homozygotie bzw. die HbC-Erkrankung verläuft vergleichbar der Sichelzell Erkrankung, ist aber weniger schwer im Verlauf. Eine variable hämolytische Anämie ist die meist dominierende Form. Heterozygote Merkmalsträger sind gesund /1, 2, 10, 11/.

HbC-Heterozygotie

Bei HbC Anlageträgern besteht keine Anämie. Targetzellen sind im Blutausstrich nachweisbar. Das MCHC ist erhöht. Auf der alkalischen Hb-Elektrophorese wandert die HbC-Fraktion in typischer Position identisch wie HbA₂, der quantitative HbC-Anteil bei Anlageträgern macht 30–40 % vom Blutfarbstoff aus. Die Abgrenzung zu den Hämoglobinen mit identischer Wanderung, d.h. zu HbO und HbE wird mit der sauren Elektrophorese durchgeführt. Für quantitative Analysen wird die HPLC eingesetzt.

HbC-Homozygotie (HbC-Krankheit)

Im Blutbild sind überwiegend Targetzellen. Der Hb-Wert beträgt 100–120 g/l, die MCHC ist über 350 g/l. Auf der Hb-Elektrophorese findet sich nahezu 100 % HbC. Das HbF kann leicht erhöht sein. Siehe auch Tab. 15.7-12 – Klinische Klassifizierung der wichtigsten pathologischen Hämoglobinvarianten.

15.7.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Die Zielsetzung zur Untersuchung von Hämoglobinopathien ist der Ausschluss oder die Bestätigung einer Thalassämie oder eines abnormen Hämoglobins. In der Regel sind die Elektrophorese, klinisch-chemische Laboruntersuchungen und zytologische Untersuchungen ausreichend zur Bestätigung einer Thalassämie. In einigen Fällen sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, die in Speziallaboratorien durchgeführt werden. Das gilt auch für andere spezielle Untersuchungen (z.B. Methämoglobin), spektralanalytische Untersuchungen, Bestimmung der Sauerstoffaffinität und von 2,3-DPG.

Einflussgrößen

Das zur Diagnostik beauftragte Labor sollte über eine vorausgegangene Bluttransfusion informiert werden, da die Beurteilung der Ergebnisse hierbei besonders große Erfahrung voraussetzt. Im Zweifel ist eine Kontrolle nach Abbau der fremden Erythrozyten erforderlich.

Störfaktoren

Die unzureichende Entfernung von Serumproteinen führt zur Darstellung von Artefaktbanden, die meist anodenwärts von HbA sichtbar werden. Das gleiche gilt für Denaturierungsprodukte aus überalterten, verunreinigten oder hämolytischen Blutproben. Empfehlenswert ist es, bei allen Untersuchungsgängen normale Kontrollproben und nach Möglichkeit Referenz- und/oder Standardproben mitlaufen zu lassen.

Stabilität

Eine Kühlung des Untersuchungsmaterials ist, außer bei sehr hohen Außentemperaturen, nicht notwendig, sie kann für einige Fragestellungen sogar nachteilig sein. Ratsam ist ein möglichst kurzer bzw. zeitgünstiger Probentransport, der auch am Wochenende erfolgen kann, wenn das Empfängerlabor die Versorgung der Eingänge anbietet. Die Probenstabilität beträgt bei 8–12 °C 1 Woche für die Hämoglobinanalyse, für das Blutbild aber nur 24 h.

15.7.7 Pathophysiologie

Gemeinsame Ursache aller Hämoglobinopathien sind Mutationen und/oder Deletionen in den α- oder β-Globingenen. Bewirken die Gendefekte Störungen der Hb-Synthese, entstehen die Thalassämien. Hierbei ist die Struktur der Hämoglobine normal. Wenn Gendefekte Veränderungen der Hb-Struktur hervorrufen, entstehen die anomalen Hämoglobine. Zwischen den einzelnen Gruppen gibt es zahlreiche Kombinations- und Interaktionsformen (Tab. 15.7-7 – Grundformen der Hämoglobinopathien).

Thalassämie Syndrome /2, 14, 15/

Gemeinsame Kriterien: Der Erbgang ist autosomal rezessiv. Nomenklatur und Einteilung der Thalassämien richten sich nach der jeweils vom Synthesedefizit betroffenen Globinkette. Gemeinsames Merkmal ist eine reduzierte Synthese des vom Defekt betroffenen Kettentyps mit Verlust der Synthesebalance. Die insgesamt resultierenden Pathomechanismen prägen das hämatologische Bild:

• Die Verminderung der Hb-Synthese verursacht eine Anämie.
• Bei den schweren Formen wird die Anämie vor allem durch eine ineffektive Erythropoese und Hämolyse hervorgerufen.
• Der Mangel an Substrat bewirkt eine verminderte Hämoglobinisierung der Erythrozyten mit Hypochromie und Mikrozytose.

Heterozygote Träger der Thalassämie sind nicht vollständig gesund, haben vielmehr eine in jedem Fall Klärungs bedürftige Symptomatik mit leichter, Eisen refraktärer hypochrom mikrozytärer Anämie.

Homozygote oder gemischt-(compound-) heterozygote Major-Formen gehen mit schweren, hypochrom hämolytischen Anämien und komplexen Krankheiten einher.

α-Thalassämien /14, 15/

Den α-Thalassämien liegt ein Synthesedefizit an α-Globinketten zugrunde. Die molekulare Basis sind partielle (α⁺) oder totale (α⁰) Deletionen, seltener Mutationen eines oder mehrerer der vier α-Globingene (αα/αα). Je nach der Anzahl der vom Aktivitätsverlust betroffenen Gene gibt es vier α-thalassämische Erscheinungsbilder, die sich sämtlich bereits perinatal manifestieren (Tab. 15.7-8 – Zusammenstellung der wichtigsten Kriterien der α-Thalassämien):

• Die klinisch inapparente α-Thalassämia minima (heterozygote α⁺-Thalassämie; −α/αα) erkennbar an einer leichten Hypochromie bei kaum messbar erniedrigten Hb Werten.
• Die α-Thalassämia minor (heterozygote α⁰-Thalassämie; −−/αα) oder homozygote α⁺-Thalassämie (−α/−α) mit einer leichten Anämie, Hypochromie und Mikrozytose.

Bei der HbH-Krankheit (compound heterozygote α⁺/α⁰-Thalassämie) mit drei inaktiven α-Genen (−α/−−) wird die Pathophysiologie hervorgerufen einerseits durch den Hb-Synthesemangel, andererseits durch das instabile Überschuss-Hb HbH, das aus Tetrameren der β-Ketten (β4) aufgebaut ist. Daraus resultiert ein intermediäres Krankheitsgeschehen mit einer hypochrom hämolytischen Anämie und Splenomegalie. Krisenhafte Anämien kommen vor bei viralen Infekten und durch oxidative Noxen (Medikamente). Komplikationen sind kardiale Probleme, Gallensteine, Unterschenkelgeschwüre und ein Folsäuremangel.

Das Hb Bart’s Hydrops fetalis Syndrom (homozygote α⁰-Thalassämie; −−/−−) ist ein schon intrauterin ablaufender Hb-Synthesedefekt. Hierbei besteht der Blutfarbstoff überwiegend aus dem nicht zur Sauerstoffbindung befähigten d.h. funktionslosen γ-Kettentetramer Hb Bart’s (γ₄). Das Syndrom ist daher im Prinzip nicht mit dem Leben vereinbar. Die blassen und generalisiert ödematösen Kinder erkranken bereits intrauterin im letzten Drittel des Fetalalters an einer schwersten hämolytischen Anämie mit Hydrops und Aszites und sterben ohne Therapie meistens vor oder kurz nach der Geburt (Tab. 15.7-8 – Zusammenstellung der wichtigsten Kriterien der α-Thalassämien).

β-Thalassämien /2, 14/

Die β-Thalassämie Syndrome resultieren aus Defiziten der Synthese der β-Globinketten. Molekulare Ursache sind Mutationen der β-Globingene. Die meisten Patienten stammen aus den Mittelmeerländern, aus Südosteuropa, Arabien und Asien. Die hämatologischen Veränderungen manifestieren sich frühestens ab dem Lebensmonat 3–6. Die Heterogenität der Erscheinungsformen resultiert aus der großen Zahl verschiedenen Mutationen, die jeden Schritt der Genexpression betreffen können, mit differenten pathophysiologischen Auswirkungen. Je nach teilweisem oder vollständigem Ausfall der Synthese von β-Ketten werden β⁺- oder β⁰-Thalassämien unterschieden (Tab. 15.7-9 – Zusammenstellung der wichtigsten Kriterien der β-Thalassämien).

Thalassämia minor: Der Hb-Synthesemangel verursacht die typische hypochrome, mikrozytäre Anämie leicht gradiger Ausprägung, d.h. der Hb-Wert ist gering erniedrigt oder liegt im unteren Referenzbereich.

Thalassämia major: Die homozygote β-Thalassämie ist eine schwere Erkrankung (Thalassämia major). Hierbei werden einerseits zu wenig β-Ketten gebildet, auch werden die nicht betroffenen α-Ketten im Überschuss produziert. Der β-Kettenüberschuss bewirkt bereits in den erythroiden Knochenmark Vorstufen deren vorzeitigen Untergang und somit die hochgradig ineffektive Erythropoese. Das Korrelat dieser Pathomechanismen ist die parallel zur Hb-Umschaltung beginnende schwerste Anämie, die unbehandelt in wenigen Jahren zum Tode führt. Als bedrohliche Komplikation besteht eine Verwertungsstörung für Eisen und erhöhte Eisenresorption. Im Krankheitsverlauf entwickelt sich deshalb und in Folge der obligaten Therapie durch Transfusionen eine Hämosiderose mit multiplen Funktionsdefekten der Organe. Siehe auch Tab 7.1-9 – Eisenüberladung primär nicht bedingt durch ein Störung der Hepcidin-Ferroportin-Achse.

Thalassämia intermedia: Die mittelschwere Thalassämia intermedia kann sowohl durch eine milde homozygote als auch eine ungewöhnlich schwere heterozygote β-Thalassämie verursacht werden, wobei die hämatologische Manifestation durch die Mitvererbung von bestimmten genetischen Besonderheiten bedingt ist.

δβ-Thalassämien: Aufgrund einer Gendeletion werden δ- und β-Ketten vermindert oder gar nicht gebildet. Die heterozygoten Formen haben eine typische Thalassämia minor Konstellation mit auf 5–10 % erhöhtem HbF, aber eher niedrigem HbA₂. Homozygote δβ-Thalassämien verursachen ein Intermedia Syndrom, weil über eine Reaktivierung der γ-Ketten-Synthese mittlere Hb-Werte aufrecht erhalten werden.

Hb Lepore-Anomalien: Hb Lepore ist ein anomales Hb, dessen nicht-α-Kette ein Fusionsprodukt von δ- und β-Ketten-Anteilen darstellt. Hierbei ist die Hb-Synthese insgesamt deutlich reduziert. Klinisch-hämatologisch resultiert ein Bild wie bei der β-Thalassämie. Homozygotie für Hb Lepore oder die Kombination Hb Lepore/β-Thalassämie gleicht der Thalassämia major, während die heterozygote Hb Lepore-Konstellation der Thalassämia minor entspricht.

Anomale Hämoglobine (Hämoglobinstrukturvarianten) /1, 2, 4/

Gemeinsame Kriterien: Diese Gruppe von autosomal dominant vererbten Hb-Defekten entstehen auf der Basis fehlerhafter genetischer Codes als Produkte einer veränderter Aminosäurensequenz oder von Deletionen der Baustein der α- und β-Ketten des Hb. Klinisch harmlose müssen von krankmachenden Hb-Anomalien unterschieden werden. Letztere werden je nach ihren pathophysiologischen Auswirkungen in fünf gut abgrenzbare Gruppen unterteilt (Tab. 15.7-10 – Klinische Klassifizierung der wichtigsten pathologischen Hämoglobinvarianten).

Molekularbiologische Grundlagen: Mehr als 90 % der über 1.100 bislang entdeckten Hb-Varianten werden durch Punktmutationen bzw. durch eine Missense Mutation in einem der Globingene verursacht. Des weiteren gibt es wenige Varianten mit elongierter oder verkürzter Globinkette durch Mutationen des normalen Terminatorcodons bzw. durch Nonsense- und Frameshift-Mutationen im dritten Exon des β-Globin-Gens. Fusionsgene zwischen eng benachbarten Genen verursachen Fusionsproteine, z.B. Hb Lepore, das auch zu den β-Thalassämien in Beziehung steht.

HbS und Sichelzellkrankheit: Die Pathophysiologie wird durch HbS verursacht, dessen Strukturdefekt besonders unter Sauerstoffentzug eine Aggregationsneigung der Hb-Moleküle hervorruft. Infolgedessen nehmen die Erythrozyten eine Sichelform an, verlieren ihre Verformbarkeit und verändern ihre rheologischen Eigenschaften. Das Krankheitsbild ist durch eine Vielfalt phänotypischer Ausprägungen gekennzeichnet, von denen die homozygote Sichelzellkrankheit und die Sichelzell-β-Thalassämien die schwergradige Manifestation aufweisen. Die sich nach dem 1. Lebenshalbjahr entwickelnde klinische Symptomatik besteht aus zwei markanten Symptomenkomplexen: Der Gefäßverschlusskrankheit mit multiplen Gewebe- und Organschäden und der chronisch hämolytischen Anämie.

HbE-Anomalie und HbE-Krankheit: Charakteristisches Merkmal ist die quantitativ reduzierte Hb-Produktion d.h. HbE manifestiert sich ähnlich den β-Thalassämien. HbE ist außerdem leicht instabil, so dass unter dem Einfluss oxidativer Substanzen Hämolysen ausgelöst werden.

HbC-Anomalie und HbC-Krankheit: Die Pathophysiologie des HbC beruht ebenso wie bei HbS auf einer gestörten intrazellulären Löslichkeit von HbC mit intraerythrozytärer Kristallbildung und erhöhter Neigung zur Zellaggregation.

Kombinationen von anomalen Hämoglobinen mit Thalassämien: Diese Kombinationsformen bilden eine spezielle Krankheitsgruppe. Die größte praktische Bedeutung haben die Kombinationen von β-Thalassämie und β-anomalen Hämoglobinen. Hierbei kommt es auf Grund der Interaktion der unterschiedlichen pathophysiologischen Effekte zu charakteristischen biochemischen Konstellationen bzw. klinisch hämatologischen Syndromen. Der Nachweis einer Genanlage für Thalassämie darf nicht dazu führen, das Krankheitsbild als eine Art Thalassämie zu deuten, denn klinisch spielt die Komponenten der Thalassämie keine Rolle.

Hämoglobinopathien mit gestörter Sauerstofftransportfunktion: In dieser Gruppe werden drei Formenkreise voneinander abgegrenzt:

a) Anomalien in permanentem Zustand an Methämoglobin (HbM-Anomalien).

b) Anomalien mit erhöhter Sauerstoffaffinität.

c) Anomalien mit erniedrigter Sauerstoffaffinität.

Merkmale der unter b genannten Hämoglobinopathien sind eine Polyglobulie und/oder Zyanose. Die Gruppe c geht mit Anämie und Zyanose einher. Wichtige Merkmale anomaler Hämoglobine gibt an Tab. 15.7-12 – Charakteristische Merkmale der wichtigsten anomalen Hämoglobine.

Instabile Hämoglobine: Hierbei rufen Substitutionen von Aminosäuren eine Instabilität der Hb-Struktur hervor, wodurch der anomale Blutfarbstoff spontan, meistens jedoch unter der Einwirkung oxidativer Substanzen (Medikamente) oder auch bei Virusinfektionen innerhalb der Erythrozyten denaturiert. Differente Molekül Strukturen der mehr als 150 verschiedenen instabilen Hämoglobine bewirken mehr oder weniger unterschiedliche Pathomechanismen bzw. Erkrankungen. Die bekannteste und häufigste Anomalie ist Hb Köln, andere Beispiele in der hiesigen Bevölkerung sind Hb Tübingen, Hb Presbyterian, Hb Freiburg und Hb Zürich.

Die klassische Symptomatik besteht in der chronischen hämolytischen Anämie mit Heinz-Körper Erythrozyten und Ausscheidung eines braunen Farbstoffes im Urin (Mesobilifuszinurie).

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15.8 Erythrozyten-Enzyme

Elisabeth Kohne

Erythrozyten-Enzyme haben eine Schlüsselfunktion in der erythrozytären Stoffwechselregulation. Der Mangel an Enzymen beeinträchtigt die Energiebereitstellung und kann über eine verkürzte Lebenszeit der Erythrozyten hämolytische Anämien verursachen /1, 2, 3/.

Den meisten Enzymdefekten liegen nicht quantitative Defizienzen, sondern analog zu den Hämoglobinopathien anomale Enzymproteine (Enzymopathien) zugrunde. Aufgrund veränderter funktioneller Eigenschaften kommt es zur beschleunigten Inaktivierung von Enzymen, gleichbedeutend mit einer reduzierten oder fehlenden Enzymaktivität. Genetische Ursache der Enzymopathien sind Mutationen im Bereich der kodierenden Gene. Die meisten Enzymdefekte werden autosomal oder Geschlechts gebunden (X-chromosomal) rezessiv vererbt. Heterozygote Anlageträger weisen eine reduzierte Enzymaktivität auf, sind aber in der Regel nicht krank.

Homozygot (oder compound heterozygot) vererbte Enzymopathien können sich mit diversen klinischen Erscheinungsbildern präsentieren, wobei die hämolytischen Anämien die größte Gruppe bilden. Andere wichtige Formen der Manifestation sind Polyglobulien (Erythrozytosen), des weiteren Syndrome mit Entwicklungsstörungen sowie schwer gradige neurologische Defekte /3/. Die Enzymopathien sind in der Mehrzahl als angeborene Krankheiten labordiagnostisch ab dem Neugeborenenalter nachweisbar.

Die wichtigsten Enzymdefekte der Erythrozyten sind:

• Pyruvatkinase (PK)-Mangel, er ist der häufigste Enzymdefekt der Glykolyse /4/.
• Glucose-6-Phosphatdehydrogenase (G-6-PD)-Mangel, er ist der häufigste Enzymdefekt des Pentosephosphatzyklus /2/.

Weitere zwar sehr seltene, aber relevante Enzymopathien sind:

• Triosephosphatisomerase Mangel, der eine neuromuskuläre Symptomatik verursacht.
• Hexokinase-Mangel, er geht mit chronisch hämolytischer Anämie einher.
• Glukosephosphatisomerase Mangel, der eine schwere hämolytischer Anämie verursacht.
• 2.3-Diphosphoglyceratmutase Mangel, geht mit einer Polyglobulie einher.

Aus der Vielfalt der erythrozytären Enzymdefekte werden nachfolgend der PK-Mangel und der G-6-PD-Mangel ausführlicher beschrieben. Bezüglich der sonstigen bzw. der seltenen Enzymopenien wird auf die Spezialliteratur verwiesen /3/.

Häufigkeit und Verbreitung

Defekte der erythrozytären Enzyme gehören weltweit mit mehr als 400 Mio. Genträgern zu den häufigsten angeborenen Stoffwechselstörungen. An erster Stelle steht der G-6-PD-Mangel, dessen geographische Verbreitung weitgehend mit den Malariaregionen übereinstimmt, weil ein Selektionsvorteil für Träger der G-6-PD-Mangel Erbanlage besteht /2/. In Mittelmeerländern, Südostasien, Afrika und in der afro-amerikanischen Bevölkerung liegt die Genfrequenz des G-6-PD-Mangels bei 10–20 %. In Mittel- und Nordeuropa ist diese Enzymdefizienz ursprünglich selten, jedoch hat sich die Anzahl der Betroffenen durch die Zuwanderung vieler Personen aus den Endemiegebieten deutlich erhöht /1, 2, 3/.

Der zweithäufigste Enzymdefekt ist der PK-Mangel, der vor allem in Mittel- und Nordeuropa sowie in Nordamerika seinen Ursprung hat. Bei der in Deutschland lebenden Bevölkerung ist insgesamt bei höchstens 10 % aller Patienten mit kongenitaler hämolytischer Anämie mit einer Enzymopathie zu rechnen /1/.

15.8.1 Indikation

Chronisch hämolytische Anämien, die nach einer hämatologischen Vordiagnostik ätiologisch unklar geblieben sind.

15.8.2 Bestimmungsmethode

Für Routineaufgaben werden in der Regel automatisierte Enzymanalyse-Systeme eingesetzt /1, 2, 3/. Das Prinzip besteht in einer spektrophotometrischen Messung der Enzymaktivitäten im Hämolysat. Dieses wird bei 37 °C mit einem Testgemisch aus Substrat und Hilfsreagenzien inkubiert, das so konzipiert ist, dass die zu bestimmende Enzymaktivität Geschwindigkeits begrenzend für die Reaktion ist. Messgröße ist die Konzentrationsänderung der Pyridinnukleotide NADH bzw. NADPH, die photometrisch erfasst wird. Mit Hilfe standardisierter Formeln werden die Enzymaktivitäten berechnet. Für die G-6-PD und die PK gibt es außerdem orientierende Screening Tests, die vor allem für Reihenuntersuchungen eingesetzt werden.

Bei einem Teil der Enzymopathien äußert sich die biologische Funktionsstörung über charakteristische Veränderungen eines breiten Spektrums physikalisch chemischer Eigenschaften. Hierbei reicht die alleinige Bestimmung der Enzymaktivitäten nicht aus, vielmehr müssen zusätzliche Parameter, z.B. Enzymkinetik, Enzymelektrophorese, pH-Optimum und Thermostabilität für die Diagnose mit herangezogen werden.

DNA-Analysen

G-6-PD: Wenn die Mutation des Gens G-6-PD bei dem zu diagnostizierenden Patienten bekannt ist, kann eine PCR basierte DNA Analyse durchgeführt werden. Inzwischen gibt es vereinzelt Laboratorien, die eine vollständige Sequenzierung des Gens G-6-PD anbieten, mit denen die bekannten G-6-PD-Mutationen ausgeschlossen bzw. nachgewiesen werden können /1, 2/. Die Indikation beschränkt sich auf die diagnostische Sicherung heterozygoter Mangelträger des Enzyms, z.B. Frage des Überträgerstatus, oder in extremen Fällen auf Fragen der Pränataldiagnose.

PK: Bei Patienten mittel- und nordeuropäischer Abstammung kann auf Grund der hohen Frequenz von Mutationen des Typs 1529 G → A eine gezielte PCR-Restriktions Enzymanalyse erfolgen. Diese Methode ist auch für die pränatale Diagnostik in belasteten Familien einsetzbar, wenn bei den Eltern ein 1529 G → A PK-Defekt vorliegt. Für die molekulare Diagnose der PK existieren europaweit nur einzelne Speziallabors, welche die bisher bekannten PK-Varianten nachweisen bzw. ausschließen können /4, 5/. Dieses gilt auch für die anderen erythrozytären Enzymopathien.

15.8.3 Untersuchungsmaterial

EDTA-Blut: 5 ml

15.8.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 15.8-1 – Referenzbereich der Erythrozyten-Enzyme.

15.8.5 Bewertung

Mangelzustände von Enzymen werden in der Regel durch erniedrigte oder fehlende Enzymaktivitäten angezeigt. Die Zuordnung eines Befundes zu einer definierten Diagnose kann wegen der großen Variabilität der Konstellationen Schwierigkeiten bereiten.

Beachtet werden muss, dass:

• Retikulozyten und junge Erythrozyten eine höhere Enzymaktivität als alte Zellen haben. Während hämolytischer Krisen jedweder Genese kann daher bei stark verjüngter Zellpopulation ein falsch-normaler Befund erhoben werden. Auf die Aktivitätsrelationen der verschiedenen Enzyme und die Zellverteilung muss daher besonders geachtet werden.
• Falsch normale Enzymaktivitäten nach kürzlich erfolgter Bluttransfusion gemessen werden können.
• Patienten mit hypochromer Anämie scheinbar erhöhte Enzymwerte haben, wenn als Bezugsgröße für die Enzymaktivitäten die Konzentration von Hb genommen wird.

15.8.5.1 Glucose-6-Phosphatdehydrogenase-Mangel

Hilfreich ist eine Einteilung abnormer Enzymbefunde nach folgenden Kategorien /2/:

1. Sehr leichter Enzymmangel.

2. Mäßiger Enzymmangel.

3. Schwerer Enzymmangel.

4. Schwerster Enzymmangel.

Gruppe 1 ist klinisch ohne Bedeutung. In Gruppe 2 wird eine Hämolyse nur durch oxidativen Stress ausgelöst.

In Gruppe 3 treten unter oxidativer Belastung schwerste hämolytische Krisen auf.

Gruppe 4 ist durch eine permanente Hämolyse gekennzeichnet, die sich unter oxidativer Exposition zusätzlich krisenhaft verschlimmern kann.

In die Beurteilung einzubeziehen sind Besonderheiten, die sich aus der X-chromosomalen Vererbung des Mangels an G-6-PD-ergeben.

Je nach den bei Männern und Frauen differenten Genotypen gibt es folgende Manifestationen:

• Männer können hemizygot normal oder hemizygot defizient sein.
• Bei Frauen sind drei Möglichkeiten gegeben: Homozygot normal oder defizient und heterozygot; heterozygote Frauen haben normale, intermediäre oder sehr niedrige -Aktivitäten der G-6-PD, entsprechend dem Zeitpunkt der Inaktivierung des X-Chromosoms nach der Lyon-Hypothese.

Zum Zeitpunkt einer akuten Hämolyse kann die Diagnose des G-6-PD Mangels sehr schwierig sein, da nach Destruktion der mangelhaft mit Enzym ausgestatteten Zellen diejenigen mit relativ hoher Aktivität übrig geblieben sind. Eine Kontrolluntersuchung kann angeraten sein.

In wenigen Fällen von Mangel an G-6-PD ist auch ohne Exposition die Lebensdauer der Erythrozyten stark verkürzt. Die resultierende chronische nicht sphärozytäre hämolytische Anämie unterscheidet sich nur insofern von der bei Defekten der Glykolyse (z.B. PK-Mangel) bekannten Form, als durch oxidative Noxen zusätzlich hämolytische Krisen ausgelöst werden können. In allen näher untersuchten Fällen wurden Enzymvarianten mit besonders ungünstigen kinetischen Eigenschaften, geringer Stabilität und niedriger Aktivität gefunden. Bezüglich weiterer Einzelheiten siehe Tab. 15.8-2 – Befunde und Enzymcharakteristika der wichtigsten Erythrozyten-Enzymopathien.

15.8.5.2 Pyruvatkinase-Mangel

Die Höhe der Enzymaktivität allein ist als diagnostischer Parameter unsicher bis ungeeignet, da keine exakte Korrelation zwischen Enzymaktivität und Schwere der hämolytischen Anämie besteht /4, 7, 8/. Als Orientierung gelten folgende Erfahrungswerte: Die überwiegende Mehrzahl der PK-Mutanten, die mit einer schweren hämolytischen Anämie einhergehen, haben Enzymaktivitäten von weniger als 30 % der Norm.

In Fällen mit mildem klinischen Verlauf kann Aktivität des Enzyms deutlich darüber, seltener auch darunter liegen. Die Berücksichtigung der Retikulozytenzahl ist unbedingt erforderlich. In jedem Fall sind Kontrollmessungen, z.B. bei unterschiedlichen Retikulozytenzahlen empfehlenswert. Die klinisch hämatologischen Erscheinungsformen und die Enzymbefunde des G-6-PD-Mangels und PK-Mangels sind dargestellt in Tab. 15.8-2 – Befunde und Enzymcharakteristika der wichtigsten Erythrozyten-Enzymopathien.

15.8.6 Hinweise und Störungen

Stabilität

Aufbewahrung der Proben 3–4 Tage bei 4–6 °C möglich.

15.8.7 Pathophysiologie

Glucose-6-Phosphatdehydrogenase-Mangel /1, 2, 6/

Die kodierende Sequenz der 515 Aminosäuren umfassenden Polypeptidkette des G-6-PD Wildtyps GdB+ ist in den Nukleotiden der Exons 2–13 des G-6-PD-Gens fixiert. Die GdA-Variante der Schwarz-Afrikaner basiert auf der Mutation 376 A → G (Struktur; 126 Asn → Asp); der Mittelmeertyp GdB wird durch die Mutation 563 C → T (Struktur; 188 Ser → Phe) verursacht. Eine Vielzahl anderer Varianten mit unterschiedlicher phänotypischer Expression wurde gefunden und es gilt als erwiesen, dass auch die Bevölkerung Südostasiens in großer Zahl betroffen ist.

Die wichtigsten Enzymdefekte sind der Mittelmeertyp (Gd Mediterranean, fast fehlende Aktivität) bzw. die abnormen Varianten der schwarzen Bevölkerung Typ A⁺ (GdA⁺, mäßige Aktivitätsverminderung) bzw. Typ A (GdA, Restaktivität 5–15 %).

Der weitaus überwiegende Teil der Träger des Mangels an G-6-PD hat ohne Exposition gegenüber oxidativer Schädigung ei normales Hb und normale Retikulozytenzahlen. Hämolytische Krisen werden hierbei durch eine Reihe von oxidativen Schädigungen, vor allem Infektionen, Medikamente Favabohnen, Azidose und andere Faktoren ausgelöst. Siehe Tab. 15.8-3 – Medikamente und Chemikalien, die bei Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase-Mangel eine Hämolyse erzeugen.

Wasserstoffperoxid oder andere freie Radikale oxidieren reduziertes Glutathion, das in Folge des Enzymmangels nicht wieder reduziert werden kann. Die nachfolgende Präzipitation des Hb in Form von Heinz Körpern bewirkt eine massive intravasale Hämolyse. Diese kann nach Zerstörung der älteren Zellen mit der geringsten Enzymaktivität selbst limitierend sein. Eine Ausnahme ist der mediterrane Mangel-Typ, z.B. beim Favismus.

Pyruvatkinase-Mangel /4, 5, 7/

Der PK Mangel basiert auf einer Vielzahl heterogener Mutationen, die wiederum sehr unterschiedliche funktionelle Eigenschaften des Enzyms hervorrufen. Die differenten molekularen PK Formen werden durch zwei Gentypen kodiert:

• Das M-Gen oder Muskeltyp Gen, nachweisbar in Leukozyten und vielen Geweben.
• Das L-Gen oder Lebertyp Gen, das auch die PK der Erythrozyten steuert und als R-Typ bezeichnet wird.

Nur die Varianten des PK-L-Gens verursachen eine hämolytische Anämie. Es wird angenommen, dass in Folge der verminderten ATP-Synthese die Zellmembran geschädigt wird. Das Problem betrifft vor allem die Retikulozyten und jungen Erythrozyten. Über den Verlust an Energiequellen entsteht eine Störung der Zellmembran Integrität mit zunehmender Rigidität und Schrumpfung der Zelle. In einem Teil der Fälle sind unregelmäßig geformte Zellen beobachtet worden. Sie werden vom retikuloendothelialen System vermehrt sequestriert und phagozytiert. Die Milz eliminiert vor allem die jugendlichen Zellen, denn nach der Splenektomie steigt die Zahl der Retikulozyten erheblich an.

Die Anämie kann sehr leicht sein, so dass die Diagnose erst im Erwachsenenalter gestellt wird. Bei den schwer verlaufenden Formen kann bereits das Neugeborene mit dem Vollbild des Morbus hemolyticus neonatorum schwer erkranken. Eine Splenomegalie entwickelt sich gewöhnlich erst mit 4–6 Monaten. Blässe und Anämie in den ersten Lebenswochen sind die Regel. Später wechseln hämolytische Krisen, besonders bei Infekten mit Perioden, in denen die Anämie nur mittelschwer ist.

Andere hereditäre Enzymopathien der Erythrozyten sind bei der Pathogenese der enzymopenisch bedingten hämolytischen Anämien nur von untergeordneter Bedeutung und werden nur in Einzelfällen nachgewiesen (Übersicht Lit. /1, 2/).

Literatur

1. Jacobasch G. Hereditäre Membrandefekte und Enzymopathien roter Blutzellen. In: Ganten D, Ruckpaul K (eds). Handbuch der Molekularen Medizin. Berlin: Springer-Verlag, 2000; 6: 392–441.

2. Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and other red cell enzyme abnormalities. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U (eds). Williams Hematology 6th ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 527–45.

3. Prchal JT, Gregg XT. Red Cell Enzymes. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 19–23.

4. Zanella A, Bianchi P. Red cell pyruvate kinase deficiency:from genetics to clinical manifestations. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 2000; 13: 57–81.

5. Pissard S, Max-Audit I, Skopinski L, Vasson A, Vivien Pascal, Bimet C, Goossens M, Galacteros F, Wajcman H. Pyruvate kinase deficiency in France: a 3-year study reveals 27 new mutations. J Haematology 2006; 133: 683–9.

6. Mehta A, Mason PJ, Vulliamy TJ. Glucose-6-Phosphatdehydrogenase deficiency. Baillières Best Pract Res Clin Haematol 2000; 13: 21–38.

7. Beutler E, Blume KG, Kaplan JC, Löhr GW, Ramot B, Valentine WN. International Commitee for Standardization in Haematology: Recommended methods for red-cell enzyme assays. Brit J Haemat 1977; 35: 331–40.

8. Pekrun A, Schröter W. Erythrozytenenzymdefekte als Ursache angeborener hämolytischer Anämien. In: Huber H, Löffler H, Faber V, eds. Methoden der diagnostischen Hämatologie. Berlin: Springer-Verlag, 1994.

15.9 Enzymopenische Methämoglobinämien

Elisabeth Kohne

Es handelt sich um eine Gruppe seltener Krankheiten mit autosomal rezessivem Erbmodus, die ursächlich durch einen Mangel an NADH-Cytochrom B₅-Reduktase hervorgerufen werden /1, 2/. Der klinische Oberbegriff für alle Formen ist kongenitale, rezessive Methämoglobinämie.

Die Cytochrom B₅-Reduktase existiert in zwei Varianten, einer löslichen erythrozytären Form, welche in die MetHb Reduktion in Erythrozyten involviert ist und einer Membran gebundenen Form in verschiedenen somatischen Zellsystemen, die in zahlreiche metabolische Vorgänge eingebunden ist. Dementsprechend können Enzymdefizienzen sich unterschiedlich auswirken bzw. mit zwei unterschiedlichen Krankheiten einhergehen:

• Die hereditäre enzymopenische Methämoglobinämie Typ I ist auf die Erythrozyten beschränkt. Homozygote bzw. gemischte heterozygote Patienten erkranken an einer Methämoglobinämie, Heterozygote sind unauffällig.
• Die hereditäre enzymopenische Methämoglobinämie Typ II ist die generalisierte Form. Neben der angeborenen Methämoglobinämie bestehen progrediente neurologische Symptome mit schwerster psychomotorischer Störung und Tod im frühen Kindesalter.

15.9.1 Indikation

• Differenzialdiagnose der Methämoglobinämien
• Unklare Zustände der Zyanose.
• Zyanose, die sich unter Sauerstoffzufuhr nicht bessert.
• Bei Zustände der Zyanose mit normaler oder gering erniedrigter (≈ 85 %) Sauerstoffsättigung im arteriellen Blut.

15.9.2 Bestimmungsmethode

Initial erfolgt eine Messung der MetHb-Konzentration des Blutes. Siehe Beitrag 15.5 – Dyshämoglobine.

Die Bestimmung der MetHb-Reduktase (Cytochrom B₅-Reduktase)-Aktivität in erythrozytären Hämolysat wird spektralphotometrisch durchgeführt /3/. Zur Sicherung der Diagnose, Festlegung des Erbstatus und Klassifizierung des Typs einer nachgewiesenen hereditären Methämoglobinämie ist eine DNA-Analyse erforderlich.

15.9.3 Referenzbereich

15.9.4 Bewertung

Bei Patienten mit einer angeborenen, persistierenden Methämoglobinämie und einem enzymatisch gemessenen Mangel an Cytochrom B₅-Reduktase wird die Diagnose der enzymopenischen Methämoglobinämie gestellt. Bei Heterozygotie fehlen klinische Symptome. Mit dem Nachweis des zugrunde liegenden molekularen Basisdefekts kann die Klassifizierung des Krankheitstyps vorgenommen werden. Die Untersuchung, einschließlich einer genetischen Beratung der Eltern, ist Bestandteil des diagnostischen Programms. Bei Bedarf kann eine Pränataldiagnose erfolgen.

15.9.4.1 Allgemeine Symptomatik

Die Patienten fallen durch eine von Geburt an bestehende Zyanose auf. Die Werte des Methämoglobins können bei Neugeborenen auf über 40 % ansteigen. Bei größeren Kindern und Erwachsenen liegen sie in der Regel bei 10–25 %, es kommen aber auch Werte bis 40 % vor. Jahreszeitliche Schwankungen erklären sich mit Einnahme von unterschiedlich Vitamin C reicher Nahrung. Manche Patienten entwickeln eine mäßige kompensatorische Polyglobulie.

15.9.4.2 Enzymopenische Methämoglobinämie Typ I

Der Typ I des Cytochrom-B₅-Reduktase Mangels ist dadurch charakterisiert, dass er sich allein auf die Erythrozyten beschränkt. Homozygote bzw. gemischt heterozygote Patienten erkranken an einer unkomplizierten Methämoglobinämie. Heterozygote Mangelträger sind unauffällig, sie sind jedoch empfindlich gegenüber oxidierenden Substanzen.

15.9.4.3 Enzymopenische Methämoglobinämie Typ II

Der Typ II ist die generalisierte und letale Form des Cytochrom-B₅-Reduktase Mangels, der neben der Methämoglobinämie mit progredienten neurologischen Symptomen einhergeht. Die neurologischen Veränderungen beinhalten schwere mentale Entwicklungsstörungen, Mikrozephalie, Minderwuchs, Katarakt, sowie Krämpfe, Opisthotonus und generalisierte Hypertonie. Der Defekt betrifft nicht nur die Erythrozyten, sondern auch die mikrosomale Cytochrom-B5-Reduktion in Leber, Gehirn, Muskeln, Leukozyten, Thrombozyten und Fibroblasten. Hinzu kommen schwere Störungen im Lipidstoffwechsel mit Erniedrigung der Cerebroside im Gehirn, Erhöhung der Palmitinsäure und Erniedrigung der Linolensäure im Fettgewebe und charakteristische Veränderungen im Bereich der Phospholipide, der Phosphoglyceride und des Cholesterins in Leber, Nieren, Milz, Muskeln und Nebennieren. Die Erkrankung führt meistens im frühen Kindesalter zum Tode.

Literatur

1. Kleihauer E, Kohne E, Kulozik AE. Anomale Hämoglobine und Thalassämie-Syndrome: Grundlagen und Klinik. Landsberg; ecomed Verlagsgesellschaft, 1996.

2. Percy MJ, Lappin TR. Recessive congenital methaemoglobinaemia: cytochrome b5 reductase deficiency. Brit J Haemat 2008; 141: 298–308.

3. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. 3th ed. Grune and Stratton, Inc 1984.

15.10 Erythropoetin (EPO)

Lothar Thomas

Die rote Blutzellmasse des Organismus wird unter physiologischen Bedingungen konstant gehalten, um die Sauerstoffversorgung der Gewebe optimal zu gewährleisten. Täglich gehen durch die Mauserung der Blutzellen etwa 2 × 10¹¹ Erythrozyten verloren und ohne Ersatz würde der Hämoglobin (Hb) Wert in 24 h um 1 g/l abfallen. Da der Hb-Gehalt des Erythrozyten über sein Volumen genetisch determiniert ist und ebenfalls seine Lebenszeit, kann die Aufrechterhaltung der Erythrozytenmasse nur durch eine dynamische Anpassung der Erythropoese erfolgen.

Dies geschieht durch einen empfindlichen homöostatischen Mechanismus, der die Produktion der roten Blutzellen an die Sauerstoffanforderung der Gewebe koppelt. Der Vermittler dieses Prozesses ist das in der Niere gebildete Interleukin EPO. Bei Minderung der Sauerstoffversorgung wird EPO verstärkt gebildet, es resultiert eine Hyperproliferation der Erythropoese. Die Hemmung der EPO Synthese führt zur Ausbildung einer hypoproliferativen normozytären normochromen Anämie.

Bei Anämie und kompensatorischer Proliferation der Erythropoese durch endogenes oder exogenes EPO wird Eisen benötigt, dass durch eine erhöhte Freisetzung aus den Speichern und Erhöhung der enteralen Absorption bereitgestellt wird. Damit das erfolgen kann wird im EPO stimulierten Knochenmark in den Erythroblasten das Gen Erfe exprimiert das die Bildung des Erythroid Regulaors Erythroferron aktiviert. Erythroferron trägt zur Korrektur der Anämie bei, indem es die Bildung von Hepcidin hemmt und somit der Erythropoese verstärkt Eisen zur Verfügung stellt. Siehe Abb. 15.10-1 – Wirkung von Erythroferron bei akuter Blutung.

15.10.1 Indikation

• Unklare normozytäre Anämie.
• Bei hyporegenerativer Erythropoese zur Differenzierung der inadäquaten EPO Synthese von der intrinsischen Hypoproliferation des Marks (siehe auch Beitrag 7.4 – Löslicher Transferrinrezeptor).
• Differenzierung der Erythrozytose, (Polyzythämie), siehe auch Beitrag 15.4 – Hämatokrit.
• Verdacht und Verlaufsbeurteilung der paraneoplastischen Bildung von EPO.
• Vor Therapie nicht-renaler Anämien mit Erythropoese stimulierenden Agentien (ESA).
• Erkennung einer fetalen Notsituation.

15.10.2 Bestimmungsmethode

Radioimmunoassay

Als Tracer wird ¹²⁵J markiertes humanes rekombinantes EPO verwendet, der primäre Antikörper stammt vom Kaninchen, der sekundäre Antikörper zur Präzipitation des Immunkomplexes von der Ziege.

Immunometrischer Assay

Erythropoetin wird vermittels zweier monoklonaler Antikörper gegen rekombinantes EPO nachgewiesen. Der Zweitantikörper ist mit einem Enzym oder mit einem Chemolumineszenz Label markiert /3/. Die Kalibration bezieht sich auf die WHO 2nd IRP 67/343.

15.10.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma (Heparin): 1 ml

Zusätzlich sollte EDTA-Blut abgenommen werden, damit ein Bezug des EPO-Werts auf den Hämatokrit oder den Hb-Wert erfolgen kann.

15.10.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /1, 4/ und Tab. 15.10-1 – Referenzbereiche für Erythropoetin.

15.10.5 Bewertung

Gewebshypoxie stimuliert die -Synthese von EPO, während eine normale Sauerstoffversorgung der Gewebe die Bildung bremst.

15.10.5.1 Beurteilung der Erythropoese

Die Konzentration von EPO muss in Beziehung zur Masse der Erythrozyten, deren Maßstab der Hämatokrit (Hkt) oder die Hb Konzentration ist, gesetzt werden. Somit kann bei chronischen Anämien festgestellt werden, ob eine zur Verminderung der Masse der Erythrozyten adäquate Stimulation der Erythropoese erfolgt.

Es besteht eine inverse Beziehung zwischen dem Hb-Wert bzw. dem Hkt und dem dekadischen Logarithmus der Konzentration von EPO im Serum. Das ist nur der Fall bei Anämie, nicht aber innerhalb des Referenzbereichs der Hb-Konzentration oder des Hkt /7/. Bei einem leichten Abfall des Hkt auf 0,38–0,35 bzw. des Hb auf 125–115 g/l beginnt ein leichter Anstieg von EPO im Referenzbereich. Jedoch zu deutlichen Anstiegen von EPO kommt es erst ab einem Hkt ≤ 0,30 bzw. einem Hb ≤ 100 g/l (Abb. 15.10-2 – Erwarteter Konzentrationsbereich von Erythropoetin in Abhängigkeit vom Hämatokrit) /5/.

Für den gleichen Grad einer Anämie resultiert jedoch nicht immer ein adäquater EPO Anstieg, sondern es besteht eine Abhängigkeit von der Ursache der Anämie /6/. So werden die stärksten Anstiege bei der aplastischen Anämie gemessen, die geringsten bei der Anämie chronischer Erkrankungen und dem Endstadium der chronischer Niereninsuffizienz; die Eisenmangelanämie liegt dazwischen (Abb. 15.10-3 – Beziehung zwischen Hkt und Konzentration von EPO).

Bei Feten ist die Konzentration von EPO niedriger als bei Erwachsenen, obwohl die Erythropoese sehr regenerativ ist. Die Konzentration von EPO ist im Mittel ≤ 5 U/l bis zur 37. SSW. Auf Grund der fetalen Belastung während der Geburt steigen die Werte im Mittel 10 fach an, um in der ersten Lebenswoche wieder abzufallen. Im Alter von 7–12 Wochen hat das Kleinkind eine physiologische Anämie mit einem Hb-Wert von 90–110 g/l, auch die EPO Werte sind niedrig, mit der Ausnahme eines kleinen Anstiegs am Nadir des Hb /8/.

Die Feststellung einer mangelnden EPO-Bildung bezieht sich darauf, wie die Konzentration von EPO im Vergleich zu Patienten (Eisenmangelanämie, hämolytische Anämie, Thalassämia intermedia) mit vergleichbarem Hb-Wert oder Hkt ist /7/ (Abb. 15.10-2).

Bei Werten im Bereich einer verminderten EPO Bildung kommen folgende Ursachen in Frage:

• Neonatale Anämie.
• Entzündungsanämie (rheumatoide Arthritis, chronische Infektion, AIDS, entzündliche Darmerkrankung, Autoimmunerkrankung, kritisch Kranke).
• Tumoranämie ohne oder mit Chemotherapie (solider Tumor, multiples Myelom, malignes Lymphom).
• Erythrozytose (Polyzythämie), siehe Beitrag 15.4 – Hämatokrit.

Das Verhalten von EPO im Serum bei den verschiedenen Anämien zeigen:

• Tab. 15.10-2 – Erkrankungen und Zustände mit adäquatem Anstieg der EPO-Konzentration
• Tab. 15.10-3 – Erkrankungen und Zustände mit inadäquat niedrigem Anstieg der EPO-Konzentration
• Tab. 15.10-4 – Erkrankungen und Zustände mit überproportionalem Anstieg der EPO-Konzentration.

15.10.5.2 Chronische Nierenerkrankung

Der Begriff chronische Nierenerkrankung umfasst nach der National Kidney Foundation der USA /10/ neben Patienten mit chronischer Verminderung der Nierenfunktion auch die Dialyse-pflichtigen und diejenigen mit der Fehlfunktion eines Nierentransplantats. Unbehandelt verursachen renale Anämien folgende Störungen: Vermindertes Sauerstoffangebot an die Gewebe, Vergrößerung des Herzminutenvolumens, Herzvergrößerung, ventrikuläre Hypertrophie, Angina, Stauungsinsuffizienz des Herzens, verminderte mentale Wachsamkeit, reduzierte Immunantwort und eine Störung der Menstruation. Bei Kindern kommt es zur Verzögerung des Wachstums und zur verminderten intellektuellen Fähigkeit.

Die renale Anämie beruht auf einer inadäquaten Bildung von EPO durch die geschädigten Nieren. Zusätzliche Faktoren sind Eisenmangel, Blutverlust, akute und chronische Entzündungen, Aluminium Toxizität, und eine verkürzte Lebenszeit der Erythrozyten.

Eine differentialdiagnostische Abkärung der Anämie bei chronisch Nierenkranken sollte erfolgen, wenn /10/:

• Bei prämenopausalen Frauen und präpubertären Patientinnen der Hb-Wert < 110 g/l (Hkt < 0,33) beträgt.
• Bei Männern und postmenopausalen Frauen der Hb-Wert < 120 g/l (Hkt< 0,36 ) absinkt.

Eine Anhebung des Hb-Werts durch Therapie mit ESA auf 130–150 g/l reduziert nicht das Risiko kardiovaskulärer Ereignisse innerhalb von 3 Jahren /11/. Zum Eisenstoffwechsel und Therapie mit ESA bei Patienten im Endstadium chronischer Nierenerkrankung siehe Tab. 7.3-3 – Erkrankungen und Zustände mit verminderter Ferritinkonzentration im Serum.

15.10.5.3 Chronische Entzündung

Bei anämischen Patienten mit chronisch entzündlicher Erkrankung ist die inflammatorische Blockade der EPO-Bildung die wesentliche Ursache der normozytären normochromen Anämie /12/.

Rheumatoide Arthritis: Diese Patienten haben gelegentlich Hb-Werte < 80–90 g/l, aber kaum einer benötigt Erythrozytenkonzentrate. Bei schwer anämischen Rheumatikern ist die Anämie mit einem Eisenmangel verknüpft. Eine generelle Therapie mit ESA wird nicht empfohlen, kann aber in Einzelfällen wichtig sein.

AIDS: Etwa zwei Drittel dieser Patienten haben eine normozytäre, normochrome Anämie, die sich unter Behandlung mit AZT verschlechtert. Bei symptomatischen Patienten kann eine ESA-Therapie gerechtfertigt sein.

Tumoranämie /13/ (siehe auch Tab. 15.3-11 – Klassifikation und Differenzierung der normozytären Anämien)

Die Anämie ist ein häufiges Symptom bei Tumorpatienten. Im Vordergrund steht die inflammatorische Blockade der EPO Bildung. Sie ist durch die verstärkte Freisetzung inflammatorischer Zytokine bedingt. Chemo- und Radiotherapie verstärken die Anämie auf Grund supprimierender Wirkung auf die Erythropoese und Verminderung der renalen EPO Bildung. Siehe Abb. 15.10-4 – Aktivierung des Immunsystems bei der Akute-Phase Reaktion.

15.10.5.4 Kritisch Kranke

Bei intensivpflichtigen kritisch Kranken ist die Anämie multifaktorieller Natur und entspricht der Anämie chronischer Erkrankungen. Sie ist durch eine inadäquate Bildung von EPO, Eisen defiziente und intrinsische Hypoproliferation der Erythropoese und eine verkürzte Lebenszeit der Erythrozyten bedingt /14/.

15.10.5.5 Therapie mit Erythropoese stimulierenden Agentien (ESA)

Erythropoese und ESA

Hämodialyse Patienten erhalten in Europa zu 90 % eine ESA Therapie (7–8 Tausend Units rHuEPO pro Woche) und 70 % werden mit Eisen (300 mg pro Monat) substituiert. Dabei kommt es zur Ausdehnung des Erythrons, Fettmark wird durch Hämatopoese ersetzt. Durch die Stimulation proliferieren vorwiegend frühe erythroide Zellen der Colony Forming Unit Erythroid (CFU-E). Siehe auch Abb. 15.1-2 – Aufteilung der Erythropoese in einen Proliferationspool und einen Reifungspool. Im Unterschied dazu ist bei der chronischen Anforderung von roten Blutzellen, z.B. bei der chronisch hämolytischen Anämie, der Pool später erythroider Vorläuferzellen vermehrt. Ist das Mark schon durch endogene EPO Stimulation hyperproliferativ, kommt es durch ESA zu keinem bedeutsamen weiteren Anstieg der Regenerativität. So kann eine 2,9 fach gesteigerte Erythropoese durch hohe Dosen von ESA nur auf das 3,6 fache gesteigert werden /15/.

Die Wirkung von ESA ist abhängig von:

• Einem regenerativen Knochenmark (keine intrinsische Hypoproliferation).
• Der Eisenverfügbarkeit.
• Der Akute-Phase Reaktion (CRP-Konzentration).

Eisenverfügbarkeit

Die Stimulation mit ESA führt durch eine verstärkte Proliferation der Erythropoese zu einem erhöhten Eisenbedarf und der Verschiebung von Eisen aus den Speichern zum Knochenmark. Bei normaler Reserve an Speichereisen ist beim Gesunden durch eine intrinsische EPO-Stimulation die Erythropoese nur auf das 3 fache der Basisrate zu steigern, ohne dass hypochrome rote Blutzellen gebildet werden, da nur bis zu dieser Rate eine ausreichende Eisenversorgung möglich ist. Wird durch Gabe von ESA die Erythropoese exzessiv stimuliert, resultiert ein Eisenbedarf, der das Angebot übersteigt, ein Zustand, der als funktioneller Eisenmangel bezeichnet wird. Als Folge werden hypochrome rote Blutzellen gebildet. Diese Situation tritt besonders in der frühen Regenerationsphase der Erythropoese nach ESA Verabreichung auf. Sind die Eisenspeicher gut gefüllt und ist die Erythropoese adäquat mit ESA stimuliert, tritt erst ein Funktionseisen Mangel auf, wenn der Ferritinwert etwa < 100 μg/l beträgt. Unter Therapie mit ESA müssen ESA Dosis und die Eisenversorgung aufeinander abgestimmt sein.

Akute-Phase Reaktion (APR)

Systemische inflammatorische Veränderungen im Organismus werden als APR bezeichnet. Die APR ist neben dem funktionellen Eisenmangel einer der wesentlichen Gründe für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf ESA und einen erhöhten ESA Bedarf /15/.

Patienten mit Inflammation haben erhöhte Konzentrationen von IL-6, CRP, Fibrinogen und Ferritin. Transferrin und die Transferrinsättigung sind vermindert. Ursache der verminderten Ansprechbarkeit bei Inflammation ist die verstärkte Expression von IFN-γ, IL-6 und Hepcidin /16/. Diese Mediatoren antagonisieren im Knochenmark die anti-apoptotische Wirkung von EPO auf die CFU-E und bewirken eine ineffektive Erythropoese (Abb. 15.10-4 – Aktivierung des Immunsystems bei der Akute-Phase Reaktion).

Zusätzlich bewirkt die Erhöhung von Hepcidin eine Störung der Eisenverteilung durch Hemmung der Eisenfreisetzung aus Makrophagen und Enterozyten durch den Ferroportin-Rezeptor (siehe auch Beitrag 7.6 – Hepcidin). Der somit entstehende Mangel an Funktionseisen verstärkt die ESA-Resistenz und führt zur Anämie.

Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, mit einem malignen Tumor, mit chronisch entzündlicher Erkrankung und kritisch Kranke auf Intensiveinheiten leiden häufig an einer Anämie, die in signifikanter Weise die Morbidität, Mortalität und Lebensqualität beeinflusst. Die Mehrzahl dieser Patienten hat normozytäre, normochrome Erythrozyten. Die Behandlung mit ESA ist für diese Patienten mit Vorteilen verbunden, insbesondere einer Reduktion in der Anwendung von Erythrozytenkonzentraten. Die zusätzliche parenterale Gabe von Eisen erhöht die erythropoetische Antwort auf ESA. Die Therapie mit ESA ist teuer. Deshalb ist es wichtig Patienten zu selektieren, die mit hoher Wahrscheinlichkeit auf ESA ansprechen und die Antwort der Erythropoese zu kontrollieren. Untersuchungen der basalen Diagnostik und zum therapeutische Monitoring sind aufgeführt in Tab. 15.10-5 – Laboruntersuchungen zur Beurteilung der Erythropoese unter ESA-Therapie.

Die Behandlung mit ESA ist nicht frei von Risiken.

So zeigen Untersuchungen dass die Behandlung mit ESA verbunden sein kann /9/:

• Mit einem erhöhten Risiko venöser Thrombosen.
• Einer verstärkten Tumorprogression und evtl. Verkürzung des Überlebens.

ESA-Therapie bei chronischer Niereninsuffizienz 

Die Anämie ist ein starker Prädiktor für kardiovaskuläre Komplikationen und Tod bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung /10/. Die Korrektur der Anämie mit Hb-Werten < 110 g/l durch ESA Therapie auf Zielwerte von 110–120 g/l verbessert den Zustand der Patienten. Eine optimale Eisenreserve liegt bei Ferritinwerten von 200–500 μg/l und einer Transferrinsättigung (TSAT) > 20 % vor (Tab. 15.10-5 – Laboruntersuchungen zur Beurteilung der Erythropoese unter ESA-Therapie).

Siehe auch Tab. 15.10-6 – Erythropoese stimulierende Agentien.

ESA Therapie bei Tumoranämie

Eine ESA Therapie sollte nur bei symptomatischer Anämie erfolgen. Nach der FDA kann eine ESA Therapie begonnen werden unter myelosuppressiver Therapie bei Patienten mit Chemotherapie ohne Heilungschance /17/. Der Hb-Wert sollte < 100 g/l betragen und die ESA Dosis reduziert werden, wenn der Hb-Wert innerhalb 2 Wochen um ≥ 10 g/l ansteigt. Nach dem National Comprehensive Cancer Network der USA sollte eine i.v. Eisentherapie bei Patienten mit funktionellem Eisenmangel durchgeführt werden bei einer TSAT < 20 %, wenn der Ferritinwert bis zu 800 μg/l beträgt.

Effektivität der ESA Therapie

Die Effektivität der ESA Therapie ist von der Ursache der Anämie und der Präsenz einer Entzündung abhängig. Die beste Responserate von etwa 70 % haben Patienten im Endstadium der chronischen Niereninsuffizienz. Tumorpatienten haben eine Responserate von 30–70 %, beim myelodysplastischen Syndrom beträgt sie nur 20 %. Als positive Response wird ein Anstieg des Hb-Werts von 10 g/l innerhalb von 4 Wochen nach Therapiebeginn angesehen.

15.10.6 Hinweise und Störungen

Probennahme

Sollte morgens erfolgen auf Grund tageszeitlicher Schwankungen der Konzentration von EPO. Das Maximum liegt um Mitternacht, der Nadir in den Morgenstunden vor.

Bestimmungsmethode

Die Werte der kommerziellen Assays sind gut vergleichbar /1/. Synthetische EPO Präparationen werden erheblich unterschiedlich gemessen auf Grund der Unterschiede in der Struktur und Immugenität.

Präzision: Sie liegt, abhängig vom Test, im Bereich von 5–10 U/l bei einem VK% von 7–24. Erst bei 50 U/l liegen die VK% bei unter 10.

Richtigkeit: Getestet am Standard 87/684, lag diese bei sechs getesteten Assays bei ± 25 %, aber bei einem Assay bei + 200 % /18/.

Referenzbereich

Da der Referenzbereich sehr breit ist und ein signifikanter Anstieg über die obere Referenzbereichsgrenze erst ab einem Hkt unter 0,30 bzw. Hb unter 100 g/l gut messbar ist, muss der Bezug auf eine der beiden Messgrößen erfolgen. Die Erstellung der Bezugskurve auf den Hkt oder die Hb-Konzentration zu der EPO Konzentration kann durch Untersuchung eines Kollektivs aus Patienten mit Eisenmangelanämie, hämolytischer Anämie oder Thalassämia intermedia erfolgen /7/. Eine Altersabhängigkeit des EPO besteht nicht /19/.

Halbwertszeit

Endogenes EPO hat bei normalem Hb-Wert eine Halbwertszeit von 5,2 h und bei Anämikern von 1,5–2,9 h.

Stabilität

Im Serum mindestens 2 Wochen bei Raumtemperatur /20/.

15.10.7 Pathophysiologie

EPO ist in Kombination mit anderen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren ein physiologischer Regulator der Erythropoese (Abb. 15.10-5 – Wirkung von Erythropoetin und anderen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren in der Erythropoese) . Abhängig vom Entwicklungsstadium der erythroiden Vorläuferzelle ist EPO ein Mitogen, ein Inhibitor der Apoptose und ein Differenzierungsfaktor. So benötigen die Zellen der CFU-E den Kontakt mit EPO Molekülen, um nicht der Apoptose anheim zu fallen /21/.

Beim Gesunden wird zirkulierendes EPO von den neuronalen Fibroblasten nahe der proximal tubulären Zellen gebildet und auf translationaler Ebene wird die Synthese in Abhängigkeit von der O₂-Sättigung gebildet. Siehe Abb. 15.10-6 – Regelkreis der Wirkung von EPO.

EPO entfaltet seine Wirkung über Rezeptoren (EPOR) auf der Zelloberfläche. Im Mittel hat die erythroide Vorläuferzelle etwa 1.000 Rezeptoren, wobei die Zahl in Abhängigkeit von der Zelldifferenzierung schwankt. Nach Bindung von EPO an seinen Rezeptor resultiert die Proliferation und Differenzierung der erythroidenZelle, die Apoptose wird gehemmt (Abb. 15.14-2 – Homodimerer EPO-Rezeptor).

Das EPO-Molekül bindet an die extrazellulären Komponenten von zwei Rezeptoren unter Bildung eines Homodimers und eine Autophosphorylierung der Janus Tyrosinkinasen 2 (Jak2) erfolgt. Dadurch wird eine Kaskade von Ereignissen zur Signalübertragung von der Zelloberfläche zum Kern des Erythroblasten initiiert. Ein wesentlicher Schritt ist die Phosphorylierung von Tyrosinresten des EPO Rezeptors durch die Januskinase 2 (JAK 2) und die nachfolgende Übertragung durch STAT 5 zum Zellkern.

Nach der Signalübertragung wird der EPO Rezeptor-Komplex internalisiert und degradiert. Werden keine EPO Rezeptoren exprimiert, endet die Entwicklung der erythroiden Vorläuferzelle im Stadium der BFU-E und es erfolgt die Apoptose.

Zwei Gruppen von Mutationen des EPO Rezeptors haben klinische Bedeutung. Siehe auch weiterführend Beitrag 15.4 – Hämatokrit) /22/:

• Der Ersatz von Arginin in Position 129 durch Cystein am extrazellulären Teil des Rezeptors. Die Folge ist eine spontane Dimerisierung des Rezeptors in Abwesenheit von EPO. Es resultiert eine konstante Stimulierung der Vorläuferzellen mit Ausbildung einer Erythrozytose.
• Die Veränderung des intrazellulären C-terminalen Teils des EPO Rezeptors mit Defizienz der Bindungsstelle für die Phosphatase SHP-1. Physiologischerweise entfernt dieses Enzym Phosphatgruppen von den Tyrosinresten des C-terminalen Rezeptorendes und inaktiviert somit die Signalübertragung. Entfernung der Bindungsstelle für SHP-1 erhöht die Sensitivität der Zelle für EPO und bewirkt eine Erythrozytose.

EPO ist ein Glykoprotein mit einem MG von 30–34 kD. Seine biologische Aktivität ist von der Tertiärstruktur abhängig, die aus vier α-Helices mit zwei langen und einer kurzen Schleife besteht. Endogenes EPO und rekombinantes EPO haben die gleiche Sequenz von 165 Aminosäuren, unterscheiden sich aber in der Glykosilierung. Endogenes EPO ist stärker sauer als rHuEPO und kann durch Isoelektrofokussierung einer Urinprobe vom rHuEPO differenziert werden. Vier Oligosaccharidketten machen 35–40 % des Molmasse aus. rHuEPO ist voll glykosiliert, wenn es im Säugetierzellkulturen, z.B. des chinesischen Hamsters gebildet wird, aber nicht glykosiliert bei der Synthese in E. coli Kulturen /23/.

Die fetale Leber ist der Hauptort der EPO Bildung von der 20. SSW an. Nach der Geburt übernehmen die interstitiellen Zellen der Nieren zunehmend die Bildung von EPO und beim Erwachsenen erfolgen 85 % der täglichen Synthese in den Nieren. Unter normalen Bedingungen wird die Bildung von EPO als Antwort auf eine Reduktion der roten Blutzellmasse (Anämie) oder eine verminderte O₂-Sättigung des erythrozytären Hämoglobins (Hypoxämie) aktiviert /24/. Ergebnis der hypoxischen Stimulation ist die vermehrte Bildung von Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1) in den Nieren. HIF-1 ist der wichtigste Faktor der EPO-Genregulation und stimuliert die EPO-Synthese. Bei HIF-1 handelt es sich um einen globalen Regulator der zellulären und systemischen O₂-Homöostase. HIF-1 reguliert außerdem die Gefäßbildung, fördert das Überleben der Zellen unter Ischämie und spielt eine Rolle in der Karzinogenese.

Die Hypoxie-bedingte Expression des Gens für EPO in den peritubulären Fibroblasten der Niere resultiert aus einem Arrangement des Kidney inducible element (KIE) und einem negativen regulatorischen Element (NRE) /23/.

15.10.7.1 Roxadustat

Roxadustat ist ein oraler Hypoxie-induzierter Inhibitor der Prolylhydrolase. Roxadustat erhöht die endogene EPO-Konzentration durch Stabilisierung des Hypoxia inducible factor (HIF; siehe auch Beitrag 15.4) durch Hemmung der Domaine der Prolylhydrolase. Eine Studie /50/ hat gezeigt, dass Roxadustat die Hämoglobinkonzentration erhöht und Ferritin und die Transferrinsättigung vermindert bei Patienten mit Peritonealdialyse, bei denen ein Erythropoetin stimulierendes Reagenz (ESA) abgesetzt und durch Roxadustat ersetzt wurde.

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15.11 Thrombozytenzahl und Thrombozytenindices

Lothar Thomas

Die Thrombozyten sind kernlose, an Granula reiche Zellen mit den Funktionen

• der Aufrechterhaltung der Hämostase und
• Ingangsetzung der Gewebereparatur nach Gefäßverletzung und im Entzündungsprozess.

Beim Gesunden bildet das Knochenmark die Anzahl von 1 × 10¹¹ Thrombozyten täglich, etwa die Hälfte der täglichen Bildung von Erythrozyten. Die Megakaryopoese und Thrombozytenbildung werden durch Thrombopoetin reguliert. Die Thrombozyten entstehen bei Fragmentierung der Megakaryozyten, ein Vorgang bei der die Bildung langer zytoplasmatischer Ausläufer, auch Prothrombozyten genannt, umfasst. Siehe auch Beitrag 15.1 – Hämatopoese.

Die Thrombozyten befinden sich im Blut normalerweise im Ruhestadium. Nach einem physiologischen Stimulus durchlaufen sie einen Formwandel mit nachfolgender Adhäsion an einer Oberfläche und anschließender Aggregation. Die dabei auftretenden Veränderungen der Form können in vivo mit physikalischen Methoden als Veränderungen der Oberfläche und mit immunologischen Methoden durch die Messung der Expression von Rezeptoren verfolgt werden. Bei der Aggregation der Thrombozyten oder nach starker Stimulierung degranulieren die Thrombozyten und die Membran der Granula gelangt an die Oberfläche des Thrombozyten. Dadurch werden Neoantigene in Form von Glykoproteinen auf den aktivierten Thrombozyten exprimiert. Labordiagnostisch können diese Vorgänge durch die Kombination von Immunfluoreszenz und Flowzytometrie erkannt werden. Aber auch schon die Flowzytometrie allein erkennt Veränderungen der Gestalt der Thrombozyten. So zeigen Änderungen im Vorwärtsstreulicht einen Wechsel im Thrombozytenvolumen und Änderungen im Seitwärtsstreulicht die Granularität an.

Zu den Thrombozyten siehe auch:

• Beitrag 16.1.3 – Thrombozyten
• Kapitel 17 – Thrombozytopenien und thrombozytäre Funktionsstörungen.

15.11.1 Indikation

• Unklare Blutungen, z.B. von Willebrand-Erkrankung.
• Ausschluss einer Blutungsneigung.
• Kontrolle bei Bestrahlungen, unter zytostatischer Therapie und Heparintherapie.
• Vorliegen einer Erythrozytose.
• Splenomegalie.
• Verdacht auf Knochenmarkerkrankung (Myelophthise, Myeloproliferation).
• Verdacht auf Destruktion, Verbrauch oder reaktive Vermehrung der Thrombozyten.

15.11.2 Thrombozytenzählung

Die Zählung der Thrombozyten erfolgt in der Regel mit der Bestimmung des Blutbildes mit Hämatologie Analyzern.

15.11.2.1 Kammerzählung

Prinzip: Venöses Blut oder Kapillarblut wird mit einer hypotonen Lösung, die einen Aggregationshemmer für Thrombozyten (1 %ige Ammoniumoxalat Lösung) enthält, verdünnt. Das geschieht in einer Pipette, die bis zur Marke 1 mit Blut und bis zur Marke 101 mit Verdünnungslösung (1 %ige Ammoniumoxalat Lösung) aufgezogen wird. Zwecks Hämolyse wird die verschlossene Pipette rotieren gelassen. Die Zählung kann in der Neubauer-Kammer oder der Thoma-Kammer erfolgen. Vor Beginn der Zählung die Thrombozyten für 10 min in der Kammer sedimentieren lassen /1/. Die Kammerzählung unter Benutzung eines Phasenkontrastmikroskopes ist Referenzmethode /2/.

15.11.2.2 Hämatologie Analyzer

Die Bestimmung kann nach der Impedanz-Methode, der optischen Methode oder in Form des Immunoplatelet Counting erfolgen. Bei der optischen Methode werden eindimensionale und zweidimensionale Verfahren unterschieden. Einige Hämatologie Analyzer messen nach der Impedanz- und der optischen Methode.

Impedanz-Methode

Die Thrombozyten werden gezählt unter Anwendung der elektrischen Widerstandsmessung (Impedanz)-Zählmethode. Unterbricht ein Thrombozyt, der durch eine Kapillare wandert, den angelegten Stromkreis, wird ein Impuls ausgelöst. Thrombozyten und Erythrozyten werden aus der gleichen Zellsuspension bestimmt. Bei den Thrombozyten erfolgt die Zählung der Impulse in einem Fenster von 2–20 fl, bei den Erythrozyten über 36 fl. Die mittlere Größe aller Impulse im Thrombozyten im Histogramm wird als Thrombozytenvolumen (Mean Platelet Volume, MPV) angegeben /3/.

Eindimensionale optische Methode

Eine Laserdiode erzeugt monochromatisches Licht, das in einem Winkel von 2–3° auf die Durchflusszelle gelenkt wird. Nach der Mie-Streulichttheorie ist die Intensität des monochromatischen Lichtes, das von einem homogenen Partikel gestreut wird, von dessen Volumen und der Differenz im Refraktionsindex zwischen dem Partikel und seinem umgebenden Medium abhängig. Die Thrombozytenzahl wird über die auftretenden Streulichtimpulse ermittelt, das MPV über die Streulichtintensität /3/.

Zweidimensionale optische Methode

Das Prinzip entspricht der eindimensionalen Methode. Durch Einsatz eines Detergens wird den Thrombozyten jedoch eine sphärische Struktur aufgezwungen und das Streulicht wird in zwei Winkeln, einem niedrigen von 2–3° und einem hohen von 5–15° gemessen.

Mit der zweidimensionalen Streulicht Methode können im Vergleich zu den anderen Methoden besser voneinander differenziert werden: Normal große Plättchen, große Plättchen (20–30 fl), rote Blutzell (RBC)-Fragmente, RBC-Ghosts, Mikrozyten und zellulärer Debris /4/.

Kombination von Impedanzmethode und optischer Methode

Einige Hämatologie Analyzer führen beide Zählmethoden durch, um insbesondere bei niedriger Thrombozytenzahl zwischen Thrombozyten und anderen Partikeln zu unterscheiden. Bei niedriger Thrombozytenzahl und der Präsenz von anderen Partikeln zeigt die Impedanzmessung im Vergleich zur optischen Messung einen Bias zu höheren Werten, weil auch andere Partikel erkannt werden /5/.

Immunoplatelet counting

Bei diesem Konzept werden monoklonale Antikörper zur Identifizierung der Thrombozyten eingesetzt. Angewendet werden Antikörper gegen CD41 (GPIIb), CD42 (GPIb) und CD 61 (GPIIIa). Die Bestimmung erfolgt am Durchflusszytometer. Die Thrombozytenzahl wird aus dem Verhältnis von ermittelten Fluoreszenz Ereignissen und der Anzahl roter Blutzellen kalkuliert (RBC ratio), die an einem Blutzell-Analyzer mittels Impedanzzählung ermittelt werden. Die Thrombozytenzahl wird berechnet durch Multiplikation der RBC ratio mit der Zahl der roten Blutzellen. Der Vorteil der RBC ratio ist, dass die Thrombozytenzählung unabhängig von Verdünnungs- und Pipettierfehlern ist /6/. Eine alternative Methode ist das Hinzufügen einer konstanten Menge von Latexpartikeln zur Probe. Die Anzahl der Latexpartikel wird durch Impedanzzählung bestimmt und darauf die Plättchen-bedingten Fluoreszenzereignisse bezogen /7/.

15.11.3 Thrombozyten Indices

Neben der Thrombozyzenzahl bestimmen oder ermitteln Hämatologie Analyzer das mittlere Plättchenvolumen (MPV), den Platelet Crit (PCT) und die Platelet Distribution Width (PDW). Der Advia 120 bestimmt zusätzlich die Mean platelet component concentration (MPC), die Platelet component distribution width (PCDW), die Mean platelet mass (MPM) und die Platelet mass distribution width (PMDW). Änderungen der MPC sind ein Gradmesser der Plättchenaktivierung. Die Verbreiterung der PDW zeigt eine hyperregenerative Thrombopoese an.

15.11.3.1 Immature Platelet Fraction (IPF)

Die Bestimmung der IPF (unreife Thrombozytenfraktion) dient der Abklärung von Thrombozytopenien.

Verfahren: Die flowzytometrische Bestimmung erfolgt z.B. am Sysmex XE-2100 unter Anwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Polymethin und Oxazin. Beide Farbstoffe penetrieren die Zellmembran des Thrombozyten und markieren die RNA in Thrombozyten und roten Blutzellen. Die markierten Zellen werden durch einen Semiconductor Dioden Laserstrahl gelenkt und die resultierende Vorwärtsstreuung (Plättchenvolumen) und die Fluoreszenzintensität (Plättchen-RNA-Gehalt) registriert. Ein computerisierter Algorithmus diskriminiert die IPF von der reifen Thrombozytenfraktion. Die IPF wird als relativer Anteil an der gesamten Thrombozytenfraktion angegeben.

15.11.4 Untersuchungsmaterial

• EDTA-Blut: 1 ml
• Kapillarblut (EDTA-beschichtete Kapillare): 0,02 ml

15.11.5 Referenzbereich

Siehe Lit. /8, 9, 10, 11/ und Tab. 15.11-1 – Referenzbereich der Thrombozyten.

15.11.6 Bewertung

Das hämostatische System besteht aus Gerinnungsfaktoren, der Gefäßwand und den Thrombozyten. Die aus dem Knochenmark entlassenen Thrombozyten haben in der Zirkulation eine Lebenszeit von 7–10 Tagen, ehe sie von den Makrophagen des retikuloendothelialen Systems entfernt werden. Beim Gesunden sind etwa ein Drittel der gesamten Thrombozyten in der Milz, die restlichen zirkulieren. Der Milzpool an Thrombozyten ist rasch verfügbar und es besteht ein freier Austausch mit den Thrombozyten in der Zirkulation.

Zur Erfüllung ihrer hämostatischen Funktion müssen die Thrombozyten nicht nur voll funktionsfähig sein, sondern ihre Zahl muss in gewissen Grenzen liegen. Vom Kliniker wird eine Thrombozytenzahl von (100–400) × 10⁹/l als normal gehalten und nur gelegentlich zeigen klinisch Gesunde Werte darunter oder darüber. Bei Thrombozytopenien ≤ 10 × 10⁹/l besteht die Gefahr der Blutung und bei Thrombozytosen ≥ 450 × 10⁹/l ist die Gefahr thrombotischer Ereignisse erhöht.

Da bei vielen Erkrankungen die Bestimmung des Blutbildes mit Hämatologie Analyzern durchgeführt wird, ist die Entdeckung von Thrombozytopenien und Thrombozytosen weitaus häufiger als die klinischen Fälle mit hämostaseologischer Symptomatik.

15.11.6.1 Thrombozytosen

Die Begriffe Thrombozythämie und Thrombozytose werden synonym verwendet und sind nicht eindeutig definiert. Vielfach wird darunter eine Erhöhung der Thrombozytenzahl über 450 × 10⁹/l verstanden. Personen mit Werten von (350–450) × 10⁹/l bedürfen der Kontrolle. Das Ausmaß der Thrombozytose wird abhängig von der Thrombozytenzahl arbiträr klassifiziert in /12/:

• Mild bei (450–700) × 10⁹/l.
• Moderat bei (700–900) × 10⁹/l.
• Schwer bei über 900 × 10⁹/l.

Thrombozytosen werden auf Grund der Ätiologie eingeteilt in:

• Hereditäre oder familiäre Formen.
• Klonale Formen, sie sind mit myeloproliferativen oder myelodysplastischen Erkrankungen assoziiert.
• Sekundäre Formen. Es handelt sich um reaktive Thrombozytosen.

Klonale Thrombozytosen werden als primäre Formen bezeichnet. Da thrombo-embolische Ereignisse häufiger bei primären Thrombozytosen auftreten ist eine Differenzierung primärer von sekundären Formen wichtig.

15.11.6.1.1 Primäre Thrombozytosen

Primäre Thrombozytosen sind die Folge myeloproliferativer und myelodysplastischer Erkrankungen oder sie sind familiär bedingt. Hereditäre Ursachen sind entweder aktivierende Mutationen im Gen MPL, das den gleichnahmigen Rezeptor der Megakaryozyten und Thrombozyten kodiert oder es handelt sich um aktivierende Mutationen im Gen TPHO, das Thrombopoetin kodiert.

15.11.6.1.2 Sekundäre Thrombozytosen

Es liegt entweder eine vermehrte Bildung von Thrombozyten auf Grund eines Stimulus vor oder Thrombozyten sind aus dem Milzpool in die periphere Zirkulation entlassen worden. Die vermehrte Freisetzung aus dem Milzpool erfolgt z.B. bei körperlicher Anstrengung, Stress oder der Verabreichung von Katecholaminen.

Die Thrombozytopoese im Knochenmark wird angeregt durch den peripheren Verlust von Thrombozyten, z.B. immunologisch, septisch, durch Blutverlust oder onkogen bedingt. Sekundäre Thrombozytosen lösen praktisch nie eine Thrombose aus. Nach überstandener Erkrankung fällt die Thrombozytenzahl wieder ab. Im Knochenmark sind die Megakaryozyten bei den sekundären Thrombozytosen vermehrt und selten dysmorph. Die im peripheren Blut auftretenden großen Thrombozyten sind rund, die Funktion ist normal und die Thrombozyten neigen nicht zur spontanen Aggregation wie bei den primären Thrombozytosen /12/. Etwa 88 % der Thrombozytosen über 500 × 10⁹/l sind sekundärer Natur und beruhen vorwiegend auf einem inflammatorischen Geschehen /13/.

Die Unterschiede zwischen primärer und sekundärer Thrombozytose sind aufgezeigt in Tab. 15.11-2 – Unterschiede zwischen primärer und sekundärer Thrombozytose.

15.11.6.2 Thrombozytopenien

Unter Thrombozytopenie wird eine Verminderung der Zahl auf < 100 × 10⁹/l verstanden.

Bedrohliche Blutungskomplikationen treten aber nicht auf /14/:

• Bei ambulanten Patienten mit aplastischer Anämie und Zahlen, die ≥ 5 × 10⁹/l betragen.
• Nach kleineren operativen Eingriffen bei Patienten mit Fieber > 38 °C oder nach Transfusion von Thrombozyten auf Grund kürzlich zurückliegender Blutung Grad 3 nach WHO, wenn die Zahl ≥ 10 × 10⁹/l betrug.

Ein wichtiger Punkt für eine solche Entscheidung ist die Richtigkeit der Thrombozytenzählung bei Werten in dieser Größenordnung /5/. Der Nutzen der Thrombozytengabe bei Patienten mit Thrombozytenzahlen ≥ 5 × 10⁹/l, die nicht bluten, ist nicht belegt.

Häufige Befunde bei Thrombozytopenien sind Petechien, Purpura, milde bis moderate Schleimhautblutungen, bilaterale Epistaxis, gastrointestinale, pulmonale und urogenitale Blutungen. Charakteristisch sind symmetrische Petechien und Purpura der Haut sowohl des Körperstamms als auch der Extremitäten.

Im klinischen Alltag ist die Thrombozytopenie ätiologisch häufig mit der Einnahme von Medikamenten, Chemotherapie, Sepsis, disseminierter intravasaler Gerinnung oder massiver Bluttransfusion assoziiert. Jede Thrombozytopenie bedarf labordiagnostisch der Bestätigung durch eine weitere Zählmethode und der Untersuchung eines Blutausstrichs.

Ätiologien der Thrombozytopenie sind:

• Die verminderte Thrombozytenbildung.
• Ein erhöhter Thrombozytenumsatz.
• Die gestörte Verteilung oder Verdünnungs bedingte Erhöhung des Plasmavolumens.
• Eine Pseudothrombozytopenie.

Befunde zur Differenzierung der Ätiologie zeigt Tab. 15.11-3 – Differenzierung des Mechanismus der Thrombozytopenie.

15.11.6.2.1 Verminderte Thrombozytenbildung

Die verminderte Bildung ist relativ selten (Kinder < 5 %, Erwachsene < 10 %). Die Ätiologie der Thrombozytopenien sind /15/:

• Hereditäre Formen, z.B. Wiskott-Aldrich Syndrom, Chediak-Higashi Syndrom, Syndrome of absent radius, Alport Syndrom, Fechtner Syndrom, Trousseau Syndrom, May-Hegglin Anomalie, v. Willebrand Erkrankung Typ IIB, Bernard-Soulier Syndrom, Gray Platelet Syndrome, Plättchen-Typ von Willebrand Syndrom, mediterrane Makrothrombozytopenie, reine genetische Thrombozytopenie (Makrothrombozyten).
• Krankheits- und Therapie bedingte passagere Thrombozytopenien nach Chemotherapie von malignen hämatologischen Neoplasien oder nach der Knochenmarkinfiltration solider Tumoren, nach Stammzellschädigung durch Bestrahlung oder Pharmaka. Die Thrombozytenzahl sollte ≥ 10 × 10⁹/l betragen und bei nekrotisierenden Tumoren ≥ 50 × 10⁹/l.

15.11.6.2.2 Erhöhter Thrombozytenumsatz

Die Zerstörung von Thrombozyten in der Zirkulation ist die häufigste Ursache der Thrombozytopenien. Unterschieden werden zwei wesentliche Formen:

• Immunthrombozytopenie (ITP). Es handelt sich um eine verstärkte Clearance von Thrombozyten aus der Zirkulation, bedingt durch Thrombozyten-assoziiertes IgG und Komplement Aktivierung. ITPs sind Komplikationen bei HIV- und Hepatitis C-Infektion und nach der Behandlung von Patienten mit Helicobacter pylori-Infektion. Auch verursachen Medikamente eine ITP /16/. Eine Auswahl ist aufgeführt in Tab. 15.11-4 – Medikamenten-assoziierte Autoimmun-Thrombozytopenie.
• Nicht immun bedingt: Disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Sepsis, hämolytisch urämisches Syndrom, thrombotisch thrombozytopenische Purpura, intraoperativ, nach multiplen Bluttransfusionen.

Bei erworbenen Thrombozytopenien durch Zerstörung oder Verbrauch in der Peripherie handelt es sich meist um schwere Formen. Die Thrombozytenzahl ist stark erniedrigt, das MPV idie Thrombozytenfunktion sind normal, aber die Lebenszeit der Thrombozyten ist verkürzt. Das Knochenmark zeigt eine hyperregenerative Megakaryopoese.

15.11.6.2.3 Verteilungs- und Verdünnungs bedingte Thrombozytopenie

Patienten mit Splenomegalie sequestrieren Thrombozyten. Der Hypersplenismus bewirkt milde Thrombozytopenien von (50–100) × 10⁹/l. Ursache ist die Speicherung von bis zu 90 % der Thrombozyten in der vergrößerten Milz. Die Lebenszeit der Thrombozyten ist nur wenig verkürzt, was anzeigt, dass sie nur sequestriert aber nicht zerstört werden. Bei Patienten mit Splenomegalie und Leberzirrhose beruht die Thrombozytopenie weniger auf der Sequestration der Thrombozyten in der Milz, sondern auf der verminderten Bildung von Thrombopoetin in der Leber /17/.

Die Thrombozytopenie durch Verdünnung beruht auf einer Transfusionstherapie bei massivem Blutverlust.

15.11.6.2.4 Thrombozytopenie und Thrombozyten­transfusion

Zur Substitution von Thrombozyten stehen folgende Thrombozyten­konzentrate (TK) zur Verfügung /17/:

• Gepoolte Einheiten von 4–6 Spendern mit (240–360) × 10⁹ Thrombozyten in 200–350 ml Plasma oder Plasmaersatzlösung.
• Apherese TK eines Einzelspenders mit (200–400) × 10⁹ Thrombozyten in 200–300 ml Plasma.

Ein TK enthält < 3 × 10⁹ Erythrozyten und < 1 × 10⁶ Leukozyten. Nach Transfusion beträgt die Wiederfindung der Thrombozyten im peripheren Blut nur 60–70 %, da der Rest in der Milz festgehalten wird. Bei Sepsis, disseminierter intravasaler Gerinnung oder Präsenz von Thrombozyten Antikörpern ist die Wiederfindung geringer. Frische Spenderthrombozyten sind im peripheren Blut 7–10 Tage nachweisbar. Die Thrombozytenzahl sollte vor, 1 h nach und 20 h nach Transfusion gemessen werden. Liegt ein refraktärer Zustand vor, so beträgt der Anstieg nach 1 h < 7,5 × 10⁹/l und nach 20 h < 4,5 × 10⁹/l. Empfehlungen zur Transfusion gibt Tab. 15.11-5 – Empfehlung zur Thrombozytentransfusion.

Kritisch Kranke haben häufig Störungen der Hämostase. Eine schwere Thrombozytopenie < 50 × 10⁹/l lag in einer Multicenter Studie /18/ zu 13,7 % vor. 35,4 % der Patienten mit schwerer Thrombozytopenie starben auf der Intensivstation. Die Gabe von Thrombozytenkonzentraten war sehr inkonsistent. Etwa 40 % der Transfusionen erfolgten bei einer Thrombozytenzahl > 50 × 10⁹/l und 34 % obwohl bei dieser Thrombozytenzahl am Tag der Transfusion keine signifikante Blutung vorlag. Bei einer Transfusion von im Mittel 1,7 Einheiten betrug der Thrombozytenanstieg im Mittel 18,5 × 10⁹/l [Interquartile range (2,0–35,5) × 10⁹/l].

Bei Patienten mit schwerer Thrombozytopenie und einer Plättchenzahl von [(10–50) × 10⁹/l] beeinflusste die Nichtgabe von Thrombozytenkonzentrat bevor ein zentraler Venenkatheder gelegt wurde, nicht den unteren Grenzwert, noch führte dies zu mehr Blutungsereignissen /63/.

15.11.6.3 Erkrankungen mit Thrombozytosen und Thrombozytopenien

• Erkrankungen und Zustände mit primärer Thrombozytose sind aufgeführt in Tab. 15.11-6 – Erkrankungen und Zustände mit primärer Thrombozytose.
• Erkrankungen und Zustände mit sekundäre Thrombozytose zeigt Tab. 15.11-7 – Erkrankungen und Zustände mit sekundärer Thrombozytose.
• Thrombozytopenien aus unterschiedlicher Genese sind aufgeführt in Tab. 15.11-8 – Thrombozytopenien unterschiedlicher Genese.
• Thrombozytopenien der Schwangerschaft zeigt Tab. 15.11-9 – Thrombozytopenien in der Schwangerschaft.

15.11.6.4 Mittleres Plättchenvolumen (MPV)

Das MPV kann in Kombination mit der Verteilungsbreite der Thrombozyten eingesetzt werden, um Zustände mit verminderter Bildung von solchen mit vermehrter Zerstörung der Thrombozyten zu unterscheiden.

15.11.6.4.1 Akute Blutung

Bei einer deutlichen Verminderung der Thrombozytenzahl ist das MPV erhöht und die Platelet Distribution Width (PDW) verbreitert.

15.11.6.4.2 Bildungsstörung der Thrombozyten

Bei aplastischer Anämie, megaloblastärer Anämie, Chemotherapie maligner Tumoren, akuter Leukämie, systemischen Lupus erythematodes sind die Thrombozytenzahl und das MPV vermindert. Die PDW ist verbreitert. Bei Besserung des klinischen Bildes oder nach Chemotherapie erfolgt ein Anstieg des MPV vor der Thrombozytenzahl.

15.11.6.4.3 Immunthrombozytopenie

Das MPV und die PDW sind normal.

15.11.6.4.4 Hereditäre Thrombozytopenie

Alle Thrombozytopenien mit X-gebundener rezessiver Vererbung haben ein geringes MPV mit einer links verschobenen log-normalen Volumenverteilung, z.B. Wiskott-Aldrich Syndrom.

Hereditäre Thrombozytopenien mit Makrothrombozyten und erhöhter PDW /15/: Alport Syndrom, May-Hegglin Anomalie, Sebastian Anomalie, v. Willebrand Typ IIB Erkrankung, Bernard-Soulier Syndrom, mediterrane Makrothrombozytopenie, autosomal dominante Thrombozytopenie /15/.

15.11.6.4.5 Reaktive Thrombozytose

Unter reaktiven Bedingungen mit Erhöhung der Zahl an Thrombozyten durch Ausschüttung aus dem Milzpool, wie das bei Infektionen, Tumoren, rheumatoider Arthritis, Pankreatitis oder nach operativen Eingriffen der Fall ist, sind MPV und PDW normal. Bei myeloproliferativen Syndromen kann das MPV erhöht und die PDW verbreitert sein.

15.11.6.4.6 Splenektomie

Thrombozytenzahl und MPV können erhöht, die PDW verbreitert sein.

15.11.6.4.7 MPV, Stoffwechsel und ischämische Herzerkrankung

Thrombozyten mit höherem MPV haben im Vergleich zu denjenigen mit normalen Werten eine höhere Stoffwechsel Aktivität und ein höheres thrombotisches Potential. Ein erhöhtes MPV ist mit der Obesitas, dem Diabetes mellitus und ischämischen kardiovaskulären Ereignissen assoziiert. In einer Studie /20/ hatten Patienten mit akutem Koronarsyndrom ein höheres MPV und eine niedrigere Thrombozytenzahl als gesunde Kontrollen und Patienten mit stabiler Angina. So betrugen die Mittelwerte bei jeweils 60 Untersuchten:

• Gesunde Kontrollen; 257 × 10⁹/l, MPV 9,1 fl.
• Stabile Angina; 267 × 10⁹/l, MPV 10,0 fl.
• Akutes Koronarsyndrom; 201 × 10⁹/l, MPV 11,0 fl.

15.11.6.5 Immature Platelet Fraction (IPF)

Bei Thrombozytopenien ist die Unterscheidung wichtig, ob diese aus einem Versagen oder einer Hemmung des Knochenmarks, einem erhöhten peripheren Verbrauch von Thrombozyten oder einer peripheren Zerstörung der Thrombozyten resultieren. Bei den letzteren beiden Ursachen schüttet das Knochenmark unreife Thrombozyten mit einem hohen RNA Gehalt aus. Diese Thombozyten sind das Plättchenanalog der Retikulozyten bei der Erythropoese und werden auch als Reticulated platelets bezeichnet. Reticulated platelets sind identisch mit der IPF.

Der Anteil der Reticulated platelets bzw. die IPF reflektiert die Rate der Thrombopoese. Der Referenzbereich der IPF beträgt 1,1–6,1 %. Eine besonders hohe IPF wird bei der autoimmunen Thrombozytopenie (9,2–33,1 %) und der akuten thrombozytopenischen Purpura (11,2–30,9 %) nachgewiesen.

Unter adäquater Therapie fällt die IPF ab und die Thrombozytenzahl steigt an /19/.

15.11.7 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Die Zählung der Thrombozyten mit Hämatologie Analyzern zeigt bei thrombozytopenischen Patienten Abweichungen bei den verschiedenen Zählmethoden. Ursachen sind:

• Die Unfähigkeit zwischen Thrombozyten, fragmentierten Erythrozyten und Mikrozyten zu unterscheiden. Auch können bei chronisch lymphatischer Leukämie Fragmente von Kernen und Zytoplasma der Lymphozyten als Thrombozyten mitgezählt werden.
• Makrothrombozyten werden bei der Impedanzzählung und den eindimensionalen optischen Methoden von der Thrombozytenzählung ausgeschlossen.
• Pseudothrombozytopenie wird häufig durch Verklumpung von Thrombozyten verursacht, die Pseudothrombozytose verursacht durch die Fragmentierung von roten Blutzellen ist selten.

Lipämie

Die Thrombozytenzahl wird mit der Fluoreszenzmethode, der optischen Methode und der Impedanzmethode gemessen. Die Fluoreszenzmethode misst die wahre Throbozytenzahl in lipämischen Proben besser als die optische Methode und die Impedanzmethode /61/.

Immunoplatelet counting

Auch das Immunoplatelet counting ist nicht frei von Nachteilen. So können /6/:

• Plättchenaggregate, Plättchenkomplexe mit Leukozyten und Makrothrombozyten am Flowzytometer zu Gating-Problemen führen.
• Antikörper abhängig (CD 41, CD 42b, CD 61) beim Bernard-Soulier Syndrom und der Thrombasthenia Glanzmann keine Thrombozyten gezählt werden.
• Autoantikörper gegen Thrombozyten bei Patienten, die eine Therapie gegen Glykoproteine, z.B. Anti-GP IIb/IIIa (Reopro) haben, die Bestimmung stören.

Kontrolle der Thrombozytenzählung

Bei klinisch unklarer Thrombozytopenie muss das Labor mit einem anderen Verfahren nochmals bestimmen.

Referenzbereich

Geschlecht, genetischer Hintergrund und besonders das Alter sind wesentlich für den Referenzbereich der Thrombozyten. Der Alterseffekt ist sehr viel größer als der von Geschlecht und Ethnie. Die Referenzintervalle (2,5 und 97,5 Perzentile) in der globalen Bevölkerung sind wie folgt (× 10⁹/l): Alle unter 15 J. 176–452; Frauen 15–64 J. 156–405; Männer 15–64 J. 141–364: Frauen > 64 J. 140–379; Männer > 64 J. 122–350 /22/.

Pseudothrombozytose

Abnorm gestaltete Erythozyten in Form der Sphärozyten, Mikrosphärozyten und Zellen mit Ausstülpungen können die Ursache einer Pseudothrombozytose bei Patienten mit schweren Verbrennungen sein. Die Hitze-bedingte Zerstörung der Zellmembran der roten Blutzelle kann Zellen von kleiner Gestalt generieren, die dann inkorrekt als Thrombozyten von den Blutzellcountern gezählt werden /62/.

Intraindividuelle Variation

VK im Tagesablauf 6,7 %, von Tag zu Tag 11,5 %, von Monat zu Monat 10,6 % /21/.

Stabilität

Die Thrombozytenzahl ist bei Raumtemperatur mindestens 24 h stabil, an einigen Hämatologie Analyzern bis zu 168 h.

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15.12 Leukozytenzahl

Lothar Thomas

Leukozyten werden im Knochenmark und Lymphorganen gebildet, benutzen die Blutbahn als Transportweg und üben ihre Wirkung in den Geweben aus. Unterschieden werden:

• Neutrophile Granulozyten; sie sind im Gefäßsystem in zwei Pools von etwa gleicher Größe aufgeteilt. Nur die Zellen des zirkulierenden Pools werden bei der Blutentnahme erfasst, nicht aber der Randpool, in dem die Zellen locker an die Gefäßintima adhäriert sind. Zwischen Randpool und zirkulierendem Pool besteht ein konstanter Austausch von Zellen. Die Lebenszeit der neutrophilen Granulozyten im Blut ist 21 h, die Lebenszeit im Gewebe 4–5 Tage. Neutrophile Granulozyten sind phagozytierende Zellen und stehen in vorderster Front in der Abwehr infektiöser Erreger. Siehe Beitrag 19.7 – Granulozyten-Funktionsprüfung.
• Eosinophile Granulozyten; diese Zellen starten die Synthese ihrer granulären Proteine beim Übergang vom eosinophilen Myeloblasten zum Promyelozyten. Interleukin-5 ist ein wichtiger Überlebensfaktor in der Reifung der Eosinophilen und verhindert die Apoptose. Die Eosinophilen reagieren auf immunologische Stimuli und sind wichtige Effektorzellen in allergisch und parasitär inflammatorischen Geschehen. Sie zirkulieren nur wenige Stunden im Blut bevor sie in die Gewebe übertreten.
• Basophile Granulozyten differenzieren wie die Eosinophilen von agranulären Progenitorzellen und verlassen als reife Zellen das Knochenmark. In den Geweben halten sie sich in den kleinen Blutgefäßen und postkapillären Venulen auf und wandern nach einem Stimulus in das Interstitium. Sie spielen eine wichtige Rolle in der frühen Phase der IgE-vermittelten allergischen Reaktion. Bei Kontaktallergien setzen in der Haut lokalisierte basophile Granulozyten über Tage den Inhalt ihrer Granula frei.
• Monozyten zirkulieren im Blut mit einer Transitzeit von 14 h und sind wie die neutrophilen Granulozyten auf zwei Pools verteilt. Nach Übertritt in die Gewebe können die Zellen aktiviert werden und transformieren dann in metabolisch aktive Makrophagen. Sowohl durch Phagozytose von Entzündungs Erregern, als auch durch die Bildung proinflammatorischer Zytokine und die Aktivierung des Immunsystems erfolgt die von Makrophagen gestützte Immunabwehr.
• Lymphozyten umfassen B-Zellen, T-Zellen und Natural Killer (NK)-Zellen. Die Zellen sind morphologisch nicht unterscheidbar. Siehe auch Kapitel 21 – Immunsystem.

15.12.1 Indikation

Die Bestimmung der Leukozytenzahl und der Subpopulationen ist indiziert bei:

• Erstuntersuchungen im Rahmen des maschinellen Blutbildes.
• Verdacht auf hämatologische Erkrankung (abnorme Blutzellzahl, Hämolyse, Thrombose, Lypmphknotenschwellung, Splenomegalie)
• Entzündung, Infektion, Gewebsnekrose, toxische Störung der Hämatopoese (Medikamente, Bestrahlung).
• Fieber, Schock, Atembeschwerden, abdominellen Schmerzen, Beschwerden im Urogenitalbereich, Kopfschmerz, Bewusstseinsstörung.
• Häufung bakterieller Infektionen.
• Allergischen Erkrankungen und Helminthosen.
• Verlaufs- und Therapiebeurteilung der genannten Symptome und Beschwerden.

15.12.2 Bestimmungsmethode

Automatisierte Hämatologie Analyzer mit einem breiten Spektrum an Parametern und einem hohen Probendurchsatz werden in der klinischen Routine eingesetzt.

15.12.2.1 Kammerzählung

Blutverdünnung in Mischpipette aus 1 Teil Blut und 10 Teilen Verdünnungslösung (Essigsäure 1–3 % oder Türk’scher Lösung) herstellen und gut mischen. Dadurch werden die Erythrozyten hämolysiert und die Leukozytenkerne besser lichtbrechend. Zählkammer, z.B. Neubauer Kammer, mit verdünnter Probe füllen und 4 Eckquadrate (4 mm²) auszählen. Leukozytenzahl (10⁹/l) = Summe der insgesamt gezählten Zellen × 25 × 10⁶. Der Variationskoeffizient der Kammerzählung liegt bei niedrigen Leukozytenzahlen um 15 % und verbessert sich bei normalen oder erhöhten Zahlen bis auf 6,5 %. Zur Überprüfung der Richtigkeit von Zellzählungen an den Hämatologie Analyzern ist die Kammerzählung nicht ersetzbar.

15.12.2.2 Hämatologie Analyzer

Die Zählung und Differenzierung der Leukozyten erfolgt optisch, durch eine Kombination von Impedanz und optischer Methode oder durch die Kombination von optischer Methode und zytochemischer Reaktion. Zuvor werden jedoch die Erythrozyten mit einem Detergens zerstört /1, 2/.

Volumen-Konduktivität-Streulicht Technologie

Eine spezifische Menge Erythrozyten freier Zellsuspension fließt durch eine schmale Apertur, die zwischen zwei Elektroden gelegen ist. Passiert eine Zelle die Apertur, wird ein momentaner Anstieg der Impedanz in Form eines elektrischen Impulses registriert. Die Amplitude des Pulses ist dem Zellvolumen proportional. Es werden die Impulse von Zellen mit einem Volumen über 35 fl registriert.

Zur Differenzierung der Leukozyten werden z.B. durch Konduktivitäts Messung, unter Anwendung von hochfrequentem Wechselstrom, die intrazellulären Bestandteile wie Kernstruktur und Kern/Plasma-Relation erfasst. Durch die zusätzliche Messung der Streuung von Laserlicht werden die Oberflächenstruktur und die Granularität der Zelle registriert. Insgesamt können durch die simultane Messung von Volumen, Konduktivität und Streulicht die Zellen den fünf Leukozytenpopulationen Lymphozyten, Monozyten, neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten zugeordnet werden. Die Ergebnisdarstellung erfolgt in einem zwei- oder dreidimensionalen Histogramm. Auf der x-Achse wird die Laserlichtstreuung, auf der y-Achse das Volumen und auf der z-Achse die Konduktivität aufgetragen (Abb. 15.12-1 – Hämatogramm der Leukozytendifferenzierung nach dem Volumen-Konduktivitäts-Streulicht Prinzip).

Durchflusszytometrie und Zytochemie: Diese Systeme führen die Differenzierung der Zellen in zwei separaten Kanälen durch, die als Peroxidase- und Basophilen/Lobularitäts-Kanal bezeichnet werden. Im Peroxidasekanal erfolgt die Differenzierung der Leukozyten auf Grund ihrer Größe und des Myeloperoxidase (MPO) Gehalts. Im Leukogramm werden die Leukozyten in einem Koordinatensystem als Wolken dargestellt, wobei die MPO auf der x-Achse und das Volumen auf der y-Achse aufgetragen wird. Große Zellen mit hohem MPO-Gehalt, wie neutrophile Granulozyten, sind im Hämogramm rechts oben, kleine MPO freie Zellen wie Lymphozyten links unten aufgeführt. Die Differenzierung der Basophilen geschieht nach Entfernung des Zytoplasmas durch sauren Puffer und Zählung der Kerne (Nukleogramm) im Basophilen-/Lobularitäts-Kanal. Siehe Abb. 15.12-2 – Hämatogramm der Leukozytendifferenzierung von kombinierter Durchflusszytometrie- und Zytochemie-Technik.

15.12.2.3 Blutausstrich

Zelldifferenzierung siehe Beitrag 15.13 – Blutausstrich.

15.12.3 Untersuchungsmaterial

• EDTA-Blut: 1 ml
• Kammerzählmethode, Kapillarblut: 0,1 ml

15.12.4 Referenzbereich

Siehe Lit. /3, 4, 5, 6, 7, 8/ und Tab. 15.12-1 – Referenzbereiche der Leukozyten. Referenzbereiche für die Subpopulationen von Lymphozyten bei Kindern siehe Lit. /73/.

15.12.5 Bewertung

Das stufenweise hämatologische Vorgehen ist wichtig bei Patienten, wenn bei Untersuchungen eine abnorme Zahl von Leukozyten bestimmt wird.

15.12.5.1 Klassifizierung abnormer Leukozytenzahlen

Bei Patienten mit einer pathologischen Zahl an Leukozyten sollte weiterführend nochmals ein Blutbild inklusive eines Differentialausstrichs durchgeführt werden. Im maschinell erstellten Differentialzellbild sollten die differenzierten Leukozyten in absoluten Zahlen angegeben werden. Der Differentialausstrich wird untersucht auf atypische Zellen, neoplastische Zellen und Parasiten.

Leukozytenzahl

Leukozytenzahlen von (10–4) × 10⁹/l werden im Rahmen einer Screening-Untersuchung als sicher normal, von (4–2,5) × 10⁹/l als grenzwertig und unter 2,5 × 10⁹/l als sicher pathologisch eingestuft. Raucher können Werte bis 12 × 10⁹/l, starke Raucher bis zu 15 × 10⁹/l haben. In einer Untersuchung hatten Nichtraucher Werte von im Median 6,1 × 10⁹/l, die von Rauchern lagen 10 % höher /7/.

Veränderungen der Leukozytenzahl beruhen vorwiegend auf einer Änderung der Anzahl von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) oder von Lymphozyten. Die PMN haben beim Gesunden einen relativen Anteil von 40–75 % an der Leukozytenzahl. Bei den Leukozytosen stehen ursächlich die Infektionen im Vordergrund. So ist die typische akute Infektion gekennzeichnet durch folgende Abläufe: Neutrophile Kampfphase, monozytäre Überwindungsphase und lymphozytär eosinophile Heilphase. Bei den chronischen Infektionen kann jede der drei Phasen fortbestehen, je nachdem, ob die akute (Neutrophilie), subakute oder remittierende (Monozytose) oder chronische (Lymphozytose) Phase fortbesteht. Virusinfektionen und gewisse bakterielle Infektionen, wie Typhus abdominalis, folgen gewöhnlich nicht dem geschilderten Ablauf.

Leukozytopenien sind häufig Medikamenten bedingt, beruhen auf Erkrankungen des Knochenmarks, z.B. Neoplasien und Leukosen, werden durch eine hereditäre Bildungsstörung, immunsupprimierende Erkrankungen oder Sepsis verursacht.

Ausstrich des peripheren Blutes

Ist die Leukozytenzahl erhöht, gibt die mikroskopische Untersuchung des peripheren Blutausstrichs folgende weitere Information:

• Granulozytose, Lymphozytose oder Monozytose?
• Linksverschiebung, toxische Granulation?
• Eosinophilie, Basophilie?
• Atypische Zellen, Vorläuferzellen, Blasten?
• Haarzellen?
• Morphologie der roten Blutzellen?
• Kernhaltige rote Blutzellen?

Wichtige weitere Informationen

Initiale Fragestellungen zur weiteren Diagnostik sind:

• Liegen klinische Informationen vor?
• Besteht eine Infektion (z.B. Antikörper gegen Epstein-Barr-Virus)?
• Besteht eine Akute-Phase Reaktion (CRP erhöht)?
• Wie ist die Thrombozytenzahl?
• Besteht eine Anämie?
• Sind LDH, Harnstoff oder Harnsäure erhöht?
• Ist Haptoglobin erniedrigt (hämolytische Anämie)?

15.12.5.2 Neutrophile Granulozytose

Neutrophile Granulozyten

Die Vorläuferzellen von Polymorhic nuclear cells (PMN) im Knochenmark werden in teilungs- und nicht teilungsfähige Zellen differenziert. Die teilungsfähigen Zellen befinden sich im mitotischen Pool, die nicht mehr teilungsfähigen erfahren ihre postmitotische Reifung im Speicherpool. Zum mitotischen Pool gehören Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten, zum postmitotischen Pool Metamyelozyten, stabförmige und reife Granulozyten. Etwa 10 Tage verbringen die neu gebildeten und reifenden Zellen in den Pools bevor sie in die Blutbahn entlassen werden. Der Speicherpool im Knochenmark enthält 15–20 fach so viele Granulozyten wie das periphere Blut /10/. Die Kinetik der PMN zeigt Tab. 15.12-2 – Kinetik der neutrophil granulozytären Zellreihe.

In den ersten Stunden seines Lebens hat das Neugeborene eine starke Neutrophilie mit einem Gipfelwert nach 12 h von über 10 × 10⁹/l und ab dem 3. Tag kommt es zu einem kontinuierlichen Abfall mit stabilen Werten der Granulozyten im Bereich von 2,0–7,0 × 10⁹/l. Es besteht eine deutliche Linksverschiebung im Vergleich zu Kindern im 2. Lebensjahr. Gesunde Kinder mit sehr niedrigem Geburtsgewicht und ohne perinatale oder neonatale Komplikationen haben eine große Streuung der Leukozytenzahl und etwa 95 % werden als neutropenisch eingestuft unter Anwendung der Manroe-Kriterien (Abb. 15.12-3 – Neutrophilenzahl beim Neugeborenen) /4/.

Normalerweise werden nur PMN in das Blut entlassen. Das Knochenmark enthält demgegenüber mehr Stabkernige als PMN. Ist die Anforderung an PMN höher als das Knochenmark freisetzen kann, werden beständig mehr Stabkernige und Metamyelozyten freigesetzt. Steigt also im Blut der Anteil der Stabkernigen und eventuell auch der Metamyelozyten an, so ist das ein Zeichen der verstärkten Freisetzung von Granulozyten aus dem Mark und einer Verminderung des Speicherpools. Dieser Vorgang wird auch als Linksverschiebung bezeichnet.

Aus der Bestimmung der PMN im peripheren Blut ist nur eine begrenzte Information über die Neutrophilenmasse zu erhalten, da das Blut nur 5–10 % des Neutrophilenpools des Körpers enthält und nur 2 % des Lebenszyklus der PMN erfasst werden.

Drei Vorgänge können eine neutrophile Granulozytose bewirken /11/:

• Eine Verschiebung von PMN aus dem Randpool der Gefäße in den zirkulierenden Pool. Das ist der Fall bei schwerer Arbeit, psychischem Stress, Ausschüttung von Katecholaminen und der Verabreichung von Noradrenalin. Es kommt zu einem Anstieg um maximal den Faktor zwei gegenüber dem ursprünglichen Wert. Dieser Vorgang wird auch als Pseudoneutrophilie bezeichnet, da es zu keiner echten Erhöhung der PMN Zahl im Blut kommt.
• Vermehrte Freisetzung von PMN aus dem Speicherpool. Eine solche Leukozytose, z.B. als Antwort auf Endotoxin, dauert nur Minuten bis wenige Stunden.
• Verstärkte Granulopoese. Diese findet im Reifungspool statt und nach Stimulation des Knochenmarks dauert es mindestens 2–3 Tage bis es zu einer Vermehrung der Zellen im Speicherpool kommt. Bei proliferativem Stress, z.B. einer Infektion, kann die Granulopoese um den Faktor 20 gesteigert sein. Die Reifungszeit des PMN ist dann von 10 auf 2 Tage verkürzt. Bei starker peripherer Anforderung und leerem Speicherpool gelangen auch Zellen des mitotischen Pools wie Myelozyten und Promyelozyten direkt ins periphere Blut (leukämoide Reaktion). Genügt die Granulopoese nicht den Anforderungen der Gewebe, z.B. bei systemischer Infektion, kann es zur Neutropenie kommen, was bei der Sepsis in etwa 20 % der Fall ist.

Fc Rezeptorantigen CD64

Neutrophile Granulozyten exprimieren das Fc-Rezeptor-Antigen CD64. Das Antigen wird von myeloiden Stammzellen exprimiert und bleibt bis zum Stadium der Metamyelozyten erhalten. PMN und Stabkernige haben etwa nur 1.000 dieser Antigene auf ihrer Zellmembran. Neugeborene und Frühgeborene exprimieren einen höheren Anteil Antigene. Bei Aktivierung erhöhen die PMN die Anzahl der Antigene um das 5–10 fache und die Messung von CD64 der Neutrophilen erlaubt somit eine Unterscheidung zwischen gesund und Inflammation /12/.

Bei systemischer Inflammation wie bei Infektionen und Sepsis aktivieren proinflammatorische Zytokine wie IFN-γ, IL-1 und IL-6 sowie GCSF die Hochregulierung des CD64 auf den Granulozyten. In der Diagnostik einer systemischen Infektion soll CD64 eine diagnostische Sensitivität von 90 % bei einer Spezifität von 90–100 % haben im Vergleich zur Leukozytenzahl mit einer Sensitivität von 60 % bei einer Spezifität von 51 % /13/.

Neutrophilie

Eine Neutrophilie liegt vor, wenn die Anzahl neutrophiler Granulozyten und ihrer Vorstufen bei Schulkindern und Erwachsenen über 7,5 × 10⁹/l beträgt. Erhöhungen der Granulozyten sind ein Hinweis auf:

• Inflammation durch akut entzündliche Reaktionen wie Infektionen und akute Gewebsnekrosen. Bei chronischen Infektionen kann eine Neutrophilie auf Grund einer verstärkten Granulopoese bestehen. Die Anforderung der Peripherie an Granulozyten ist erhöht, es besteht aber eine Überkompensation der Granulopoese mit Ausbildung eines größeren Speicherpools.
• Eine myeloische Leukämie.
• Die Einnahme von Glukokortikoiden. Diese bewirken eine Neutrophilie auf Grund einer Steigerung der Granulopoese, einer verstärkten Migration vom Randpool in den zirkulierenden Pool der Gefäße und einer verminderten Wanderung der Granulozyten aus der Blutbahn.

Zur Diagnostik der neonatalen Sepsis werden die Manroe- und die Rodwell-Kriterien angewendet (Tab. 15.12-3 – Kriterien der neonatalen Sepsis). Zustände und Erkrankungen mit neutrophiler Granulozytose sind aufgeführt in Tab. 15.12-4 – Erkrankungen und Zustände mit Neutrophilie.

15.12.5.3 Neutropenie

Die Neutropenie ist als eine Verminderung der PMN inklusive der stabförmigen Granulozyten definiert. Die Zahl wird an einem Hämatologie Analyzer bestimmt, und wenn dieser eine Verminderung anzeigt wird bei Werten unter 0,5 × 10⁹/l zur Kontrolle ein Blutausstrich ausgezählt und der Anteil (%) der PMN und stabförmigen Granulozyten mit der Leukozytenzahl multipliziert. Normalerweise ist bei gesunden Personen die Zahl der PMN über 1,5 × 10⁹/l bei Erwachsenen und Kindern über 5 J. Bei Personen afrikanischen Ursprungs und anderen ethnischen Gruppen z.B. in Israel und Jordanien sind Werte bis 1,0 × 10⁹/l noch normal. Diese Personen haben auch eine niedrigere Leukozytenzahl. So haben männliche Personen kaukasischen Ursprungs im Alter von 3–74 J. nur zu 25,2 % eine Leukozytenzahl unter 5,0 × 10⁹/l, diejenigen schwarzen Ursprungs aber zu 48,1 %. Beim weiblichen Geschlecht ist das Verhältnis 27,1 % zu 42,6 % /15/.

Die Neutropenie wird eingeteilt in /16/:

• Mild; die Neutrophilenzahl ist (1,5–1,0) × 10⁹/l.
• Moderat; die Neutrophilenzahl ist (1,0–0,5) × 10⁹/l.
• Schwer; die Neutrophilenzahl ist unter 0,5 × 10⁹/l.

Diese Klassifikation sagt das Risiko einer pyogenen Infektion voraus, wenn die Neutropenie länger als 2–3 Monate besteht. Nur Patienten mit schwerer Neutropenie haben ein Risiko bakterieller Infektionen /10/. Gewöhnlich erfolgt die Infektion durch die eigene Flora. Gingivitis, Ulzerationen und Soor der Mundhöhle sind die häufigsten Beschwerden.

Eine febrile Neutropenie liegt vor, wenn /17/:

• Die einmalig oral gemessene Temperatur über 38,3 °C oder ≥ 38 °C für mindestens 1 h ist und
• Die Neutrophilenzahl < 0,5 × 10⁹/l oder < 1,0 × 10⁹/l mit der Tendenz auf ≤ 0,5 × 10⁹/l abzufallen.

Bei schwerer Neutropenie nach Chemotherapie solider Tumoren ist eine Therapie mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (G-CSF, GM-CSF) indiziert, wenn diese länger als 10 Tage besteht oder Fieber > 38,1 °C vorliegt.

Ursachen der Neutropenie

• Die häufigste Ursache von Neutropenien beruht auf einer toxischen Störungen der Granulopoese durch Medikamente (Tab. 15.12-5 – Medikamente, die eine Neutropenie verursachen können).
• Kongenitale Neutropenien sind meist von schwerwiegender Natur (Tab. 15.12-6 – Kongenitale Neutropenien).
• Vielfältig sind die die Ursachen sekundärer Neutropenien (Tab. 15.12-7 – Sekundäre Neutropenien).
• Fieberhafte Infektionen mit Leukopenie sind aufgeführt in Tab. 15.12-8 – Akute fieberhafter Infektionen mit Leukopenie und/oder Thrombozytopenie.

15.12.5.4 Lymphozytose

Lymphozyten

Lymphozyten werden im Knochenmark und den sekundären Lymphorganen wie Milz und Lymphknoten gebildet. Die Lymphozyten des Blutes repräsentieren nur eine kleine Fraktion von etwa 2 % der Lymphozyten des Organismus. Diese sind in der Milz, den Lymphknoten und in den Organ assoziierten lymphatischen Systemen lokalisiert. Im Unterschied zu den Granulozyten können die Lymphozyten die Zirkulation frei verlassen und zwischen den Kompartimenten pendeln, ein Vorgang, der als Rezirkulation bezeichnet wird. Trotz der Rezirkulation besteht ein Gleichgewicht mit einer konstanten Lymphozytenzahl im Blut /10/. Da nur 2 % der Lymphozyten im Blut verweilen und das weniger als 1 h, kommen etwa 0,5 × 10¹² Lymphozyten, das sind alle Lymphozyten des Organismus, täglich in die Blutbahn und kehren in die Gewebe zurück (Homing) /18/. Die Lymphozytenzahl im Blut ist relativ konstant. Nur etwa 2 % zirkulieren im peripheren Blut, und das nur für etwa 1 Stunde /10/.

Die meisten Lymphozyten im Blut sind kleine intermitotische Zellen in der Ruhephase. Ein kleiner Teil ist von mittlerer Größe, stammt wahrscheinlich von den kleinen Lymphozyten ab und ist in einem aktivierten Zustand. Bei Infektionen treten zusätzlich große Lymphozyten mit grober eosinophiler Granulierung (Large Granular Lymphocytes, LGL) auf.

Lymphozyten sind Immunzellen und tragen vermittels Immunphänotypisierung erkennbare spezifische Merkmale auf ihrer Oberfläche.

Auf Grund ihrer funktionellen Aktivität in der Immunabwehr und ihren Oberflächenmerkmalen (CD-Klassifikation) werden drei Klassen von Lymphozyten unterschieden:

• Vom Thymus stammende T-Zellen, die primär für die Zell-vermittelte Immunität Verantwortung tragen.
• Aus dem Knochenmark und den sekundären Lymphorganen stammende B-Zellen. Sie sind die Vorläufer der Immunglobulin-bildenden Plasmazellen und Träger der humoralen Immunantwort.
• Nullzellen, auch als Natural Killer (NK)-Zellen bekannt. Sie tragen keine Lymphozytenmerkmale an ihrer Oberfläche und sind im Rahmen der Antigen-unspezifischen Immunabwehr aktiv. Sie unterscheiden sich auch morphologisch, denn ein Teil von ihnen sind die im Blutausstrich sichtbaren LGL.

Im peripheren Blut sind 65–80 % der Lymphozyten T-Zellen, 8–15 % B-Zellen und 10 % NK-Zellen. Die NK-Zellen rezirkulieren nicht wie die anderen Lymphozyten vom Blut über die Lymphknoten zum Blut zurück.

Die Lymphozytenzahl unterliegt erheblichen Einflüssen und ist am späten Nachmittag und abends höher als morgens. Nach kurzer körperlicher Belastung kommt es zur Lymphozytose, die auf einen gesteigerten Lymphfluss zurückgeführt wird. Nach längerer stärkerer Belastung und bei systemischer Infektion wie der Sepsis resultiert eine Lymphopenie und Eosinopenie mit einem Anstieg der PMN.

Large granular lymphocytes (LGL) /19/

Als Antwort auf den Organismus attackierende Pathogene reagieren zwei verschiedene Zelltypen, die zytotoxischen T-Lymphozyten und die Natural killer cells (NK-Zellen). Morphologisch sind beide identisch und präsentieren sich mikroskopisch als große Lymphozyten mit azurophilen Granula im Zytoplasma. Funktionell sind sie jedoch verschieden und erkennen die Antigene über T-Zell- und NK-Zellrezeptoren.

Beim Gesunden sind nur ein kleiner Anteil der zirkulierenden Lymphozyten LGL. Die Mehrzahl der LGL sind zytotoxische T-Zellen des Phänotyps CD3⁺ CD8⁺CD4^–, während die wenigen NK-Zellen vom Phänotyp CD3^–CD16⁺ sind.

Die polyklonale Vermehrung von LGL erfolgt reaktiv und transient im Rahmen von Virusinfektionen (EBV, Cytomegalievirus), Autoimmunerkrankungen, Malignomen und teilweise auch nach Splenektomie.

Die klonale Proliferation von LGL wird über einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten, unabhängig davon, ob die Patienten symptomatisch sind oder nicht. Die Proliferation kann die T-Zell- und NK-Zellen betreffen, obwohl die WHO letztere als separate Erkrankung mit der Definition chronisch lymphoproliferative Erkrankung der NK-Zellen bezeichnet.

Die T-Zell LGL-Leukämie ist eine klonale Proliferation enddifferenzierter zytotoxischer T-Zellen mit einem funktionellen α/β⁺T-Zellrezeptor und dem Muster CD8⁺CD4^– oder selten CD4⁺CD8^–/+dim.

Wenig ist bekannt über die NK-Zell lymphoproliferativen Erkrankungen.

Lymphozytose

Bei Erwachsenen besteht eine Lymphozytose bei einer Zellzahl von > 4,0 × 10⁹/l. Bei Kindern ist der Referenzbereich altersabhängig (Abb. 15.12-4 – Altersabhängigkeit der Lymphozytenzahl bei Kindern). So ist der untere Referenzbereichswert im Alter von 8 Monaten 4,5 × 10⁹/l und 1,0 × 10⁹/l im Alter von 18 Jahren /20/.

Lymphozytosen treten auf bei:

• Viralen Infektionen wie der infektiösen Mononukleose. Viele der Lymphozyten sind durch das Epstein-Barr Virus transformiert und zeigen im Blutausstrich ein buntes Bild. Das Virus infiziert nur B-Zellen, keine T-Zellen. Die Lymphozytenzahl beträgt (6–15) × 10⁹/l. Ein ähnliches Bild mit transformierten Lymphozyten wird auch bei der Zytomegalie und der Virushepatitis gefunden. Bei diesen Infektionen ist die Lymphozytenzahl nur leicht oder nicht erhöht.
• Infektionen wie Toxoplasmose, Typhus abdominalis, Brucellose oder Pertussis. Bei Pertussis kann die Lymphozytenzahl über 20 × 10⁹/l sein, die Lymphozyten sind kleine, normal erscheinende Zellen /10/.
• Neoplasien des lymphatischen Systems wie bei der akuten und der chronisch lymphatischen Leukämie und gelegentlich beim Non-Hodgkin Lymphom.

Hinweise auf eine lymphozytäre Neoplasie sind:

• Lymphozytenzahl über 5 × 10⁹/l
• Mehr als 5 % Kernschatten im Blutausstrich
• Atypische Zellen, z.B. Prolymphozyten, Mantelzellen, Sezary-Zellen
• Hinweise auf Lymphoproliferation (Lymphadenopathie, Splenomegalie, B-Zellsymptomatik)
• Thrombozytopenie und/oder Anämie

Weiterführend wichtig sind die Immunphänotypisierung des peripheren Blutes und die Histopathologie der Lymphknoten. Die Knochenmarksdiagnostik (Zytologie, Histopathologie, Zytogenetik) kann indiziert sein.

15.12.5.5 Lymphopenie

Abhängig von der Literaturangabe werden Lymphopenien bei Erwachsenen als eine Zellzahl unter 1,5 × 10⁹/l, bzw. unter 1,0 × 10⁹/l definiert /20/.

Bei Kindern sind die unteren Referenzbereichswerte altersabhängig (Abb. 15.12-4 – Altersabhängigkeit der Lymphozytenzahl bei Kindern).

Erkrankungen und Zustände mit Lymphopenie sind dargestellt in Tab. 15.12-9 – Erkrankungen und Zustände mit Lymphopenie.

Kleinkinder im Alter unter 3 Monaten, die ohne vorbestehende Grundkrankheit notfallmäßig mit akuter Symptomatik eingewiesen werden, benötigen häufiger lebensrettende Maßnahmen, wenn sie eine Lymphopenie haben. So mussten von 42 lymphopenischen Kindern 26 in die pädiatrische Intensiveinheit aufgenommen werden, von der gleichen Anzahl nicht-lymphopenischer Kinder aber nur eins /22/.

15.12.5.6 Monozytose

Monozyten

Die Monozyten werden im Knochenmark gebildet und teilen sich mit den Granulozyten eine gemeinsame Stammzelle. Im Verlaufe der Reifung trennen sich die Wege, jedoch haben im Knochenmark der Promonozyt und der Promyelozyt eine nahezu gleiche Morphologie und ihre kleine Population wird in die neutrophilen Vorläuferzellen bei der Zählung integriert. Sie sind nur durch die Esterase Färbung unterscheidbar. Nach zwei bis drei Zellteilungen werden die Monozyten in das Blut entlassen. Es gibt keinen den neutrophilen Granulozyten vergleichbaren Speicherpool. Nach einer Transitzeit von 14 h verlassen sie das Blut und wandern in die Gewebe ein. Dort reifen sie und die Natur der Reifung, z.B. ihre Ausstattung mit Enzymen, ist abhängig vom Ort der Reifung. So haben sie als Alveolarmakrophagen der Lunge eine andere Proteinausstattung als die Kupfferschen Sternzellen der Leber oder die Peritonealmakrophagen. In den Geweben können die Makrophagen fusionieren unter Bildung großer Zellen wie den Langerhans’schen Riesenzellen, die bei granulomatösen Entzündungen wie der Tuberkulose gefunden werden. Auch kann der Makrophage wie der Lymphozyt sich bei einer erhöhten Anforderung teilen /10/. Wichtige Aufgaben des Makrophagen sind die Phagozytose und Abtötung von Mikroben. Die internalisierten Erreger werden prozessiert und in Verbindung mit einem HLA-Klasse-II-Antigen den T-Helferzellen präsentiert (siehe Beitrag 21.1.2 – Natürliche Barrieren zum Schutz der Immunität).

Bei einer Inflammation geht am Ort des Geschehens in einer ersten Welle die Extravasation der PMN derjenigen der Monozyten voraus. Denn die Granula der PMN setzen Proteine frei, die eine Expression von β-Integrin-Rezeptoren und Formylpeptid-Rezeptoren der Gefäßwand stimulieren, an die aktivierte Monozyten anheften. Am Entzündungsort setzen der Apoptose anheim fallende PMN Lysophosphatidylcholin frei, das an die G2A-Rezeptoren der Monozyten bindet und diese zum Ort des Geschehens lockt /23/.

Monozytose

Die Erhöhung der Monozytenzahl über 0,9 × 10⁹/l bei Erwachsenen und Schulkindern wird als Monozytose bezeichnet. Neugeborene und Kleinkinder haben einen höheren oberen Referenzbereichswert. Monozytosen kommen bei Infektionen, Autoimmunerkrankungen, hämatologischen Systemerkrankungen, soliden Tumoren und verschiedenen anderen Ursachen vor. Bei infektiösen Erkrankungen ist die Verteilungsbreite der Monozyten erhöht. Erkrankungen und Zustände mit Monozytose sind aufgeführt in Tab. 15.12-10 – Erkrankungen und Zustände mit Monozytose.

Hinweise auf eine monozytäre Neoplasie sind:

• Unreife Monozyten (Promonozyten) oder Blasten
• Thrombozytopenie und/oder Anämie.
• Infiltration eines Organs (Haut, Lunge, Milz)
• Nicht erklärbare Monozytose.

Wichtig ist die Untersuchung des Knochenmarks (Zytology, Histopathologie, Zytogenetik).

15.12.5.7 Eosinophilie

Eosinophiler Granulozyt

Der eosinophile Granulozyt geht als Zelle der myeloischen Reihe aus einer pluripotenten Stammzelle hervor, die sich unter dem Einfluss von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren differenziert. Das Knochenmark Gesunder hat einen Eosinophilenanteil von etwa 3 % an den hämatopoetischen weißen Blutzellen, davon sind ein Drittel Promyelozyten und Myelozyten, 26 % Metamyelozyten und ein Drittel reife Eosinophile, die sich im Speicherpool aufhalten. Die polyklonale Synthese Eosinophiler erfolgt nach Stimulation durch GM-CSF, IL-3 und IL-5. Nach etwa 4 Tagen migriert der reife Eosinophile in das Blut, verbleibt dort 6–18 h und tritt dann in das Gewebe über.

Auf der Schleimhaut der Atemwege und des Gastrointestinaltraktes sowie in der Haut hält er sich 2–5 Tage auf und fällt der Apoptose anheim, wenn diese nicht durch GM-CSF, IL-3 und IL-5 aufgehalten wird. Der tägliche Turnover der Eosinophilen beträgt 2,2 × 10⁸ Zellen/kg KG, der postmitotische Speicherpool enthält (9–14) × 10⁸ Zellen/kg KG /24/.

Eosinophilie

Eine Eosinophilie im Blut zieht eine um das 100 fach stärkere Eosinophilie im Zielgewebe nach sich. Auch wenn die Eosinophilenzahl im Blut gering ist, kann die Konzentration in den Geweben hoch sein.

Die Eosinophilenzahl im Blut zeigt diurnale Schwankungen. Der höchste Wert wird abends, der niedrigste morgens gemessen.

Eine Eosinophilie liegt bei einer Zellzahl von > 0,5 × 10⁹/l vor.

Klassifiziert wird die Eosinophilie in:

• Leichte Form mit bis zu 1,5 × 10⁹/l.
• Schwere Form mit > 1,5 × 10⁹/l.

Besteht eine Eosinophilie sollte gedacht werden /25/:

• Zuerst an ein reaktives Geschehen wie eine allergische/atopische Erkrankung, Urtikaria, parasitäre Infektion, maligne Erkrankung oder eine vaskuläre Kollagenkrankheit.
• Können diese Ursachen ausgeschlossen werden und persistiert die Hypereosinophilie, ist die Diagnose eines idiopathischen hypereosinophilen Syndroms wahrscheinlich, dies insbesondere, wenn die Hypereosinophilie länger als 6 Monate besteht und die Eosinophilie über 1,5 × 10⁹/l beträgt.

Die Akkumulation von Eosinophilen im Blut und den peripheren Geweben kann beruhen /26/:

• Auf einer Störung der myeloischen Zelllinie (primäre Eosinophilie). Diese kann spät im Ablauf der eosinophilen Differenzierung erfolgen und zur seltenen Diagnose der eosinophilen Leukämie führen. Ist die Störung im frühen Ablauf der Differenzierung und sind die Eosinophilen der Bestandteil eines malignen Klons, der auch andere myeloische Zellen oder sogar lymphoide Zellen bildet, dann ist die Eosinophilie ein Geschehen im Rahmen einer myeloproliferativen Erkrankung.
• Auf der verstärkten Bildung Eosinophile stimulierender Zytokine durch nicht myeloische Zellen (sekundäre Eosinophilie). Es resultiert eine polyklonale Bildung Eosinophiler. Stimuliert durch Entzündungsmediatoren wie IL-5, Eotaxin, Plättchen-aktivierenden Faktor, C5a und C3a wandern sie an den Entzündungsort im Gewebe und setzen aus ihren Granula gewebszerstörende Proteine wie das Eosinophile cationische protein (ECP) und reaktive Sauerstoffradikale frei /27/.

Zur Differentialdiagnostik der Eosinophilie siehe Tab. 15.12-11 – Differentialdiagnostik der Eosinophilie.

15.12.5.8 Basophilie

Basophile

Basophile Granulozyten haben einen Anteil von etwa 0,3 % an den Leukozyten im Blut und sind funktionell mit den Mastzellen verwandt /28, 29/. Beide Zelltypen exprimieren den funktionell aktiven IgE-Rezeptor und bilden die gleichen Effektormoleküle, z.B. Histamin, Lipidmediatoren (Leukotriene, Prostaglandine), Serinproteasen und Interleukine (IL-4, IL-13, IL-6).

Basophile verlassen das Knochenmark als reife Zellen und sind durch die Expression von FcεRI, CD49b, und den hochaffinen IL-3-Rezeptor CD123 charakterisiert. Unter basalen Bedingungen sind sie in niedriger Zellzahl im Knochenmark, der Leber und Milz und im peripheren Blut. Im Rahmen der spezifischen Immunantwort und bei bestimmten Inflammationen treten sie in periphere Gewebe und die Lymphknoten über.

Mastzellen vollführen ihre Reifung in den peripheren Geweben wie der Haut, dem Dünndarm und der Peritonealkavität. Sie sind durch die Expression von FcεRI und c-Kit charakterisiert. Unter Stimulation des Rezeptors (FcεRi) geben Basophile und Mastzellen Effektormoleküle frei.

Basophile beschleunigen die TH2-Immunantwort, da sie wenige Minuten nach Aktivierung IL-4 freisetzen. Die Aktivierung erfolgt durch Quervernetzung zweier an Oberflächen lokalisierter IgE-Moleküle oder durch eine große Zahl von Substanzen in Antigen unspezifischer Weise.

Basophilie

Erhöhungen der basophilen Granulozyten sind häufig mit Überempfindlichkeits Reaktionen vom Soforttyp assoziiert. Oft ist auch das Gesamt-IgE erhöht. Es besteht jedoch keine Beziehung zwischen der IgE-Erhöhung und der Basophilenzahl. Kleine Anstiege (> 2–3 %) können auf eine myeloproliferative Neoplasie hinweisend sein.

Eine Basophilie kann auftreten bei:

• Allergischen Entzündungen wie Überempfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln und Nahrungsmitteln, Erythrodermie, Urtikaria, rheumatoider Arthritis.
• Parasitärer Infektion.
• Stammzell Erkrankungen wie myeloischer Leukämie, myeloproliferativem Syndrom, M. Waldenstroem.
• Diabetes mellitus, Myxödem, Östrogenmedikation.
• Infektionserkrankungen wie Tuberkulose, Varizella, Influenza.
• Dem Postsplenektomie Syndrom.

15.12.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Zeitkritisch ist die Lyse der Erythrozyten. Ist die Lysezeit zu kurz oder sind relativ lyseresistente rote Blutzellen vorhanden, z.B. Retikulozyten, Erythrozyten von Neugeborenen, so wird die Leukozytenzahl zu hoch gemessen. Ist die Lysezeit zu lang oder sind die Leukozyten, z.B. bei Chemotherapie oder Sepsis, vorgeschädigt, so ist ihr Volumen kleiner als normal und sie werden nicht mitgezählt. Riesenthrombozyten können bei den Leukozyten mitgezählt werden. Kontrolle der Leukozytenzahl im Blutausstrich siehe Beitrag 15.13 – Blutausstrich.

Blutentnahme

Zuverlässige Werte werden im EDTA-Blut gewonnen; die Kapillarblutentnahme soll nur in Ausnahmefällen durchgeführt werden. Bei der Kapillarblutentnahme sind die ersten zwei Blutstropfen nach dem Einstich zu verwerfen.

Bei Neugeborenen und Kleinkindern ist die Leukozytenzahl von der Blutentnahme abhängig. Verglichen mit der kapillären Blutentnahme aus der Ferse erbringt die venöse nur 82 ± 3,5 % und die arterielle nur 77 ± 5,3 % der Leukozytenzahl. Blutentnahme nach heftigem Schreien führt zu einem Anstieg der kapillär entnommenen Leukozyten auf 146 ± 6,1 % gegenüber dem Ruhewert /30/.

IgM-vermittelte Neutrophilenagglutination

Beschrieben wurde ein Fall, der eine Pseudoneutropenie verursachte. Die Neutrophilen waren mit IgM-Antikörpern beladen /31/.

Kryoglobuline

Kryoglobuline führen bei Raumtemperatur und Zählung mit Hämatologie Analyzern zu einer Pseudoleukozytose. Es bilden sich in diesem Temperaturbereich Proteinkristalle mit der Größe von Leukozyten, die maschinell als Leukozyten erfasst werden. Bei Erwärmung der Probe auf 37 °C verschwinden die Proteinkristalle.

Intraindividuelle Variation

Der VK innerhalb eines Tages beträgt 19,9 %, von Tag zu Tag 16,3 % und von Monat zu Monat 17,3 % /32/.

Diurnale Variation

Die diurnale Variation ist morgens geringer als am späten Abend und nachts: um 12 Uhr nachts 9,5 × 10⁹/l und morgens zwischen 8 und 11 Uhr etwa 7 × 10⁹/l /72/.

Pseudoleukozytose

Eine Pseudoleukozytose kann bedingt sein durch kernhaltige rote Blutzellen (NRC), Kryoglobuline, Kryofibrinogen, Thrombozyzenklumpen, Mikroorganismen, Lyse-resistente Erythrozyten und Lipide. NRC werden häufig gesehen bei hämolytischer Anämie, massivem Blutverlust, schwerem Sauerstoffmangel, akuten und chronischen Leukämien, malignen Tumoren, Osteomyelofibrose.

Stabilität

Im EDTA-Blut bei Raumtemperatur und im Kühlschrank innerhalb von 72 h abhängig vom Analyzer /33/:

• Leukozyten gesamt; Abnahme um 0,6–5,1 %.
• Neutrophile; Zunahme von 1,3–10,3 %, bei einem anderen Analyzer Abnahme um 1,2 %.
• Monozyten; an einem Gerät Zunahme bis 31 % an den anderen Abnahme von 28–78 %.
• Lymphozyten; an einem Gerät bei Raumtemperatur Zunahme um 5 % bei den anderen Abnahme von 3–14 %.

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15.13 Blutausstrich

Lothar Thomas

Die mikroskopische Untersuchung des gefärbten Blutausstrichs ist eine wichtige Untersuchung zur Diagnostik primärer Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und seiner Kompromittierung im Rahmen anderer Erkrankungen.

Trotz des enormen technologischen Fortschritts durch Hämatologie Analyzer, Flowzytometer, Immunoassays, molekularbiologischer Methoden und Zytogenetik bleibt die mikroskopische Auswertung nach dem Blutbild die initiale Methode für eine weiterführende Diagnostik. Hämatologie Analyzer haben eine hohe Effizienz in der Zellzählung und Zelldifferenzierung, doch bei abnormen Zellzahlen oder wenn die Geräte Flags anzeigen, ist die mikroskopische Untersuchung des gefärbten Blutausstrichs weiterhin unerlässlich. Der Blutausstrich eröffnet dem Untersucher einen Einblick in die Struktur der Blutzellen, die durch automatisierte Zählung und Differenzierung allein nicht erfassbar ist /1, 2, 3, 4/.

Im Vordergrund der Auswertung stehen die Leukozyten, die durch verschiedene Färbungen weiter differenziert und quantifiziert werden können.

Die mikroskopische Durchmusterung eines Blutausstrichs hat zwei wichtige Zielsetzungen:

• Die initiale Diagnosesicherung und Therapiebeurteilung von Störungen der Blutbildung.
• Auch dient die mikroskopische Auswertung des Blutausstrichs der Qualitätssicherung der Ergebnisse von Hämatologie Analyzern.

Die International Consensus Group for Hematology Review hat 41 Kriterien erarbeitet, wann ein maschinelles Blutbild durch einen Blutausstrich ergänzt werden sollte. In Abwandlung der Kriterien beträgt in vielen Laboratorien der Anteil der Blutauststriche 10 % bei ambulanten und 20 % bei stationären Patienten /5/.

15.13.1 Indikation

Historisch erfolgte die Differenzierung von Blutzellen mikroskopisch. Heutzutage wenden aber die meisten hämatologischen Laboratorien Hämatologie Analysatoren an.

15.13.1.1 Entscheidungs orientierte mikroskopische Differenzierung

Eine Entscheidungs orientierte mikroskopische Differenzierung erfolgt noch bei bestimmten Fragestellungen nach der maschinellen Durchführung des Blutbildes und der Zelldifferenzierung.

Rote Blutzell Morphologie

Da Änderungen der Morphologie roter Blutzellen von den Hämatologie Analysatoren nicht erkannt werden ist die mikroskopische Untersuchung des Blutausstrichs wichtig /1/. Gründe zur Durchführung einer mikroskopischen Untersuchung auch bei normalem Blutbild sind:

• Die Erkennung von z.B. atypischen Erythrozyten, Erythroblasten, basophiler Tüpfelung, Howell-Jolly-Körperchen, Erkennung und Differenzierung der Malaria.
• Eine Familienanamnese auf Erkrankung der Erythropoese.
• Erkennung eines hyposplenischen Blutbildes oder eines Blutbildes nach Splenektomie.
• Nachweis von Parasiten im Blut.

Morphologie der Leukozyten

Es gibt folgende wichtige Gründe /2/:

• Bestätigung der maschinell ermittelten Leukozytenzahl wenn diese bezweifelt wird.
• Differenzierung atypischer Leukozyten.
• Erkennung morphologischer Abweichungen innerhalb einer Zellpopulation.
• Bei der weißen Reihe in der Erkennung von z.B. Blasten und anderen unreifen Zellen, stabkernigen und jugendlichen Granulozyten und hypersegmentierten Neutrophilen.

Morphologie der Thrombozyten

Es gibt folgende wichtige Gründe /4/:

• Bestätigung der maschinell ermittelten Thrombozytenzahl wenn diese bezweifelt wird.
• Beurteilung der Thrombozytenmorphologie, z.B. Erkennung von Aggregaten, Riesenplättchen und deren Abgrenzung von Erythrozytenfragmenten.

Erkennung von nicht hämatologischen Zellen

Die Erkennung folgender Zellen ist wichtig /4/:

• Endothelzellen, Epithelien, Tumorzellen.
• Organismen; intrazellulär (Plasmodien, Babesien), extrazellulär (Trypanosomen, Mikrofilarien).

15.13.1.2 Klinische Indikation /2/

• Unklare Anämie und/oder unklarer Ikterus.
• Milzvergrößerung, insbesondere wenn diese akut aufgetreten ist, Anzeichen der Sichelzellanämie.
• Petechien, Nasenbluten und Zeichen, die auf eine Thrombozytopenie hinweisen.
• Unerwartetes Fieber oder Anzeichen, die auf eine Neutropenie hinweisen.
• Lymphknotenschwellung, Milzvergrößerung, Fieber, Gewichtsverlust und weitere Anzeichen, die auf ein Lymphom oder eine lymphoproliferative Erkrankung hinweisen.
• Splenomegalie, Plethora, Juckreiz, Gewichtsverlust und Anzeichen einer myeloproliferativen Erkrankung.
• Akute oder kürzlich erfolgte Niereninsuffizienz oder eine Nierenvergrößerung, insbesondere bei Kindern.
• Blutungen in den Augenhintergrund und Zeichen der Netzhautatrophie oder Hyperviskosität.
• Verdacht auf bakterielle Erkrankung oder Hämato-Gewebsparasitose, die im Blutausstrich detektiert werden kann.
• Hinweis auf nicht hämatopoetische Krebserkrankung.
• Genereller Zustand mit Unwohlsein und Verdacht auf infektiöse Mononukleose, andere Viruserkrankung, Inflammation oder Tumorerkrankung.

15.13.2 Präparation

Antikoagulation

K₂- bzw K₃-EDTA oder Natriumcitrat, nicht aber Heparin, sind zur venösen oder kapillären Blutentnahme geeignet. Heparin hat folgende Nachteile /3/:

• Häufig führt es zur Verklumpung der Thrombozyten, wodurch sowohl die Thrombozytenzählung als auch die Beurteilung der Morphologie gestört wird.
• Der gefärbte Blutausstrich hat einen Blaustich.

Probenaufarbeitung

Nach Probennahme hat das Ausstreichen zügig, d.h. innerhalb von 2 h zu erfolgen. Ist das nicht möglich, sollte die Probe bis zu 8 h bei 4 °C gelagert werden, aber auch die Lagerung bei Raumtemperatur (22 °C) ist möglich. Eine noch längere Lagerung sollte immer bei 4 °C erfolgen. Vor dem Ausstreichen sollte das Probengefäß mindestens 10 malig um 180° geschwenkt werden /3/.

Ausstreichen der Probe

Etwa 5 μl Blut sollten eingesetzt werden, um einen Ausstrich von entsprechender Dicke und 2,5–4 cm Länge zu erzielen. Dazu wird der Blutstropfen etwa 1 cm vom matten bzw. mit einem Aufkleber versehenen Ende des Objektträgers aufgesetzt und hinter der angewinkelten Kante eines aufgesetzten Deckglases zum seitlichen Verlaufen gebracht. Dann wird das Deckglas in einem Winkel von 30–45 °C zügig über den Objektträger geführt (Abb. 15.13-1 – Ausstrichtechnik des Bluts) /3/.

Der Ausstrich zeigt eine dickere Schicht am Anfang und läuft dünner werdend mit Fransenbildung (Fahne) aus (Abb. 15.13-2 – Wichtige Areale bei der Auswertung des Blutausstrichs).

Dicke und Länge des Ausstrichs hängen ab /4/:

• Von der Größe des Blutstropfens und dem Hkt (je größer der Blutstropfen und je höher der Hkt, desto dicker ist der Ausstrich).
• Vom Winkel des ausstreichenden Deckglases (je steiler der Winkel, desto kürzer und dicker der Ausstrich).
• Von der Geschwindigkeit des Ausstreichens (schnelles Ausstreichen bewirkt einen dicken Ausstrich).

Trocknen des Blutausstrichs

Lufttrocknung ohne unterstützende Luftzirkulation für 1 h ist ausreichend. Bei hoher Luftfeuchtigkeit (über 70 %) ist eine unterstützende Luftzirkulation erforderlich. Falls die getrockneten Objektträger nicht innerhalb einer Stunde gefärbt werden können, sollten sie fixiert werden, und zwar 10 min in Methanol. Geschieht das nicht und werden die Objektträger erst Stunden nach Trocknung ohne Fixierung gefärbt, bildet das Plasma einen grau blauen Hintergrund. Zur Vermeidung morphologischer Artefakte muss der Wassergehalt des Methanols unter 3 % sein /3/.

15.13.2.1 Färbung

Die häufigsten Färbungen zur Beurteilung der Morphologie roter und weißer Blutzellen erfolgt mit Romanowsky Farbstoffen. Romanowsky Färbungen erfolgen mit oxidiertem Methylenblau und/oder seinen oxidierten Produkten (Azur B) und mit halogeniertem Fluoreszeinfarbstoff, gewöhnlich Eosin B oder Y. Die häufigste Färbungen, die alle Zelltypen in einem Blutfilm unterscheidbar machen sind die Wright-Giemsa Färbung und die Pappenheimfärbung.

Wright-Giemsa-Färbung

Die Färbung enthält basische Farbstoffe (Methylenblau und seine Derivate) und den sauren Farbstoff Eosin im Verhältnis 2 : 1 /6/. Eosin ist ein saurer Farbsoff, da er sich an Zellbestandteile wie Hämoglobin, eosinophile Granula und basische granuläre Proteine bindet. Methylenblau gehört zur Familie der blau färbenden Thiazinfarbstoffe (Azur A, Azur B, Methylviolett) und wird als basischer Farbstoff bezeichnet. Die Farbstoffe binden an saure Bestandteile der Zelle wie DNA, RNA neutrophile Granula und saure Zellproteine.

Die Verwendung basischer und saurer Farbgemische ergibt eine panoptische (mehrfarbige) Anfärbung der Zellen. Die beste panoptische Färbung wird nach der Vorschrift von Pappenheim durch eine Abfolge der Ausstrichfärbung zuerst mit dem Farbstoff nach May-Grünwald und dann mit dem nach Giemsa erzielt. Die basischen Farbstoffe (blau) binden an saure Zellbestandteile wie DNA, RNA, saure Zellproteine im Zytoplasma und Granula. Eosin ist ein saurer Farbstoff (rot) und bindet an basische Zellbestandteile wie das Hämoglobin, basische Proteine im Zytoplasma und bestimmte Granula (eosinophile Granula). Färbevorschriften nach May-Grünwald-Giemsa, nach Pappenheim oder nach Wright-Giemsa siehe Lit. /3, 6, 7/.

Pappenheim Färbung

May-Grünwald`s Eosin Methylenblau und Giemsa`s Azur-Methylenblau werden zur Färbung eingesetzt. Ein Anzahl von Modifikationen ist beschrieben /7/.

Anforderungen an einen ordnungsgemäß angefertigten Blutausstrich

Ein ordnungsgemäß gefärbter Blutausstrich nach einer der drei genannten Färbemethoden sollte wie folgt aussehen:

• Im Minimum 2,5 cm lang, mit einem Ende etwa 1 cm vor dem Ende des Objektträgers
• Graduelle Änderung der Ausstrichdicke, endend in einem quadratischen oder geraden Kante.
• Kein Einschluss von Artefakten
• Makroskopisch blass rot im dünnen und violett-blau im dickeren Teil des Ausstriches. Farb Verschiebungen im Färbeprozess durch Überwiegen alkalischer (Blaustich) oder saurer (Rotstich) Bestandteile werden vermieden durch Verwendung von gepuffertem Aqua dest. im Bereich pH 6,8–7,2 als Spülflüssigkeit.
• Mikroskopisch sollen die roten Blutzellen blassrosa sein und die Kerne der Leukozyten mehr violett als blau. Die Blutzellen sollen frei von Vakuolen und anderen Artefakten sein, der Objektträger keine Präzipitation von Farbresten enthalten /3/.

15.13.2.2 Zytochemische Färbungen

Die zytochemischen Färbungen sind im Beitrag 15.14 dargestellt und dienen dem Nachweis von Enzymen und anderen Bestandteilen der Blutzellen. Sie sind bedeutsam zur Differenzierung unreifer hämatopoetischer Zellen und der Differenzierung von Lymphozyten. Zytochemische Färbungen haben folgende Indikationen:

• Unterscheidung zwischen myeloischen und lymphatischen Leukämien.
• Differenzierung von Vorstufen der granulozytären und monozytären Reihe.
• Abgrenzung von Subtypen der ALL.
• Charakterisierung der Zellen bei der CLL und der Haarzell-Leukämie.
• Unterscheidung der reaktiven Leukozytose von der leukämoiden Reaktion und der neoplastischen myeloproliferativen Erkrankung.
• Nachweis von Enzymdefekten, vor allem bei neutrophilen Granulozyten, z.B. partieller Peroxidasedefekt beim myelodysplastischen Syndrom.
• Unterscheidung reaktiver von neoplastischer Vermehrung neutrophiler Granulozyten, z.B. mittels der alkalischen Neutrophilen Phosphatase (ANP).

ANP-Index

100 neutrophile stab- und segmentkernige Granulozyten werden ausgezählt und je nach Reaktionsstärke nach einer Skala 0 bis 4 in einzelne Klassen eingeordnet. Die Summe der in die einzelnen Klassen eingeordneten Zellen, multipliziert mit ihrem Klassefaktor, ergibt den Index (Referenzbereich 13–130). Wegen eines zeitabhängigen Aktivitätsverlusts müssen die Ausstriche innerhalb von 3 Tagen bearbeitet werden. Die Bestimmung des ANP-Index ist nützlich für die Abgrenzung der CML (niedriger Index) von anderen myeloproliferativen Erkrankungen und von der leukämoiden Reaktion. Bei der Polycythämia vera ist die ANP in ca. 70 % der Fälle erhöht und Diagnose stützend zur Abgrenzung gegenüber einer reaktiven Polyglobulie.

15.13.2.3 Artefakte

Artefakte können bei allen Schritten der Herstellung eines Blutausstrichs entstehen.

Antikoagulanz

Bei Verwendung von EDTA-Blut zum Ausstrich können folgende Artefakte vorkommen: Agglutination von Leukozyten, Satelliten Phänomen, z.B. Plättchen Satellismus um einen Granulozyten, sowie die Agglutination von Thrombozyten. Insbesondere Autoantikörper derKlasse IgG können im EDTA-haltigen Blut eine Agglutination von Blutzellen bewirken. Die Agglutination wird nicht im Citratblut gesehen. IgM-Autoantikörper führen unabhängig vom Antikoagulanz zu einer Agglutination von Blutzellen. Die EDTA-induzierte Leukopenie, die nicht nur die polymorphkernigen Neutrophilen, sondern auch die Lymphozyten und zirkulierende Lymphomzellen betreffen kann, wird auf Grund der Agglutinaten von Leukozyten im Blutausstrich erkannt /7/.

Alter der Probe

Proben, die nach der Entnahme nicht innerhalb von 2 h ausgestrichen werden, können degenerative Artefakte aufzeigen, z.B. die Vakuolisierung des Zytoplasmas bei Granulozyten und Monozyten oder die Fragmentierung und Lobulisierung von Granulozyten. Die Lymphozyten nehmen apoptotische Formen an, die dann nur schwerlich einer Virusinfektion oder einer lymphoproliferativen Erkrankung zuzuordnen sind /3/.

Ausstreichen

Beim Ausstreichen des Bluts zum Film werden atypische Lymphozyten leicht geschädigt, z.B. rupturierte Lymphozyten bei der chronisch lymphatischen Leukämie bilden die Gumprecht’schen Kernschatten /3/. Zur Minimierung der beim Ausstreichen auftretenden Zellveränderungen wird die Zugabe von 1 Tropfen Albumin (22 %) zu 5 Tropfen Blut und das normale Ausstreichen empfohlen.

Trocknung und Fixation

Optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn Fixierung und Färbung direkt nach der Lufttrocknung erfolgen. Ist eine Färbung nicht sofort möglich, sollte eine Fixierung in Methanol innerhalb 1 h nach der Lufttrocknung durchgeführt werden. Erfolgt das nicht, hat der Objektträger einen grau-blauen Hintergrund auf Grund aufgetretener Veränderungen im Blutplasma. Eine zu langsame Lufttrocknung bewirkt die Kontraktion der Zellen, eine verminderte Feinstrukturierung des Kernes und die Bildung von Vakuolen im Zytoplasma. Die Färbung eines noch feuchten Ausstrichs führt zu einer irregulären Ausbreitung des Blutfilms und zu einer schlecht differenzierbaren Morphologie der Zellen /3/.

Ist der Wassergehalt der Fixier- und Färbelösung nicht unter 3 %, kommt es zu Artefakten wie bei nicht ordnungsgemäß getrockneten Blutausstrichen. Ein Wassergehalt von über 3 % wird schell erreicht, wenn die nach Spülung in Pufferlösung feuchten Objektträger in der zweiten Färbelösung inkubiert werden /3/.

15.13.3 Mikroskopie

Zuerst erfolgt die makroskopische Beurteilung des gefärbten Ausstrichs und die Auswahl einer Region in der Nähe des gefederten Endes, in dieser sollen nicht mehr als 50 % der Erythrozyten sich berühren /9/. Dünne Regionen des Ausstrichs in denen die Erythrozyten Streifen formen, sollen nicht untersucht werden. Als Regel kann gelten, dass die beste Region diejenige ist, die vor dem letzten Drittel des Ausstrichs gelegen ist (Abb. 15.13-2 – Wichtige Areale bei der Auswertung des Blutausstrichs).

Die ordnungsgemäße mikroskopische Auswertung des Blutausstrichs umfasst:

• Die Abschätzung der vom Hämatologie Analyzer angegebenen Zellzahlen.
• Die Differenzierung der Leukozyten.
• Die Beurteilung der Morphologie von roten Blutzellen und Thrombozyten.
• Die Beachtung von Zellaggregaten und Satellitenphänomenen.
• Die Suche nach toxischen zellulären Veränderungen und Infektionserregern.

Beurteilt wird zusätzlich die Ausstrich- und Färbequalität sowie die Präsenz von Zelltrümmern und auf Zellaggregate und Satellitenphänomene wird geachtet. Danach wird Immersionsöl aufgebracht und die Immersionsobjektive (63 oder 100) in den Strahlengang gedreht /10/.

15.13.3.1 Semiquantitative Beurteilung der Zellzahl

Bei Mikroskopie unter Anwendung eines Okulars 10 × entspricht bei einem Objektiv 40 × die pro Gesichtsfeld (GF) ermittelte Zellzahl im Mittel:

• An Erythrozyten 600/GF bei normaler Erythrozytenzahl.
• An Thrombozyten 30–60/GF bei normaler Zahl, 75–125/GF bei einer Zahl von (400–1.000) × 10⁹/l, 25–30/GF bei (50–100) × 10⁹/l und 10–15/GF bei (20–50) × 10⁹/l.
• An Leukozyten 1–2/GF bei normaler Leukozytenzahl, 5–6/GF bei einer Zahl von (20–50) × 10⁹/l, 10–15/GF bei (50–100) × 10⁹/l und 20–30/GF bei > 100 × 10⁹/l.

Unter Verwendung eines Objektives 100× und somit einer 1.000 fachen Vergrößerung wird nur etwa ein Sechstel der jeweiligen Zellzahl pro Gesichtsfeld gezählt. Zur Verifizierung der Zellzahl sollte der Mittelwert aus der Zählung von 10 Gesichtsfeldern eingesetzt werden.

15.13.3.2 Differenzierung der Leukozyten

Die Differenzierung der Leukozyten erfolgt bei 400- bis 1.000-facher Vergrößerung. Zerstörte oder pyknotische Zellen werden nicht in die Zellzählung mit aufgenommen. Ist ihr Anteil jedoch hoch, sollte dies in dem Laborbericht mit aufgeführt werden. Ausstriche von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie enthalten oft eine große Zahl Gumprecht’scher Kernschatten. In diesen Fällen sollte ein Ausstrich nach Albuminzusatz zum Blut nochmals untersucht werden. Im Laborbefund wird der Anteil der einzelnen Leukozyten, bezogen auf 100 gezählte Leukozyten, in Prozent angegeben. Sind andere kernhaltige Zellen (Normoblasten, Megaloblasten, Megakaryozyten) oder Zellkerne vorhanden, sollten diese gezählt und ihr Anteil pro 100 Leukozyten angegeben werden /4/. Gumprecht’sche Kernschatten werden als Lymphozyten gezählt. Morphologische Veränderungen der Leukozyten müssen charakterisiert und interpretiert werden.

Die morphologischen Veränderungen sind aufgeführt in:

• Tab. 15.13-1 – Artefakte und morphologische Veränderungen der Leukozyten im Blutausstrich
• Abb. 15.13-3 – Morphologische Veränderungen der Granulozyten
• Abb. 15.13-4 – Morphologische Veränderungen der Lymphozyten

15.13.3.3 Beurteilung der Thrombozyten-Morphologie

Die Thrombozyten-Morphologie dient:

• Zur Verifizierung der mit dem Hämatologie Analyzer gemessenen Thrombozytenzahl /4/. Ein Blutausstrich mit normaler Thrombozytenzahl sollte 1 Thrombozyt auf 10–30 rote Blutzellen zeigen. Im Blutausstrich sichtbare Riesenplättchen, Plättchenaggregate oder Satelliten-Phänomene können die Ursache einer maschinell gezählten Thrombozytopenie sein.
• Der Gewinnung diagnostischer Information aus einer veränderten Morphologie.

Beispiele einer veränderten Thrombozyten-Morphologie zeigen:

• Abb. 15.13-5 – Morphologische Veränderungen der Thrombozyten
• Tab. 15.13-3 – Artefakte und morphologische Veränderungen der Thrombozyten im Blutausstrich bei Thrombozytopenie und Thrombozytose.

15.13.3.4 Beurteilung der Erythrozyten-Morphologie

Die Beurteilung dient folgenden Zwecken /4/:

• Zur Bestätigung der vom Hämatologie Analyzer bestimmten bzw. berechneten Erythrozytenwerte, insbesondere der Indices MCV, MCH und MCHC, wenn keine Plausibilität vorliegt. So kann ein erhöhtes MCV durch eine Makrozytose, Retikulozytose (Polychromasie im Blutausstrich) oder Agglutination roter Blutzellen bedingt sein. Bei starker Erhöhung von MCHC und MCH ist eine Agglutination der Erythrozyten durch Kälteagglutinine wahrscheinlich.
• Zur Gewinnung diagnostischer Information aus einer veränderten Erythrozyten Morphologie.

Siehe auch:

• Abb. 15.13-6 – Morphologische Veränderungen der Erythrozyten
• Tab. 15.13-2 – Artefakte und morphologische Veränderungen der roten Blutzellen im Blutausstrich.

15.13.3.5 Im Blutausstrich sich manifestierende Infektionen

Infektiöse Erkrankungen manifestieren sich im Blutausstrich neben einer Leukozytose auch an Hand reaktiver (toxischer) Veränderungen der Granulozyten. Diese sind toxische Granulation, Vakuolisierung und die Ausbildung von Döhle Körperchen /11/. Die Monozyten zeigen unspezifische morphologische Veränderungen. Die morphologischen Veränderungen der Lymphozyten bei EBV- und Zytomegalie-Infektion sind aufgeführt in Tab. 15.13-1 – Artefakte und morphologische Veränderungen der Leukozyten im Blutausstrich.

Der Blutausstrich ist als primär diagnostische Methode zur Erkennung einer Sepsis nicht bzw. nur in wenigen Fällen geeignet. Eine Aufstellung gibt Tab. 15.13-4 – Morphologische Blutausstrich Befunde bei infektiösen Erkrankungen.

15.13.3.6 Veränderungen im Blutausstrich bei Hypo- und Hypersplenismus

Mit den Begriffen Hyper- und Hyposplenismus werden Veränderungen im Blutbild beschrieben, die sich aus einer veränderten Milzfunktion ergeben.

Die normale Funktion der Milz besteht in dem Abfangen der in die Zirkulation entlassenen Retikulozyten, der Entfernung von Zellpartikeln und Kernfragmenten und der endgültigen Gestaltgebung der Erythrozyten. Vom Knochenmark entlassene unreife Zellen werden eliminiert, aber die Retikulozyten reifen in der Milz und werden als zirkulationsfähige Erythrozyten an das Blut abgegeben. Überalterte oder geschädigte Erythrozyten werden von der Milz aufgenommen und degradiert. Der verstärkte Abbau von Erythrozyten im Rahmen einer hämolytischen Reaktion verursacht eine Vergrößerung der Milz.

Auch hält die Milz die Anzahl der Thrombozyten konstant. Die in der Milz gespeicherten Thrombozyten können bei akuter völliger Entleerung die Thrombozytenzahl um 50 × 10⁹/l anheben.

Hyposplenismus

Dieses Symptom wird durch Entfernung der Milz sowie extensive immuno- und lymphoproliferative Erkrankungen wie die Haarzellleukämie oder Amyloidose der Milz hervorgerufen. Die damit verbundenen Veränderungen können sein /12/:

• Eine transiente bzw längerfristige Thrombozytose.
• Im Blutausstrich Targetzellen, Howell-Jolly-Körperchen und rote Blutzellen mit unregelmäßiger Kontur, im englischen Sprachgebrauch Spiculated cells genannt. Auch werden in geringer Zahl kernhaltige rote Blutzellen, unreife Granulozyten und Megakaryozytenreste gesehen.

Hypersplenismus

Es handelt sich um ein klinisches Symptom und keine pathologische oder histologische Entität. Die Milz kann vergrößert sein oder nur eine verstärkte Funktion haben. Letztere dokumentiert sich in einer Zytopenie, die eine oder mehrere hämatopoetische Zelllinien betreffen kann. Die betroffene Zelllinie zeigt eine Hyperproliferation im Knochenmark und kann morphologische Veränderungen oder einen Reifungsstopp zeigen.

Die mit Hypersplenismus einhergehenden Veränderungen können sein /12/:

• Eine permanente Thrombozytopenie.
• Im Blutausstrich Sphärozyten, Tränentropfen-Zellen, Schistozyten.

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15.14 Knochenmark-Diagnostik

Torsten Haferlach

Die Labordiagnostik von Leukämien und Lymphomen hat sich erheblich weiterentwickelt. Einen großen Anteil an diesem Fortschritt haben zum einen das zunehmende Verständnis von pathophysiologischen Zusammenhängen bei diesen Erkrankungen und zum anderen die Weiterentwicklung von Labortechniken und Geräten inklusive Computer gestützter Verfahren der Auswertung von Befunden. Eine kurzfristige und umfassende Labordiagnostik erlaubt vielfach heute eine Ziel gerichtete Therapie und beinhaltet die bestmögliche Prognose. Gleichzeitig sollten im Laborablauf die zur Verfügung stehenden Methoden gezielt und Kosten effektiv im Sinne einer Stufendiagnostik eingesetzt werden. Dies setzt bei Materialgewinnung und Laboruntersuchungen stringente Algorithmen voraus.

Bei dieser rasanten Weiterentwicklung der Diagnostik ist es für den anfordernden Arzt schwer, immer die adäquate Frage an sein Labor zu stellen. Auch ist die Herausforderung an die jeweiligen Laboratorien hoch, mit der raschen Entwicklung von Methoden bei der primären Diagnostik ebenso wie beim zunehmend geforderten Nachweis minimaler Resterkrankung (Minimal residual disease, MRD), Schritt zu halten. Deshalb wird hier dem Einsender und dem untersuchenden Labor eine aktuelle Orientierung für die Routinediagnostik von Leukämien und Lymphomen gegeben.

15.14.1 Knochenmark-Proben

Die Indikation zur Knochenmark (KM)-Untersuchung stellt sich in der Regel über den klinischen Befund und immer erst nach der Detektion von Veränderungen der Zahl oder der Zusammensetzung der Blutzellen. Ergeben sich dabei Hinweise für das Vorliegen einer hämatologischen Systemerkrankung oder eines Lymphoms, ist eine Untersuchung des Knochenmarks mittels Aspiration, vielfach ergänzt um eine Biopsie/Histologie, erforderlich /1, 2, 3, 4/.

Entnahmeort

Die Entnahme der Proben erfolgt vorzugsweise am hinteren Beckenkamm (Spina iliaca posterior superior). Die Punktion des Beckenkamms an dieser Stelle ist technisch einfacher, ungefährlicher und weniger schmerzhaft als die Sternalpunktion, welche nur noch in Ausnahmefällen durchgeführt werden sollte und sich nur für die Aspiration eignet; man muss sie eigentlich für obsolet erklären. Solche Ausnahmen stellen vorherige Bestrahlung am Becken, Punctio sicca oder ein zu adipöser Patient dar. Doch auch im letzteren Fall oder beim beatmeten Patienten, in Rückenlage liegend, kann am Becken punktiert werden; an der Spina iliaca anterior superior oder am vorderen Beckenkamm. Dabei ist aber das Os ilium an der Spina iliaca posterior superior mit ca. 3 cm am breitesten, Verletzungen lebenswichtiger Organe oder größerer Gefäße sind bei richtiger Technik weitestgehend ausgeschlossen (Abb. 15.14-1 – Horizontalschnitt in Höhe des Biopsieortes).

Der Patient wird möglichst am Vortag über den Eingriff und dessen Risiken einer Komplikation aufgeklärt. Die Punktion kann auch bei blutungsgefährdeten Patienten ambulant, aber mit ausreichend langer Zeit zur Nachbeobachtung, erfolgen. In besonderen Fällen muss vor der Punktion die Gabe eines Thrombozytenkonzentrats erwogen werden, um Thrombozytenwerte über 20 × 10⁹/l zu erreichen. Eine Prämedikation mit Tranquilizern ist nur bei äußerst sensiblen Patienten nötig, bei Kindern ist eventuell eine Kurznarkose in Absprache mit dem Anästhesisten zu empfehlen. Eine Punktion ist in Seitenlage oder in Bauchlage möglich, der Autor empfiehlt die Bauchlage, da dabei auch bei größerem Kraftaufwand der Patient sicher und stabil liegt und nicht zusätzlich stabilisiert wurden muss.

Knochenmarkbiopsie

Bei aleukämischen Patienten oder extrem zellarmen KM-Aspiraten ist auch bei akuten Leukämien eine Biopsie zur Histologiegewinnung zusätzlich zur Aspiration notwendig. Bei den myeloproliferativen Erkrankungen, der chronischen lymphatischen Leukämie sowie beim Lymphomstaging ist eine KM-Histologie in jedem Fall erforderlich.

Zur Gewinnung Artefakt freien Gewebes sollte die Histologie vor der Aspiration durchgeführt werden. In Bauchlage wird nach gründlicher Desinfektion und steriler Abdeckung die Haut bis zum Periost der Spina iliaca posterior superior mit zumindest 10 ml Lokalanästhetikum anästhesiert. Der Zeitraum bis zur befriedigenden Anästhesie beträgt zumindest 5 min. Die ehemalige Sternalnadel (am Becken ohne den Abstandshalter zu verwenden) und eine Histologie-Nadel (z.B. sog. Jamshidi-Nadel) sind zur Punktion zu verwenden (Abb. 15.14-2 – Jamshidi Nadel im Vergleich zu einer gewöhnlichen Punktionsnadel). Sehr gut geeignet sind Einmalbestecke.

Bei Kindern ist eine Kurznarkose gegebenenfalls in Absprache mit dem Anästhesisten zu empfehlen.

Knochenmark-Histologie

Bevorzugt wird eine Nadelweite von 8 Gauge, bei jungen Patienten mit kräftigem Knochen hat sich die 11 Gauge-Nadel bewährt. Bei besonders adipösen Patienten steht auch eine längere Nadel zur Verfügung. Die Jamshidi Nadel wird mit Mandrin auf die Mitte des hinteren Beckenkamms aufgesetzt und nach Entfernung des Mandrins durch die Kortikalis in Richtung auf die zumeist gut tastbare Spina iliaca anterior hineingeschnitten. Eine Biopsielänge bis zu 4 cm ist so möglich und erlaubt eine repräsentative Beurteilung des KM. Eine große Biopsie erlaubt zudem ein leichteres Abdrehen und besseres Haften des gestanzten KM-Zylinders in der Hohlnadel. Nach Gewinnung des Zylinders können davon, falls erforderlich, Abrollpräparate gemacht werden, und je nach der vorgesehenen Einbettungsmethode erfolgt die Fixation der Biopsie entsprechend den Anleitungen des jeweiligen Einsendelabors.

Falls bei Punctio sicca und aleukämischem Verlauf Material für die Zytogenetik nicht aspiriert nicht möglich ist, kann auch ein Stanzzylinder direkt nach der Entnahme in physiologische Kochsalz Lösung mit Heparinzusatz eingelegt werden. Das Röhrchen wird dann mit der Stanze zum genetischen Labor versendet. Die Marker der Immunphänotypisierung können in diesen Fällen an der Histologie einer zweiten Stanze nach Einbettung in Paraffin durchgeführt werden.

Knochenmark(KM)-Aspiration

Nach der Biopsiegewinnung erfolgt die Aspiration des KM am Beckenkamm. Verwendet werden zumeist Punktionsnadeln nach Klima und Rosegger ohne Arretierung. Auch hier sollte Einmalnadeln wegen des schärferen Schliffs und aus hygienischen Grün-den der Vorzug gegeben werden. Man punktiert das KM durch die bereits erfolgte Hautinzision, ungefähr 1 cm entfernt von der Biopsiestelle für die Histologie und in schrägem Winkel zur Biopsierichtung. Vor dem Aspirieren wird dem Patienten mitgeteilt, dass ein kurzzeitiger Schmerz auftreten wird, der auch durch sorgfältige Lokalanästhesie nicht verhindert werden kann. Man aspiriert kurz und kräftig mit einer 10 ml-Spritze bis zum vollen Hub. Dabei reichen für die erste EDTA-Probe zur weiteren zyto-morphologischen Untersuchung 2–3 ml Knochenmark, um Verdünnung mit peripherem Blut zu vermeiden. Eine zweite und dritte Spritze, mit Heparin als Antikoagulans, kann dann jeweils bis auf 5 oder 10 ml aufgezogen werden. Entnimmt man alle Proben von einer Stelle, so können die letzten Aspirate durch zunehmende Blutverdünnung eine andere Zusammensetzung der Zellen als das erste Aspirat aufweisen. Bei unbefriedigender Aspiration muss die Lage der Punktionsnadel durch Drehen unter Sog oder durch nochmaliges Punktieren verändert werden. Bei Punctio sicca hilft häufig auch ein Drehen der Nadeln im Knochen unter weiterer Aspiration doch noch zur erfolgreichen Gewinnung von Material. Bei weiter erfolgloser Punktion kann die andere Seite zusätzlich oder der vordere Beckenkamm nach entsprechender Anästhesie punktiert werden. Auch eine Sternalpunktion ist als ultima ratio möglich, allerdings muss dann unbedingt wieder ein Tiefenstopper verwendet werden. Bei Säuglingen kommt zur Punktion im Ausnahmefall auch die Tibiavorderkante unterhalb des Ansatzes des M. quadrizeps in Frage.

Nach Anlegen eines Heftpflasterverbands wird die Punktionsstelle durch Liegen auf einem Sandsack komprimiert. Zumindest 30 min später wird die Stelle auf eine Nachblutung hin kontrolliert.

Probenverteilung

Aspirate für folgende Untersuchungen werden routinemäßig gewonnen, mit den jeweiligen Zusätzen für die Spritze in Klammern:

• Aspirationszytologie: 0,5 ml EDTA maximal ad 2–3 ml KM-Aspirat.
• Immunphänotypisierung: 0,5 ml Heparin oder auch EDTA maximal ad 5 ml KM-Aspirat.
• Zytogenetik: 0,5 ml Heparin oder fertige Heparin-Monovetten, maximal ad 5–10 ml KM-Aspirat.
• Molekulargenetik: 0,5 ml Heparin oder auch EDTA maximal ad 5 ml KM-Aspirat.

Die Aspirationszytologie mit EDTA-Zusatz steht immer an erster Stelle, da eine potentielle Kontamination mit Heparin durch den Spritzenkonus gravierende Färbeartefakte in der Pappenheimfärbung verursacht.

Sämtliche Spritzen müssen vor der Punktion sowohl mit Namen des Patienten, dem Material (KM) und auch mit der Art des Zusatzes gekennzeichnet sein und danach umgehend in die entsprechenden Laboratorien weitergeleitet werden. Generell gilt, je kleiner das Entnahmevolumen ist, desto geringer ist die Kontamination mit peripherem Blut, d.h. desto repräsentativer ist die aspirierte Knochenmarkprobe. Falls für die Immunzytologie heparinisierte Proben Verwendung finden, sind zusätzlich noch ungefärbte EDTA-Ausstriche beizulegen. Uneingeschränkte Probenqualität ist umso wichtiger, je schwieriger die diagnostische Fragestellung ist, z.B. zur Kontrolle der Resterkrankung (MRD). Das bedeutet, dass für die Zytomorphologie die Ausstriche möglichst innerhalb von 3 h nach der Aspiration hergestellt werden sollten, und dann ausreichend (über 30 min) luftgetrocknet gehören bevor sie verpackt werden. Diese lassen auch mehrere Tage noch gute Ergebnisse der Färbung zu. Das Material für die Zytogenetik, Immunphänotypisierung und die molekulargenetischen Untersuchungsverfahren sollte nach 24 h das untersuchende Labor erreichen. Zusammenfassend wird der in Tab. 15.14-1 – Potentielle Auswahl der Methoden im Rahmen der Knochenmark Diagnostik bei Primärdiagnose/Verdachtsdiagnose von Leukämien und Lymphomen dargestellte Algorithmus für die Entnahme von Knochenmark und das Weiterleiten an die einzelnen Laborbereiche vorgeschlagen.

Die Stanze sollte in der vom Labor vorgeschlagenen Fixationslösung innerhalb eines Tages verschickt werden.

15.14.2 Verarbeitung und Auswertung von Blutausstrich- und Knochenmarkmaterial

Untersuchung des peripheren Bluts

Wird peripheres Blut untersucht, so sind das kleine Blutbild inklusive Thrombozyten, MCV und MCH, Retikulozyten und das Differentialblutbild unabdingbare Basisuntersuchungen. Vor allem bei hämatologischen Erkrankungen können im EDTA-Blut Störfaktoren vorhanden sein, welche die weit verbreitete automatische Messung des kleinen Blutbilds an Hämatologie Analyzern stören und dann falsche Ergebnisse verursachen. Deshalb einige Beispiele:

• Leukozyten über 100 × 10⁹/l ergeben bei einer Vielzahl von Geräten einen falsch hohen Hb Wert (ca. 10–20 g/l zu hoch).
• Bei der Thrombozytenzählung wird durch Fragmentozyten, z.B. bei disseminierter intravasaler Gerinnung oder Absprengungen des Zytoplasmas von Blasten, z.B. bei AML M4 oder M5 (nach FAB) ein falsch hoher Wert ermittelt (bis zu 30 × 10⁹/l zu hoch).
• Bei vom Gerät ermittelten erniedrigten Thrombozytezahl sollten Thrombozytenagglutinate als Ursache der Thrombozytopenie im Ausstrich (in der Fahne suchen) ausgeschlossen werden, z.B. EDTA-induzierte Pseudothrombozytopenie. Es sollte dann parallel eine Thrombozytenmessung in Citrat-Blut erfolgen.
• Differentialblutbild. Dieses wird primär in fast allen Fällen von Hämatologie Analyzern erstellt. Dabei ist zu beachten, dass die Geräte schwerpunktmäßig auf eine Analyse von normalen Blutbildern und die grobe Unterscheidung von normal versus pathologisch eingestellt sind. Beim Vorhandensein einer pathologischen Zellpopulation wird von dem Analyzer ein Alarm gegeben, der zum Ausstreichen des Bluts und zur mikroskopischen Analyse führen muss. Da die Analysensysteme in der Regel zuverlässige Ergebnisse produzieren, ist somit bei jedem Verdacht oder zur Verlaufskontrolle von hämatologischen Erkrankungen die mikroskopische Analyse des peripheren Bluts notwendig /6/. Siehe Beitrag 15.13 – Blutausstrich-Untersuchung.

Verarbeitung und Auswertung des KM-Aspirats

Die Untersuchung des Knochenmarks gehört zur Basisdiagnostik hämatologischer Systemerkrankungen. Ob bei akuten Leukämien eine Aspirationszytologie allein ausreichend oder aber eine zusätzliche Biopsie indiziert ist, wird unterschiedlich gesehen. Für die Beurteilung leukämischer Zellen bei akuten Leukämien sind zumindest Ausstrichpräparate von Blut und KM am besten geeignet. Diese sollten vor dem Versand und vor dem Färben ausreichend getrocknet sein (über 30 min). Die zusätzliche Beurteilung einer Biopsie des KM ist sicher bei erfolglosem Aspirationsversuch (Punctio sicca) angezeigt, sie ermöglicht auch eine Immunhistologie. Bei den myeloproliferativen Erkrankungen spielt die Histologie des Knochenmarks zum Zeitpunkt der Diagnose eine wichtige Rolle auch wegen des zu beurteilenden Fibrosegrads.

Die diagnostische Wertigkeit hängt entscheidend von der weiteren Verarbeitung des gewonnenen Materials ab. Die besten Ausstrichpräparate, in denen auch eine semiquantitative Schätzung der Zelldichte möglich ist, erhält man durch Legen eines Deckgläschens auf die auf dem Objektträger aufgebrachten KM-Bröckel (nach Filtration oder aus einem Uhrglasschälchen gewonnen), danach Ausziehen des Deckgläschens zum Ende des Objektträgers (Abb. 15.14-3 – Anfertigen des Ausstrichs eines Knochenmark-Bröckels).

Das richtige Ausstreichen bedarf einer längeren Übung. Die KM-Präparate sollten dann unbedingt 30–60 min luftgetrocknet werden. Die anschließende Färbung nach Pappenheim bzw. May-Grünwald-Giemsa stellen die Standardverfahren der Darstellung von Blut- und KM-Zellen dar. Die zur Beurteilung geeigneten Ausstriche enthalten KM-Bröckel im Zentrum und durchmischtes KM-Blut in der Peripherie des Ausstrichs. Nach sorgfältiger Durchmusterung des gesamten Präparats mit einer schwachen Vergrößerung lassen sich die Zellularität und unterschiedliche Verteilungsmuster, z.B. auch bei nodulären Infiltraten einer chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) oder eines Lymphoms, oder der Nachweis von Tumorzellen beurteilen. Daran schließt sich eine Einzelanalyse von mindestens 200 (–500) Zellen aus zwei repräsentativen Arealen des Ausstrichs an. Die Verteilung der KM-Zellen beim Gesunden ist aufgeführt in Tab. 15.14-2 – Prozentsatz der Knochenmarkzellen Gesunder.

Die zusätzliche Durchmusterung von zumindest zwei Ausstrichen geschieht nach folgenden Kriterien:

• Beurteilung der Zelldichte: Eine Verminderung kann Abnahme- und Ausstrich-bedingt sein. Eine tatsächliche Verminderung der Zellularität darf nur angenommen werden, wenn Markbröckel mit Fett- und Stromazellen sicher nachweisbar sind. Das Alter des Patienten ist zu berücksichtigen, die Zellularität nimmt physiologisch mit dem Alter ab.
• Beurteilung des Verhältnisses der Erythro- zur Granulopoese (EP : GP). Das normale Verhältnis von EP zu GP beträgt etwa 1 : 3–4. Die Ausstrichzytologie erlaubt eine quantitative Beurteilung nur in relativer Form. Beurteilt werden ferner die Verteilung der verschiedenen Reifungsstufen, insbesondere auch Prozent der Blasten, sowie Veränderungen von Zytoplasma und Zellkern und Dysplasiezeichen. Angegeben wird der Anteil von Eosinophilen, Basophilen und Monozyten. Quantitative und qualitative Beurteilung der Megakaryozyten-Anzahl, Verteilung und Feinstruktur von Lymphozyten, Plasmazellen und Retikulumzellen sind nötig.
• Zur Frage der absoluten Zelldichte und der möglichen heterogenen Zellverteilung in den Markräumen muss das histologische Schnittpräparat hinzugezogen und, ebenso Lebensalters adaptiert, quantitativ oder semiquantitativ ausgewertet werden. Speichereisen in den Retikulumzellen sowie Quantifizierung von Sideroblasten und Ringsideroblasten (in der Berliner-Blau-Färbung) können besser zytomorphologisch als histologisch erfolgen.

Beim Nachweis von Blasten oder bei der Frage MDS werden zur weiteren morphologischen Differenzierung folgende zytochemische Färbungen an Blut- und KM-Ausstrichen durchgeführt:

• Obligat die Myloperoxidase, evtl. in der Histologie Chloracetatesterase oder Sudan-Schwarz als Hinweis auf Zugehörigkeit zur granulozytären Reihe, sowie die unspezifische Esterase. Letztere gibt einen Hinweis auf Zugehörigkeit zur monozytären Reihe (Tab. 15.14-1 – Methoden im Rahmen der Knochenmark-Diagnostik bei Primärdiagnose/Verdachtsdiagnose von Leukämien und Lymphomen).
• Fakultativ und durch die Anwendung der Immunphänotypisierung heute nicht mehr nötig sind die PAS-Reaktion als Hinweis auf Zugehörigkeit zur lymphatischen und erythrozytären Reihe bei AML-M6 (nach FAB), sowie die saure Phosphatase als Hinweis auf die T-Zell-Natur einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL).

Bei obligater Verwendung der Immunphänotypisierung, der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) oder der Molekulargenetik (PCR) sind folgende Untersuchungen wegen fehlender Sensitivität und Spezifität nicht angewendet werden:

• Die alkalische Leukozyten-/Neutrophilenphosphatase (ALP/ANP); früher im Zusammenhang mit CML-Ausschluss, heute BCR-ABL.
• Die Tatrat resistente saure Phosphatase zum Nachweis der Haarzellleukämie; heute CD103 als APAAP oder Immunphänotypisierung/Immunhistologie.
• Die terminale Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) bei der ALL am Ausstrich; heute Immunphänotypisierung.

15.14.3 Verarbeitung und Auswertung der Knochenmark­histologie

Die Knochenmarkbiopsie erlaubt nicht nur eine Beurteilung der einzelnen zellulären Bestandteile des Knochenmarks, sondern auch eine echte quantitative Beurteilung des Zellgehalts, sowie eine Analyse der topografischen Verteilung der Zellen und des Eisengehalts, Aussagen zum Stroma des Knochenmarks und zu ossären Veränderungen. Der Stellenwert der Knochenmarkbiopsie in der Diagnostik hämatologischer Erkrankungen hängt eng mit der jeweiligen Fragestellung zusammen. So erscheint sie z.B. beim der primären Myelofibrose (PMF) und der aplastischen Anämie für die Diagnosestellung unabdingbar; bei anderen Erkrankungen, wie z.B. den akuten Leukämien, kann sie wertvolle Zusatzinformationen zur Zytomorphologie liefern. Heute wird bei der Verdachtsdiagnose Leukämie/Lymphom eine Paraffineinbettung verwendet, die eine präzise diagnostische Begutachtung des Gewebematerials erlaubt /1, 5, 7/. Als Standardfärbungen werden an allen Biopsien durchgeführt:

• Giemsa für zelluläre Details.
• PAS für zelluläre Details und zum Nachweis von Speicherzellen.
• Gomori-Silber zur Darstellung von Fasern.
• Berliner Blau zum Nachweis des Eisengehalts.
• Naphthol-AS-D-Chloracetat-Esterase Reaktion für die Darstellung der Granulopoese und von Mastzellen.

Die Immunhistologie wird ergänzend zur Darstellung und Charakterisierung der Zellen angewendet. Zur Diagnostik von Erkrankungen der Hämatopoese sind folgende Marker routinemäßig einsetzbar:

• Myeloperoxidase (MPO) und CD15 für die Granulopoese.
• CD61 für die Megakaryopoese.
• Glycophorin A für die Erythropoese.
• CD34 für Progenitorzellen.
• CD68 für das Monozyten-und Makrophagensystem.
• CD117 für Mastzellen.

Darüber hinaus kommen immunhistologische Untersuchungen vor allem bei der Charakterisierung lymphatischer Aggregate, bei der Haarzellleukämie bzw. der Subtypisierung von Infiltraten maligner Lymphome, z.B. CD19, CD20, CD3, CD103, CD138 und bei der Identifikation von Metastasen markfremder Tumorzellen, z.B. Zytokeratin, Hormonrezeptoren, zum Einsatz.

Literatur

1. Mufti GJ, Flandrin G, Schäfer HE, Sandberg AA, Kanfer EJ: An Atlas of Malignant Haematology. London; Verlag Martin Dunitz, 1996.

2. Löffler H, Rastetter J, Haferlach T. Atlas der klinischen Hämatologie, 6. Aufl. Heidelberg; Springer, 2004.

3. Theml H, Diem H, Haferlach T. Taschenatlas der Hämatologie, 5. Aufl. Stuttgart; Thieme, 2002.

4. Haferlach T, Labordiagnostik bei Leukämien und Lymphomen, 2. Aufl.. Bremen; UNI-MED, 2007.

5. Bain JB, Clark DM, Lampert IA, Koch S: Knochenmarkpathologie. Atlas und Lehrbuch. Blackwell; Berlin, 2000.

6. Haferlach T, Haferlach C, Kern W, Labordiagnostik in der Hämatologie, Köln, Deutscher Ärzte-Verlag, 2011

7. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES. WHO Classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon, International Agency for Research on Cancer (IARC), 2008.

8. Löffler H, Haferlach T. Hämatologische Erkrankungen, Heidelberg, Springer, 2010.

15.15 Akute Leukämien

Torsten Haferlach

Die diagnostischen Möglichkeiten bei den akuten Leukämien wurden grundlegend erweitert. Zum einen wurde eine Vielzahl Methoden für die Diagnostik etabliert, zum anderen haben Erkenntnisse aus Korrelationen von biologischen Parametern und klinischem Verlauf dazu geführt, dass die diagnostischen Befunde in vielen Fällen eine Voraussetzung für das Einleiten der richtigen Therapie geworden sind. Zusätzlich erhält man durch diese Diagnostik wichtige prognostische Parameter. Schon allein deshalb sollte die Diagnostik umfassend und gleichzeitig zielgerichtet durchgeführt werden. Die Erkenntnisse haben auch zu neuen Klassifikationen, speziell der WHO-geführt /1/. So stehen Einteilungen nach Morphologie (FAB-Klassifikation), nach Zytogenetik (teils WHO-Klassifikation) und auch nach Ergebnissen der Immunphänotypisierung (analog der EGIL-Klassifikation) nebeneinander und müssen beachtet werden /2, 3, 4, 5, 6/. Dies führt zu potentiellen Algorithmen in der Diagnostik von Leukämien, nicht nur für die primäre Diagnostik, sondern auch für Verlaufsuntersuchungen zur Therapiekontrolle (Minimal residual disease, MRD). Gleichzeitig sind kurzfristig auch viele neue Daten, insbesondere durch molekulare Methoden, wie z.B. durch Analyse der Genexpression und Next-generation Sequencing (NGS), zu erwarten. Diese werden gerade im Bereich der Hämatologie die aktuelle Diagnostik kurzfristig ergänzen und z.T. vielleicht auch komplett ersetzen können.

Materialgewinnung

Es sollte in allen Verdachtsfällen auf akute Leukämien die Untersuchung von Blut und Knochenmark parallel angestrebt werden. Zur Herstellung von Ausstrichen für die Zytomorphologie und Zytochemie (mindestens 6–8 Ausstriche anfertigen). Falls die alkalische Phosphatase-anti-alkalische Phosphatase (APAAP) oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) bestimmt werden soll, muss als Antikoagulans EDTA oder Citrat verwendet werden. Das so ungerinnbar gemachte Material kann bei Bedarf auch für die Immunphänotypisierung und für molekulare Analyse z.B. mittels der die Polymerase Kettenreaktion eingesetzt werden. Diese beiden letztgenannten Methoden sowie FISH kann man alternativ auch mit Heparinblut oder im Knochenmark durchführen. Für die Zytogenetik muss Heparin als Antikoagulans verwendet werden, da nur so vitale Zellen für die Chromosomenanalyse zur Verfügung stehen, die in die Metaphase gehen können. Eine aktuelle Diagnostik bei Leukämien benötigt somit im besten Fall EDTA- und Heparinblut sowie EDTA- und Heparin-Knochenmark.

Die Gesamtmenge des entnommenen Knochenmarks sollte 5–20 ml betragen. Darüber hinaus muss auch bei akuten Leukämien eine Entnahme für die Histologie mittels Beckenkammpunktion in Abhängigkeit von der Verdachtsdiagnose erwogen werden /7/. Eine Orientierung gestattet Tab. 15.15-1 – Methoden zur Diagnostik bei akuten Leukämien.

Klassifikation

Zur ersten Diagnose und Klassifikation der akuten Leukämien werden heute wegen der klinischen Relevanz und Machbarkeit weiter parallel die morphologischen Kriterien der FAB-Klassifikation, die EGIL-Klassifikation und der WHO-Klassifikation verwendet /1, 2, 3, 4, 5, 6/. Die Einteilung der ALL erfolgt darüber hinaus genauer noch nach Immunphänotypisierung und Zytogenetik/Molekulargenetik. Dies macht die Orientierung momentan kompliziert, wird aber mittelfristig durch ein besseres biologisches Verständnis der einzelnen Subgruppen der Leukämie zu einer spezifischeren Diagnose und letztlich auch zu einer gezielten Therapieentscheidung beitragen. Eine Diagnose stellen ist somit nicht immer gleichzusetzen mit Einteilung im Sinne einer Klassifikation nach WHO.

15.15.1 Diagnostik akuter Leukämien

15.15.1.1 Akute myeloische Leukämie (AML)

Je nach Subtyp der Leukämie haben die Methoden und Klassifikationsmodelle eine spezielle Bedeutung bei der Primärdiagnostik und bei Verlaufsuntersuchungen. Nach FAB- und WHO-Klassifikation sollten KM-Ausstriche ausgewertet werden. Es wird die Zählung von 200–500 KM-Zellen empfohlen. Nach FAB-Einteilung musste der Anteil der Blasten bei über 30 % der kernhaltigen Zellen im KM liegen; nach WHO wurde der Grenzwert auf ≥ 20 % festgelegt, was generell gilt. Von diesem Grenzwert sind nach WHO dann zusätzlich die AML mit spezifischen genetischen Aberrationen, d.h. AML mit t(15;17) oder t(8;21); oder inv(16) oder 11q23 ausgeschlossen.

Werden entsprechende Veränderungen der Chromosomen nachgewiesen, würde man auch dann von AML sprechen, wenn der Anteil der Blasten im Knochenmark unter 20 % läge. Diese Fälle sind aber sehr selten. Der Algorithmus der im klinischen Alltag weiter hilfreichen FAB-Einteilung und die FAB-Subgruppen für die AML sind aufgeführt in:

• Abb. 15.15-1 – Frühere FAB-Klassifikation
• Tab. 15.15-5 – Laborbefunde bei akuter myeloischer Leukämie.

Bei der Diagnose einer ALL ist zytomorphologisch und nach Zytochemie (Myeloperoxidase unter 3 %, unspezifische Esterase negativ) zunächst festzustellen, dass eine AML L-M1–M6 nicht vorliegen. Zur weiteren zielführenden Einteilung ist dann die Immunphänotypisierung nötig, die einerseits die AML-M0 und die AML-M7 nach FAB sowie die biliniären und biphänotypischen akuten Leukämien nach EGIL und nach WHO von den klassischen ALL der B- und T-Linie abtrennt. Diese werden dann zusätzlich auf Grund ihres Markerprofils in weitere Untergruppen eingeteilt.Siehe:

• Beitrag 15.15 – Akute Leukämien
• Beitrag 15.16 – Myelodysplastische Syndrome.

Erste Beurteilung des KM bei der AML und der ALL

Beurteilt werden:

• Zellgehalt auf dem Ausstrich, Bröckchen vorhanden.
• Beschreibung der Morphologie von Blasten nach Größe, Kern-Plasma Relation, Zytoplasmafarbe, Einschlüsse, Auerstäbchen, Pseudo-Chediak Körperchen.
• Anteil der Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Stäbe, Segmentkernige, Eosinophile, abnorme Eosinophile, Basophile, Monozyten.
• Anteil der kernhaltigen Zellen der roten Reihe nach unterschiedlichem Reifungsgrad.
• Anteil der reifen Lymphozyten, Plasmazellen.
• Falls erforderlich vorhanden Gewebsmastzellen.
• Zahl und Form der Megakaryozyten.

Weitergehende Definition der Blasten

Vielfach wurde versucht, die myeloischen Blasten nochmals nach Form und insbesondere Zahl der Granula im Zytoplasma zu unterteilen. Aus heutiger Sicht erscheint es allenfalls noch sinnvoll, folgende Unterteilung vorzunehmen:

• Typ I-Blasten: Myeloblast mit unreifem Zytoplasma, ohne Granula, der Kern kann einzelne Nukleoli zeigen.
• Typ II-Blasten: Ähnlich wie Typ I, aber mit 20 (andere Klassifikationen 15) azurophilen Granula im Zytoplasma.

Der früher noch als Typ III-Blast abgegrenzte Subtyp mit mehr als 15 bzw. 20 Granula sollte in der Routine entfallen. Es gilt zu bedenken, dass die Reproduzierbarkeit dieser Blasteneinteilung extrem begrenzt und ohne jede klinische oder klassifikatorische Relevanz ist. Sie kann deshalb bei der Klassifikation der AML und MDS zumeist vernachlässigt werden. Darüber hinaus sollten aber nach Morphologie und insbesondere nach Ausfall der Zytochemie sowie wenn erforderlich unter Zuhilfenahme von APAAP oder Immunphänotypisierung folgende Blastensubgruppen erfassbar sein:

• Atypische Promyelozyten bei der AML-M3 und M3-Variante mit Translokation (15;17) und PML-RARA Nachweis.
• Monoblasten und Promonoblasten, speziell nach unspezifischer Esterasereaktion bei der AML-M4, AML-M5a und AML-M5b.
• Megakaryoblasten nach Messung von CD41 bzw. CD61 bei der AML-M7 mittels APAAP oder Immunphänotypisierung.

Proerythroblasten werden nicht zu den echten Blasten addiert, da sie sich schwer zwischen normal und maligne zuordnen lassen.

Beurteilung der Dysplasie

Neben dem Anteil der Blasten speziell, bei der AML, der eine Abgrenzung zu den Myelodysplasien ermöglicht, ist nach WHO 2008 auch bei der AML die Erfassung dysplastischer Veränderungen der drei Zellreihen wichtig geworden (WHO-Klassifikation, Tab. 15.15-3 – WHO-Klassifikation der AML). Zur Beurteilung der Dysplasie bei der AML nach WHO sind die Kriterien von Goasguen & Bennett zu verwenden /1, 8/:

Dysgranulopoese:

≥ 50 % der Segmentkernigen (zumindest 10) sind agranulär oder hypogranulär, oder Pseudo-Pelger-Huet Veränderungen oder Peroxidasedefekt.

Über 100 Zellen sollten beurteilt werden

Dyserythropoese:

≥ 50 % von zumindest 25 kernhaltigen Zellen der roten Reihe zeigen eine der folgenden morphologischen Auffälligkeiten:

• Karyorrhexis
• Megaloblastoide Veränderungen
• Mehrkernigkeit
• Kernabsprengungen

Dysmegakaryopoese:

≥ 50 % von zumindest 6 Megakaryozyten zeigen eine der folgenden Auffälligkeiten:

• Mikromegakaryozyten
• Multiple Einzelkerne
• Große mononukleäre Kernform

Es gilt bei der Dysplasie Beurteilung besonders zu beachten, dass bei der AML zumindest 50 % aller Zellen einer jeweiligen Reihe eine oder mehrere der zuvor genannten Veränderungen aufweisen müssen. Nur dann gilt die Reihe als dysplastisch. Dies steht im Gegensatz zur Beurteilung der gleichen Dysplasie Kriterien bei den myelodysplastischen Syndromen, bei denen nur 10 % der jeweils pro Reihe betrachteten Zellen diese Kriterien erfüllen müssen, um von Dysplasie sprechen zu dürfen.

Bei der AML ist die Dysplasie nach WHO 2008 nötig, weil beim Nachweis von 2 oder 3 dysplastischen Linien ein Patient in die Subgruppe „AML mit myelodysplasie-ähnlichen Veränderungen“ eingeordnet werden könnte.

Morphologische Einteilung der AML nach FAB Kriterien

Die FAB Einteilung basierte auf dem Reifungsgrad der Blasten, Zugehörigkeit zu Zelllinien und Zahl der Blasten sowie Beurteilung der Zytochemie, speziell Myeloperoxidase (MPO)- und unspezifischer Esterasereaktion (NSE) im KM-Ausstrich. Auch wenn sie in den Zeiten der WHO 2008 Klassifikation so eigentlich nicht mehr verwendet werden sollte, hat sie aus klinischer Sicht (man kann nicht 7–10 Tage auf eine komplette Diagnose nach WHO Kriterien warten) unverändert eine praktische Relevanz.

Die Ausreifung der Blasten und ihre jeweilige Abgrenzung zum normalen wie zum abnormen Promyelozyten (der AML-M3) kann nach Tab. 15.15-4 – Abgrenzung der Blasten von abnormen Promyelozyten bzw. von normalen Promyelozyten beurteilt werden. Die weitere Unterteilung der AML anhand morphologischer Eigenschaften nach FAB ist zu entnehmen aus Abb. 15.15-2 – Ablauf der Standarddiagnostik der akuten lymphatischen Leukämie zu.

Morphologische Aspekte zu den Subentitäten

AML-M0: Differentialdiagnostisch kommen biphänotypische akute Leukämien (EGIL-Klassifikation), auch die ALL, speziell mit t(9;22), sowie die AML-M5a in Frage. Zur definitiven Festlegung auf AML-M0 benötigt man deshalb eine Immunphänotypisierung.

AML-M1: Wegen des knappen Zytoplasmas und wenig Ausreifung sieht man speziell im peripheren Blutausstrich nicht selten sog. Pseudonukleoli, die dem sich in den Kern eindrückenden Golgiapparat entsprechen. Sie sollten nicht mit Riesennukleoli verwechselt werden. Es gibt eine gewisse Korrelation zum Nachweis dieses morphologischen Befundes und einer Mutation im NPM1 Gen. Die Ausreifung der Granulopoese auf die Stufe eines Promyelozyten oder darüber hinaus ist unter 10 %.

AML-M2: Die Ausreifung der Granulopoese auf die Stufe eines Promyelozyten oder darüber hinaus ist über 10 %. Man findet eine gewisse Korrelation dieses FAB-Subtyps mit der AML mit Translokation t(8;21). Von diesen genetisch definierten AML zeigen 90 % einen FAB-Subtyp M2 und 10 % einen Subtyp M1. Die Fälle mit AML-M2 und t(8;21) haben häufig Blasten Typ II oder Zellen, die nahe einem Promyelozyten sind (früher sog. Typ III-Blasten). Nach WHO liegt aber immer eine AML vor, auch wenn der Anteil der eindeutigen Blasten im strengeren Sinne unter 20 % wäre (Tab. 15.15-3 – WHO-Klassifikation der AML 2008). Dieser AML-Subtyp zeigt häufig lange Nadel ähnliche Auerstäbchen, eine Dysgranulopoese und eine leichte Eosinophilie.

AML-M3: Im Vordergrund stehen abnorme Promyelozyten, vielfach mit Bündeln von Auerstäbchen, sog. Faggot-Zellen. Die MPO ist immer über 90 % stark-positiv. Im peripheren Blut häufig Leukopenie.

AML-M3variant(v): Die Kerne sind bilobulär und können leicht mit Monozyten verwechselt werden. Man sieht kaum Granula und auch seltener Auerstäbchen als bei der M3. Die MPO ist auch hier stark positiv, die NSE ist negativ. Im peripheren Blut häufig Leukozytose.

AML-M4: Gemisch aus myeloischen und monozytären Blasten, dabei MPO über 3 % und NSE über 20 % im KM. Der Anteil der monozytären Blasten liegt somit über 20 %, aber unter 80 %.

AML-M4eo: Blasten wie in M4 und gleiche Zytochemie, aber daneben eindeutige sogenannte pathologische Eosinophile mit distinkten dunklen Granula. Diese Eosinophilen sind im Gegensatz zu normalen Eosinophilen positiv für Chloracetatesterase positiv. Beweisend für diesen Subtyp ist der Nachweis einer Inversion im Chromosom 16 bzw. das molekulare Korrelat CBFB-MYH11.

AML-M5a: Meist monomorphe Blastenpopulation mit relativ blauem Zytoplasma mit netziger Binnentextur. Sehr starke NSE in über 80 % der Blasten. Differentialdiagnostisch muss an M0, ALL (auch Burkitt-Typ) und an ein entdifferenziertes multiples Myelom gedacht werden.

AML-M5b: Dieser reifere Subtyp der monoblastären AML ist bzgl. der Ausreifung der monoblastären Zellen besser im Blut als im KM zu diagnostizieren. Auch hier findet sich in über 80 % eine mittelstarke bis starke NSE. Diese fällt im KM stärker als im Blut aus.

Bei AML-M5a und AML-M5b finden sich nicht selten zum Zeitpunkt der Diagnose eine Gingiva Hyperplasie oder Hautinfiltrate durch die Blasten.

AML-M6: Mehr als 50 % aller kernhaltigen Zellen gehören der roten Reihe an. Von den übrigen nicht-erythropoetischen Zellen sind zumindest 20–30 % Blasten (nach FAB). Mehr historisch zu sehen ist die Bedeutung der starken PAS-Positivität in den unreifen Erythropoese-Zellen. Sie kann die Diagnose M6 stützen, da eine normale Erythropoese diese Reaktion nicht zeigt, ist die PAS nicht unbedingt mehr in der Diagnostik der AML, speziell der AML-M6, notwendig.

AML-M7: Man hat bei diesem Subtyp, der viel häufiger bei Kindern als bei Erwachsenen beobachtet wird, häufig eine KM-Fibrose mit Punctio sicca. Auch wenn die Blasten eine gewisse spezifische Morphologie mit Ausstülpungen des Zytoplasma haben und z.T. an Megakaryoblasten erinnern, kann die Diagnose rein zytomorphologisch nicht zweifelsfrei gestellt werden. Bei Verdacht auf AML-M7 muss immer eine Immunphänotypisierung oder APAAP mit zumindest CD41 oder CD61 erfolgen.

Einteilung der akuten myeloischen Leukämien (AML) nach der WHO-Klassifikation 2008

Im Rahmen einer rein zytomorphologischen Abgrenzung zwischen AML und MDS sowie auch gegenüber den biliniären akuten Leukämien und der ALL wurde in der WHO-Klassifikation 2008 der AML (Tab. 15.15-3 – WHO-Klassifikation der AML) erneut festgelegt, dass bei über 20 % Blasten im Knochenmark von einer AML zu sprechen ist und somit die Kategorie RAEB-T, die zu den Myelodysplasien gehörte, entfällt /1/.

Als wichtigster, erster Schritt im Sinne einer biologischen Einteilung von Krankheitsbildern hat die WHO im Sinne einer Hierarchie als erste Stufe vier genetisch definierte Subtypen von AML mit spezifischen balancierten Translokationen als eigene Gruppe zusammengefasst. Für die vier in Tab. 15.15-3 – WHO-Klassifikation der AML 2008 genannten genetisch definierten Gruppen gilt z.T. die Bezeichnung AML auch dann, wenn die Zahl der Blasten im Knochenmark unter 20 % beträgt. Eine Einordnung in die MDS ist so ausgeschlossen.

Als zweiter Schritt der WHO-Klassifikation wurde eine Subgruppe herausgestellt, die u.a. auf der Basis morphologischer Kriterien definiert ist; die AML mit multiliniärer Dysplasie. Die dysplastischen Veränderungen werden dabei nach den Kriterien von Goasguen und Bennett eingeteilt /8/.

Als multilineär wird von der WHO der Nachweis von Dysplasien in zwei oder drei Zelllinien bei zumindest 50 % der analysierten Zellen im Knochenmark verstanden. Dies setzt somit für die AML einen sehr viel höheren Grenzwert zum Nachweis von Dysplasie fest als für die MDS; bei dieser müssen nur 10 % der Zellen Dysplasiekriterien aufweisen. In diese Gruppe fallen auch Patienten, die gleichzeitig oder nur zytogenetische Veränderungen haben, wie man sie beim MDS finden kann und solche, die in der Vorgeschichte ein MDS oder ein MDS/MPN overlap hatten. Diese somit divers definierte Kategorie der AML nach WHO muss noch weiter auf ihre Eigenständigkeit hin in prospektiven Studien geprüft werden. Verschiedene Analysen legen nahe, dass zwar die morphologischen Unterschiede erfasst werden können und teilweise auch mit bestimmten genetischen Subgruppen korrelieren, eine eigene prognostische Relevanz gilt es noch zu beweisen.

Auf dritter Stufe der WHO Hierarchie werden Subgruppen erfasst, die sich nur unter Einbeziehung der Anamnese definieren lassen; hier werden insbesondere die Therapie assoziierten MDS und AML geführt. Eine zusätzliche Unterteilung dieser Gruppe der AML nach dem Modus der vorausgegangenen Therapie (nach Alkylantien, nach Topoisomerase II-Hemmern, nach anderen Medikamenten oder nach Strahlentherapie) ist zur Beschreibung der Biologie und des klinischen Verlaufs zwingend erforderlich. Nicht nur klinische, sondern speziell auch zytogenetische und molekulargenetische Unterschiede zeichnen sich bei diesen Subgruppen ab, deren weitere Erfassung und biologische Beschreibung über diesen Vorschlag der WHO sinnvoll ermöglicht wird. In dieser Subgruppe werden nach WHO auch die AML nach vorangegangenem MDS oder MPS erfasst.

Erst in der vierten Stufe der WHO-Einteilung der AML wird auf die alten, rein morphologischen bzw. immunphänotypischen Subgruppen nach den oben dargestellten FAB-Kriterien zurückgegriffen. Dabei wurden weitere Subentitäten hinzugefügt: Die akute Basophilen-Leukämie, die akute Panmyelose mit Fibrose und das Myelosarkom bzw. Chlorom. Es bleibt abzuwarten, ob diese sehr seltenen Untergruppen der AML durch die Erfasssung nach WHO-Kriterien jetzt klarer erscheinen. Sie lassen sich teilweise nur unter Einbeziehung der histologischen Untersuchung diagnostizieren.

Im Beitrag 15.15 werden nach WHO jetzt auch die biphänotypischen Leukämien abgehandelt. Sie sollen nach den Kriterien der EGIL-Gruppe /6/ auf der Basis des Immunphänotyps definiert werden und stehen zwischen den akuten lymphatischen und den akuten myeloischen Leukämien.

In dieser Gruppe werden auch die undifferenzierten akuten Leukämien mit biliniären Eigenschaften und den genetischen Veränderungen t(9;22) oder t(4;11) erfasst. Ein Algorithmus zur AML-Primärdiagnose und Verlaufsuntersuchungen ist dargestellt in Abb. 15.15-2 – Ablauf der Standarddiagnostik der akuten lymphatischen Leukämie.

Zytogenetik, FISH und Molekulargenetik bei Leukämien

Bei Leukämien sind charakteristische Aberrationen der Chromosomen bekannt, die eigenständige Entitäten mit typischer Morphologie und charakteristischem klinischen Verlauf definieren. Sie sind zunehmend auch mit direkten therapeutischen Konsequenzen gekoppelt. So wurden in die neue WHO-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämien spezifische Veränderungen der Chromosomen als entscheidendes Klassifikationskriterium aufgenommen. Neben der klassischen Zytogenetik, der Chromosomenbänderungs-Analyse, spielen additiv und auch eigenständig zunehmend die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) und molekulare Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine sehr wichtige Rolle. Dies gilt zur Diagnostik und Klassifikation von Leukämien und auch zur Bestimmung des Ansprechens auf Therapie (minimale Resterkrankung, MRD). Zur Zytogenetik und Molekulargenetik bei Leukämien siehe Übersichtsliteratur /7, 9/ und auch Tab. 15.15-1 – Methoden zur Diagnostik bei akuten Leukämien.

15.15.1.2 Akute lymphatische Leukämie (ALL)

Zytomorphologie, Zytochemie (Pappenheim, Myeloperoxidase, früher auch PAS) und insbesondere die Immunphänotypisierung, Chromosomenanalyse und Molekulargenetik stellen die Primärdiagnostik bei der ALL (Abb. 15.15-2 – Standarddiagnostik der akuten lymphatischen Leukämie). Die Therapie wird maßgeblich vom Befund der Immunphänotypisierung und der Zytogenetik/Molekulargenetik beeinflusst. Neben der Unterscheidung zwischen B- und T-Zell-Reihe sind viele zusätzliche Aspekte zu erhalten. Darüber hinaus sind zahlreiche Aberrationen von Chromosomen beschrieben, die prognostische und therapeutische Relevanz haben. Zum einen werden die ALL anhand des Karyotyps in sogenannte Ploidiegruppen, d.h. nach der Anzahl der Chromosomen eingeteilt, zum anderen erfolgt eine Gruppierung nach strukturellen Aberrationen. Die häufigste Translokation der ALL im Erwachsenenalter ist die t(9;22)(q34;q11). Sie ist mit einer ungünstigeren Prognose assoziiert und bedarf gezielter Therapie.

Durch die Einführung von z.B. Imatinib, einem spezifischen Tyrosinkinase Inhibitor, hat der Nachweis der Philadelphia-Translokation bzw. des molekulargenetischen Korrelats, des BCR-ABL-Rearrangements eine hohe therapeutische Bedeutung erlangt. Da bei einem kleinen Anteil von ALL sogenannte kryptische BCR-ABL-Rearrangements vorliegen, die mittels Chromosomenanalyse nicht detektierbar sind, sollte auf Grund der wichtigen therapeutischen Konsequenzen ein Screening mittels FISH oder RT-PCR bei allen ALL der B-Zellreihe in Erwägung gezogen werden /7, 10/. Im Rahmen von wissenschaftlichen Analysen erfolgt die Beurteilung des Therapieansprechens mittels Real time PCR, entweder mittels Leukämie spezifischer Fusionstranskripte oder Patienten spezifischer Immunglobulin- oder T-Zellrezeptor-Rearrangements. Von diesen Daten sind entscheidende Fortschritte der Therapiesteuerung zu erwarten. Erste Ergebnisse bei Kindern sind vielversprechend /11/.

Die Einteilung der ALL nach rein morphologischen Kriterien, wie sie nach der FAB-Klassifikation vorgenommen wurden (L1, L2, L3), spielt keine Rolle mehr. Eine gewisse Reminiszenz wird allenfalls dadurch erbracht, dass der Subtyp der reifen B-ALL mit t(8;14) zumeist dem nach FAB sogenannten L3-Subtyp entspricht. Die Zellen zeigen dann meist ein sehr dunkelblaues Zytoplasma und viele Vakuolen. Die Morphologie allein darf aber wegen der immensen therapeutischen Konsequenzen auch in diesem Falle nicht allein als hinreichend angesehen werden. Sie muss unbedingt durch Immunphänotypisierung und Zytogenetik bzw. Molekulargenetik ergänzt werden.

15.15.2 Bedeutung der KM-Histologie bei akuten Leukämien

Im Gegensatz zur Bedeutung der KM-Histologie bei chronischen Leukämien und beim Lymphomstaging ist die Bedeutung bei den akuten Leukämien eher untergeordnet. Einzelne Aspekte sprechen neben den zuvor beschriebenen Methoden der Zytomorphologie, Zytochemie auf Ausstrichen, der Immunphänotypisierung sowie der Zytogenetik und der Molekulargenetik für eine zusätzliche Durchführung einer KM-Stanze bei:

• Punctio sicca und Leukopenie oder fehlenden Blasten im peripheren Blut.
• Starker Fibrose, z.B. AML-M7 oder Packed marrow, das ebenso dann zur Punctio sicca bei der Aspiration führt.
• Bestimmung der Neo-Angiogenese in entsprechenden Therapiestudien mit Hemmern der Angiogenese.
• Differentialdiagnose zur schweren aplastischen Anämie (SAA), hypozellulärem MDS oder bei Verdacht auf Tumorzellinfiltration im Knochenmark.
• Staging und Verdachtsdiagnose eines Lymphoms, um den KM-Befall sicher erfassen zu können. Hier sind KM-Stanze inkl. Immunhistologie und Immunphänotypisierung aus KM-Aspirat komplementär aber nicht in allen Fällen übereinstimmend, so dass die richtigste Aussage nur bei Verwendung beider Methoden erhalten wird.

So gilt es, in jedem Einzelfall eine Abwägung hinsichtlich einer KM-Biopsie bei Diagnosestellung einer akuten Leukämie zu machen. Zwar kann diese wohl zumeist entfallen, sollte aber ggf. bei Notwendigkeit zeitgleich mit den anderen Entnahmen durchgeführt werden, um einen zweiten Eingriff zu vermeiden. Aktuelle weiterführende Literatur zur Diagnostik bei akuten Leukämien siehe Lit. /12, 13/.

Literatur

1. Swerdlow SH, Campo E, Poleri SA, Harris NL, Stein H, Siebert L, et al., The 2016 revision of the World health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016; 127: 2375- 90.

2. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau M, et al. The 2016 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016. doi: 10.1182/blood2016-03-643544.

3. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 1985; 103: 620–5.

4. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Criteria for the diagnosis of acute leukemia of megakaryocyte lineage (M7). Ann Intern Med 1985; 103: 460–2.

5. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposal for the recognition of minimally differentiated acute myeloid leukemia (AML-M0). Br J Haematol 1991; 78: 325–9.

6. Béné M-C, Castoldi G, Knapp W, et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995; 9: 1783–6.

7. Löffler H, Haferlach T, Schoch C. WHO-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämien (AML) und der myelodysplastischen Syndrome (MDS) – Hämatologische Erkrankungen – Ein diagnostisches Handbuch. DMW 2002; 127: 447–5. Heidelberg; Springer; 2010.

8. Goasguen JE, Matsuo T, Cox C, Bennett JM. Evaluation of the dysmyelopoiesis in 336 patients with de novo acute myeloid leukemia: Major importance of dysgranulopoiesis for remission and survival. Leukemia 1992; 6: 520–5.

9. Haferlach T. (Hrsg.), Ludwig W-D, Haferlach T, Schoch C. Labordiagnostik bei Leukämien und Lymphomen. Classification of acute leukemias. Bremen, Unimed 2007.

10. Schoch C, Schnittger S, Bursch S, et al. Comparison of chromosome banding analysis, interphase- and hypermetaphase-FISH, qualitative and quantitative PCR for diagnosis and for follow-up in chronic myeloid leukemia: A study on 350 cases. Leukemia 2002; 16: 53–9.

11. van Dongen JJM, Seriu T, Panzer-Grünmayer ER, et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet 1998; 352: 1731–8.

12. Löffler H, Rastetter J, Haferlach T. Atlas der klinischen Hämatologie. Heidelberg; Springer; 2004.

13. Theml H, Diem H, Haferlach T. Taschenatlas der Hämatologiel. Stuttgart; Thieme, 2002.

14. Journal article. A patient with hypokalemia and hypoxemia – what is the culprit? Clin Chem 2023; 69 (11): 1220–5.

15.16 Myelodysplastische Syndrome

Torsten Haferlach

Die myelodysplastischen Syndrome (MDS) sind myeloide Neoplasmen, die charakterisiert sind durch die klonale Proliferation hämatopoetischer Stammzellen, genetischen Abnormitäten, Myelodysplasie, ineffektiver Hämatopoese, Zytopenie des peripheren Blutes und einem hohen Risiko der Ausbildung einer akuten myeloischen Leukämie /1/. Die MDS entstehen auf dem Boden genetischer Veränderungen hämatopoetischer Stammzellen. Diese bedingen eine ineffektive Hämatopoese, häufig mit Zytopenien im peripheren Blut. Klinisch in Erscheinung treten eine Anämiesymptomatik (ineffektive Erythropoese), eine erhöhte Infektanfälligkeit (Granulozytopenie) und eine hämorrhagische Diathese (Thrombozytopenie). MDS sind Erkrankungen des höheren Lebensalters, das mediane Erkrankungsalter liegt bei 69 Jahren. Die Inzidenz im Alter über 70 J. ist 30 : 100.000 Einwohner/Jahr.

15.16.1 Diagnostik der MDS

Die Diagnose von MDS wird bisher auf dem Boden der zytomorphologischen Untersuchung von Knochenmark und peripherem Blut gestellt.

Ziel der Diagnosestellung ist die Abgrenzung der MDS von anderen klonalen myeloischen Erkrankungen, wie der AML, aber auch der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie (PNH), der schweren aplastischen Anämie (SAA) und von reaktiven und anderen benignen Veränderungen, die mit einer dysplastischen Hämatopoese einhergehen können. Neben der Zytomorphologie kommt ein zentraler diagnostischer Stellenwert auch der Zytogenetik zu, die nicht nur im Fall eines aberranten Karyotyps das Vorliegen einer klonalen Erkrankung bestätigt, sondern auch großen prognostischen Wert hat und in der neuen WHO-Klassifikation Beachtung findet /1/.

Bisher müssen aber noch verschiedene morphologische Klassifikationen zur Einteilung der MDS Anwendung finden. So galt bis vor kurzem die FAB-Einteilung, die jetzt durch die WHO-Klassifikation erweitert und schrittweise abgelöst wird /1, 2/.

Die Einteilung der MDS nach WHO beruht somit zunächst vorwiegend auf zytomorphologischen Kriterien:

• Dysplasie der Granulopoese und/oder der Erythropoese und/oder der Megakaryopoese.
• Nachweis von Ringsideroblasten.
• Der relativen und absolute Zahl von Monozyten
• Dem Anteil der myeloischen Blasten im Blut und/oder im Knochenmark.

Anhand dieser Einzelparameter, wobei für den Nachweis der Dysplasie bei den MDS nur 10 % der beurteilten Zellen der im Beitrag 15.15 genannten Dysplasiekriterien /3/ aufweisen müssen, siehe:

• Beitrag 15.15 – Akute Leukämien
• Tab. 15.16-1 – WHO-Einteilung der myelodysplastischen Syndrome 2008).

Die WHO-Klassifikation des MDS basiert primär hauptsächlich auf zytomorphologischen Kriterien (Tab. 15.16-2 – IPSS-Score, Gruppierung nach Punkten). Die Entitäten RA, RARS bleiben erhalten, die Entitäten RAEB sowie CMML werden je nach Anteil der Blasten im KM nochmals weiter unterteilt. Außerdem wird die Kategorie Refractory cytopenia with multilineage dysplasie, RCDM und eine Untergruppe MDS-unclassifiable eingeführt. Es bleibt abzuwarten, ob diese wiederum auf rein morphologischen Kriterien basierende weitere Aufteilung der MDS sehr absehbar mit molekularen Markern verbessert und verändert wird und eine neue klinische Relevanz definiert und getestet werden muss /2/. Sicher ist es aber weiterhin sinnvoll, die Entität 5q-Syndrom als eigene Kategorie aufzuführen, da sie klinisch und genetisch klar von allen anderen MDS-Subgruppen abgrenzbar ist, und eine günstigere Prognose und eine spezifischere Therapie aufweisen kann mit Lenalidomid. Doch auch hier spielen zunehmend zusätzliche Erkenntnisse aus der Molekulargenetik, z.B. zu TP53-Mutationen bei Patienten mit 5q-Syndrom, eine Rolle /3/.

Im Rahmen der zytomorphologischen Diagnostik sollten mindestens 200 (nach WHO 500) Knochenmarkzellen und 20 Megakaryozyten evaluiert werden, Dysplasiezeichen beim MDS sollten in mindestens 10 % der Zellen nachweisbar sein. Einen besonderen diagnostischen Stellenwert haben Pseudo-Pelger-Neutrophile, Peroxidase-Defekt der Segmentkernigen, Ringsideroblasten, Mikromegakaryozyten und die Vermehrung von KM-Blasten zwischen 5–19 %. Diese morphologischen Veränderungen korrelieren zwar z.T. mit dem Vorliegen klonaler zytogenetischer und neuerdings auch molekulargenetischer Marker, weisen allerdings auch eine deutliche Abhängigkeit vom Untersucher auf. Es bleibt abzuwarten, ob diese wiederum auf rein morphologischen Kriterien basierende weitere Aufteilung der MDS klinische Relevanz haben wird. Sicher ist es aber sinnvoll, die Entität 5q-Syndrom als eigene Kategorie aufzuführen, da sie klinisch und genetisch klar von allen anderen Subgruppen des MDS abgrenzbar ist und eine günstigere Prognose aufweist.

Dies gilt nicht für das 5q-Syndrom, das durch einen klaren genetischen Marker, Blasten unter 5 % im KM und häufig eine normale oder sogar erhöhte Zahl von Thrombozyten im peripheren Blut charakterisiert ist.

Im morphologischen Bereich sollte somit die Untersuchung der Hypogranulation von Neutrophilen nicht das einzige Kriterium bleiben. Generell ist ein frühes Stadium einer refraktären Anämie (RA) mit Zytopenie und Dysplasie in nur einer Linie häufig schwierig zu diagnostizieren und erfordert die Durchführung von Verlaufskontrollen in Abständen von 2–3 Monaten vor endgültiger Diagnose eines MDS mit ggf. weitreichenden klinischen Konsequenzen. In ähnlicher Weise sind die neu eingeführten Entitäten RN und RT für alleinige Neutropenie (RN) bzw. Thrombozytopenie (RT) einzuschätzen, die zusammen mit der RA jetzt als RCUD (Refractory cytopenia with unilineage dysplasia) aufgeführt werden. Bezugnehmend der Differenzierung zwischen hypoplastischem MDS und aplastischer Anämie ist zu berücksichtigen, dass sich Zeichen der Dysplasie in der Erythropoese auch bei letzterer finden und daher im Gegensatz zu Dysplasiezeichen der anderen Reihen und einer Vermehrung von Blasten im Knochenmark keinen diagnostischen Wert haben. Auch der Nachweis zytogenetischer Veränderungen spricht sicher mehr für das Vorliegen eines MDS als für eine aplastische Anämie, beweist aber weder das eine noch das andere. In die Differentialdiagnose sollte auch die PNH eingeschlossen werden. Eine Histologie inkl. Immunhistologie zur Abgrenzung dieser Entitäten sind anzuraten.

Neben der Zytomorphologie und Zytogenetik findet in zunehmendem Maße auch die multiparametrische Durchflusszytometrie Eingang in die diagnostische Aufarbeitung bei Verdacht auf MDS. So weist diese Methode die Möglichkeit auf, für die verschiedenen Linien der Granulopoese, Monozytopoese und Erythropoese Dysplasiezeichen in Form aberranter Expressionsmuster von Antigenen qualitativ zu beurteilen und die Blasten zu quantifizieren. Dementsprechend ist die Korrelation zu zytomorphologischen Befunden hoch. Auch konnte in zytomorphologisch schwierig einzuordnenden Fällen wertvolle diagnostische Informationen mit prognostischer Relevanz gewonnen werden.

15.16.2 Erfassung von Prognosefaktoren bei der Diagnose eines MDS

Generell ist die Prognose bei Patienten mit MDS gegenüber der Bevölkerung reduziert, insbesondere bei jüngeren Patienten und in Fällen mit Hochrisiko-MDS. Das gegenwärtig aussagekräftigste und weitgehend angewandte System zur Prognoseabschätzung ist der IPSS-Score (International prognostic scoring system) /4/, der die Parameter Blasten im Knochenmark, Karyotyp-Veränderungen und Anzahl der Zytopenien zu Grunde legt:

• Tab. 15.16-3 – IPSS-Score, prognostische Einteilung
• Tab. 15.16-4 – Zytogenetische Alternationen bei MDS und AML.

Das Scoringsystem basiert auf 816 Patienten mit MDS, die zum größten Teil nicht behandelt wurden, so dass der spontane Verlauf abzuschätzen war. Die innerhalb der letzten Jahre gewonnenen biologischen Einblicke in die Grundlagen und den klinischen Verlauf des MDS und die in vielen Aspekten vorhandenen Parallelen zur akuten myeloischen Leukämie (AML) haben, zumindest bei jungen und Hochrisiko Patienten, zur Anwendung von AML-typischen Therapien geführt und schränken somit teilweise die Anwendbarkeit des IPSS-Scores ein. Neue Erkenntnisse aus der Zytogenetik müssen eingearbeitet werden /5, 6/. Auch die Berücksichtung von Transfusionspflichtigkeit zur Prognoseabschätzung wird vorgeschlagen, WPSS /7/. Wie eng die beiden Erkrankungen MDS und AML korrelieren, zeigen die genetischen Aberrationen, die in Tab. 15.16-4 gegenübergestellt sind. Dies zeigt, dass in der Diagnostik des MDS zwar die Zytomorphologie eine wichtige und grundlegende Bedeutung hat, die Frage der Prognose und der eigenständigen biologischen Entität sicher aber mit anderen Parametern, speziell aus der Zytogenetik, beantwortet werden kann /8/. Der IPSS-Score hat hier schon in die richtige Richtung gewiesen.

So gilt für MDS, ebenso wie für die akuten Leukämien und die chronischen myeloproliferativen Syndrome, dass nur durch eine Kombination von Zytomorphologie /5, 9/ und Zytogenetik, möglicherweise bald informativ, noch ergänzt durch Immunphänotypisierung und Molekulargenetik, die Diagnose gestellt werden sollte. Die WHO-Klassifikation von 2008 /1/ wird somit rasch erweitert werden müssen, um neben der Klassifikation in prospektiven Studien ihre klinische und prognostische Relevanz abzubilden. Die nach der Diagnose empfohlene Therapie hat sich von einem häufig nur supportiven und teilweise sogar nihilistischen Ansatz klarer neu ausgerichtet mit biologisch anders wirkenden Substanzen wie Lenalidomid oder Azazytidin und kann nur unter Durchführung der zuvor genannten Labormethoden beim einzelnen Patienten zielgenauer angesetzt werden.

Literatur

1. Cazzola M. Myelodysplastic syndromes. N Engl J. Med 2020; 383: 1358–74.

2. Bejar R, Stevenson K, Abdel-Wahab O, et al. Clinical effect of point mutations in myelodysplastic syndromes. N Engl.J Med 2011; 364: 2496–506.

3. Jadersten M, Saft L, Smith A et al. TP53 mutations in low-risk myelodysplastic syndromes with del(5q) predict disease progression. J Clin Oncol 2011; 29: 1971–9.

4. Greenberg P, Cox C, Le Beau MM et al. International Scoring System for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood 1997; 89: 2079–88.

5. Haase D, Germing U, Schanz J et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood 2007; 110: 4385–95.

6. Schanz J, Steidl C, Fonatsch C et al. Coalesced multicentric analysis of 2,351 patients with myelodysplastic syndromes indicates an under-estimation of poor-risk cytogenetics of myelodysplastic syndromes in the international prognostic scoring system. J Clin Oncol 2011; 29: 1963–70.

7. Malcovati L, Germing U, Kuendgen A et al. Time-dependent prognostic scoring system for predicting survival and leukemic evolution in myelodysplastic syndromes. J Clin. Oncol. 2007; 25 (23): 3503–3510.

8. Haferlach C, Bacher U, Haferlach T et al. The inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) is frequently accompanied by alterations of the RUNX1, KRAS and NRAS and NF1 genes and mediates adverse prognosis both in MDS and in AML: a study in 39 cases of MDS or AML. Leukemia 2011; 25: 874–7.

9. Haferlach T. The molecular pathology of myelodysplastic syndrome. Pathobiology 2018; 23: 1–6.

15.17 Myeloproliferative Neoplasien (MPN)

Torsten Haferlach

Unter dem Oberbegriff der chronischen myeloproliferativen Neoplasien (MPN) wurden im engeren Sinne bisher folgende Entitäten zusammengefasst:

• Polycythämia vera (PV).
• Essentielle Thrombozythämie (ET).
• Primäre Myelofibrose (PMF).
• Chronische myeloische Leukämie (CML).

Die neue WHO-Klassifikation von 2008 fügt diesen vier Entitäten jetzt noch hinzu /1/:

• Die chronische Eosinophilenleukämie (nicht genauer spezifiziert).
• Die chronische Neutrophilenleukämie und die Mastozytose.

Die MPN treten sporadisch auf, gehen somit auf erworbene und nicht auf angeborene klonale genetische Veränderungen zurück. In allen Fällen sind als Ausgangszellen pluripotente hämatopoetische Stammzellen anzunehmen.

Durch schrittweise Aufklärung eines klinisch, morphologisch, zytogenetisch und molekulargenetisch klar definierten Krankheitsbilds wurden zunächst speziell in der Diagnostik und der Therapie der CML und seit 2005 auch bei den JAK2-mutierten MPN neue Wege eröffnet /2, 3/.

Umso wichtiger ist zunächst eine Abgrenzung innerhalb der MPN und die Definition der BCR-ABL1 positiven CML auf Grund morphologischer, klinischer und insbesondere labordiagnostischer Befunde. Siehe:

• Tab. 15.17-1 – Charakteristika und orientierende Parameter bei Differentialdiagnose der MPN
• Tab. 15.17-2 – Methoden zum Diagnosezeitpunkt bei chronisch myeloproliferativen Neoplasien.

Es werden aber klinisch auch überlappende Merkmale und ineinander übergehende Erscheinungsformen der anderen MPN gesehen, da bei allen diesen JAK2-Mutationen beobachtet werden. Weiterhin ist bei der Diagnose und Differentialdiagnose der MPN neben der zytogenetischen und molekulargenetischen Diagnostik auch die Knochenmarkhistologie von großer Bedeutung. Siehe Abb. 15.15-2 – Ablauf und Standarddiagnostik der akuten lymphatischen Leukämie.

Mit Ausnahme der ET zeigen die MPN eine fast vollständige Verdrängung des Fettmarkes. Im Einzelnen gilt es in der Diagnostik der MPN die in Tab. 15.17-1 und Tab. 15.17-2 aufgeführten Aspekte zu berücksichtigen.

15.17.1 Chronische myeloische Leukämie

Innerhalb der Gruppe der MPN ist die chronische myeloische Leukämie (CML) zytogenetisch am besten untersucht. Das Vorliegen einer Philadelphia-Translokation grenzt sie eindeutig gegenüber allen anderen myeloproliferativen Erkrankungen ab. Bei Patienten mit CML gelang der überhaupt erste Nachweis einer tumorspezifischen Chromosomenveränderung durch Nowell und Hungerford bereits 1960 /4/. Sie entdeckten damals ein kleines Marker-Chromosom, das später den Namen Philadelphia-Chromosom erhielt. Nach Einführung der Bänderungstechniken in die Zytogenetik konnte das Philadelphia-Chromosom als verkürztes Chromosom 22 identifiziert werden. 1973 wurde gezeigt, dass die Verkürzung des Chromosoms 22 durch eine Translokation zwischen dem langen Arm von Chromosom 9 und dem langen Arm von Chromosom 22 zustande kommt: t(9;22)(q34; q11) /5/.

Die Entwicklung molekulargenetischer Verfahren erlaubte die Identifizierung der beteiligten Gene: ABL1 auf dem langen Arm von Chromosom 9 in der Chromosomenbande 9q34 und die sogenannte Breakpoint cluster region, BCR auf dem langen Arm von Chromosom 22 in der Chromosomenbande 22q11. Somit führt die Translokation t(9;22)(q34;q11) auf molekularer Ebene zur Bildung von zwei Leukämie spezifischen hybriden Genen: BCR-ABL1 auf dem derivativen Chromosom 22 und ABL1-BCR auf dem derivativen Chromosom 9. Das BCR-ABL1-Gen kodiert ein chimäres Protein, welches im Vergleich zum normalen ABL eine erhöhte Tyrosinkinase Aktivität aufweist; dieses spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der CML /6/. Konsequenterweise ist die Diagnose einer CML abhängig von dem klinischen Bild, von Blut- und KM-Befunden, verlangt aber auf jeden Fall auch den Nachweis des pathognomonischen BCR-ABL1-Fusionstranskripts. Dies gilt insbesondere nach Einführung der Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) /7/.

Die Patienten mit CML und einem zytogenetisch normalen Karyotyp (ca. 5 %) weisen sowohl in der Fluroeszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) als auch in der RT-PCR ein BCR-ABL1-Rearrangement auf. Mittels FISH an Metaphasen lässt sich das BCR-ABL1-Fusionsgen entweder auf dem Chromosom 22 oder seltener auf dem Chromosom 9 nachweisen. Diese Gruppe von CML wird als Philadelphia-negative, BCR-ABL1-positive CML bezeichnet, klinisch spielt dies keine Rolle. Es führt aber zu dem Hinweis, dass eine alleinige Chromosomenanalyse in der Diagnostik der CML nicht ausreicht.

Zytomorphologie und Histologie

Bei der CML finden sich von allen MPN die höchsten Leukozytosen (bis zu 700 × 10⁹/l). Es ist dabei eine Linksverschiebung bis hin zum Blasten (meist unter 5 %) sowohl im peripheren Blut als auch im Knochenmarkaspirat relativ spezifisch. Das Knochenmark zeigt bei hyperzellulärem Bild eine massive Zunahme der Granulopoese im Vergleich zur Erythropoese (bis zu einem Verhältnis von 20 : 1; normal: 3 : 1) Daneben findet sich eine Eosinophilie und insbesondere, relativ pathognomonisch, eine Basophilie. Bei allen MPN, speziell aber bei der CML, bestehen durch den vermehrten Zellumsatz im Knochenmark in vielen Fällen Glykolipid speichernde Zellen, sog. Pseudo-Gaucherzellen und meerblaue Histiozyten. Bei der CML besteht bei Diagnosestellung selten eine Fibrose des KM.

Die Diagnostik der CML bei Erstdiagnose und im Verlauf sollte sich nach bestimmten Algorithmen ausrichten, die dann die Therapie steuern /8/. Generell gelten bei Primärdiagnose die zytomorphologische Untersuchung von Blut und KM sowie eine Histologie des KM als obligat. Weiterhin erforderlich sind die Chromosomenanalyse (am besten aus KM), eine FISH- und eine PCR-Analyse auf BCR-ABL1. Die PCR kann quantitativ erfolgen und dient bei gutem Therapieansprechen als sensitivster Verlaufsmarker mittels quantitativer PCR. Im weiteren Verlauf sind zunächst alle 3 Monate Untersuchungen anzuraten. Eine klassische Zytogenetik sollte auch später noch einmal pro Jahr erfolgen. Der Grund ist, dass unter den Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI), wie selten auch unter Interferon-Therapie schon früher gesehen, Philadelphia-unabhängige zytogenetische Veränderungen wie eine Trisomie 8 oder eine Monosomie 7 auftreten /9/. Deren Bedeutung und Einfluss auf den Krankheitsverlauf ist offen, wird aber noch weiter genau validiert.

Weiterhin werden TKI-Resistenzen durch Mutation im Bereich des Wirkorts der Substanzen beobachtet. Bei einem Verdacht ist eine Mutationsanalyse durchzuführen, da dieses Ergebnis eine angepasste Therapie ermöglicht.

Nach allogener Knochenmarktransplantation ist ein erneuter Nachweis des BCR-ABL1-Fusionstranskriptes mittels quantitativer PCR, die das Auftreten eines Rezidivs voraussagt, von klinischer Relevanz.

Phasen der CML bezogen auf den klinischen Verlauf

Durch Einsatz verschiedener Therapiemodalitäten, TKI, Interferon und die allogene Transplantation, sind die Szenarien der klinischen Verläufe der CML im Vergleich zu früheren Situationen verändert. Das Überleben der Patienten deutlich verlängert. Trotzdem ist es weiter sinnvoll, sich aus klinisch-morphologischer Sicht die drei Stadien der CML als Orientierung (Tab. 15.17-3 – WHO-Klassifikation der CML auf der Basis der morphologischen Befunde) /1/.

Diese Einteilung ist auch in der neuen WHO-Klassifikation beibehalten worden und gestattet eine klare Zuordnung des Patienten. Dies darf aber nie allein zu therapeutischen Konsequenzen Anlass geben. Vielmehr sind zur richtigen Diagnose und insbesondere Therapiesteuerung bei Patienten mit CML nach festem Algorithmus die klassische Zytogenetik, FISH, PCR und quantitative PCR sowie auch Mutationsanalysen nach internationalen Empfehlungen durchzuführen /8/.

15.17.2 Polycythämia vera (PV)

Zytomorphologie und Histologie

Im Blutbild findet sich bei der PV eine deutliche Erhöhung des Hämatokrits auf über 50 %, der Hämoglobinwert beträgt 16–22 g/dl, eine mäßige Leukozytose und Thrombozytose wird beobachtet. Die Knochenmarkzytologie bei der PV zeigt bei hyperzellulären Verhältnissen ebenso eine gleichmäßige Vermehrung aller drei Zellreihen. In der Eisenfärbung fehlt Speichereisen, das in die vielen Erythrozyten eingebaut ist.

Histologisch sieht man eine erhöhte Megakaryozytenzahl mit Riesenformen und Haufenbildung, sowie eine gesteigerte Granulozytopoese und Erythropoese mit fehlendem Speichereisen, eine Hyperplasie des Sinussystems und eine unterschiedlich starke Fibrosierung sowie Osteopenie. Nur in 10 % der Fälle zeigt die PV einen normal imponierenden Knochenmarkbefund. Die diagnostischen Kriterien sind aufgeführt in Tab. 15.17-4 – Diagnosekriterien der Polycythemia vera.

Die Diagnose PV darf aber nicht mehr ohne molekulare Analysen auf JAK2 V617F-Mutationen gestellt werden (in 95 % der PV mutiert), eine reaktive Polyglobulie kann damit in fast allen Fällen ausgeschlossen werden (Tab. 15.17-4 und Tab. 15.15-2 – Frühere FAB-Klassifikation der AML) /1, 2, 3/. Patienten mit einer reinen Polyglobulie zeigen bisweilen eine JAK2-Mutation im Exon 12 /10/. Differentialdiagnostisch müssen trotzdem weiterhin für die JAK2 nicht mutierten Patienten eine Hypoxie auf Grund kardialer oder pulmonaler Ursache, Erythropoetin-produzierende Tumore, erhöhte Androgene oder auch eine Hyperplasie der roten Reihe durch Nikotinabusus ausgeschlossen werden. De facto ist zur Diagnose der PV eine Knochenmarkpunktion allerdings nicht mehr obligat nötig, da die Kriterien zumeist auch aus peripherem Blut untersucht werden können.

Allerdings wird nach der WHO-Klassifikation auch die Durchführung einer Zytogenetik bei der PV empfohlen. Die Inzidenz der Aberration von Chromosomen steigt mit der Fortdauer der Erkrankung an. Sie ist höher bei Patienten, die eine myelosuppressive Therapie erhalten. Hier lässt sich jedoch nicht sicher sagen, ob dieses einen Einfluss der Therapie reflektiert oder lediglich damit im Zusammenhang steht, dass Patienten mit progressiver Erkrankung häufiger myelosuppressiv behandelt werden. Die Transformation der Erkrankung in ein MDS oder eine AML ist ebenfalls mit einer erhöhten Rate an Karyotyp Veränderungen assoziiert. Insgesamt scheint somit der Nachweis von Chromosomenaberrationen mit einer ungünstigen Prognose assoziiert zu sein.

15.17.3 Primäre Myelofibrose (PMF)

Zytomorphologie und Histologie

Die PMF zeigt im peripheren Blut uncharakteristische Befunde, zumeist eine Anämie mit Retikulozytose sowie bei funktioneller Splenektomie Jolly-Körperchen und Tear drop Formen der Erythozyten. Bei starker KM-Fibrose mit extramedullärer Blutbildung kommen auch Normoblasten im peripheren Blut vor. Die Zahl der Leukozyten und Thrombozyten zeigt keine eindeutige Richtung an, nicht selten liegen eher niedrige als normale oder gar erhöhte Werte zum Zeitpunkt der Diagnose vor. Auf Grund einer Funktionsstörung der Thrombozyten ist die Blutungszeit bisweilen verlängert.

Bei der PMF ist die Zytologie des Knochenmarks häufig wegen der starken Faservermehrung und der dadurch bedingten Punctio sicca nicht auswertbar. Wenn diese trotzdem neben der Histologie, die obligat ist, erzwungen werden soll, kann versucht werden, Abrollpräparate einer Stanze zu machen.

Das histologische Bild zeigt eine unterschiedlich starke Fibrose (MF 0–3) mit fakultativem Auftreten der Neubildung von Geflechtknochen, entzündlichen Markveränderungen mit Lymphozyteninfiltraten, Erythrozytenextravasaten, Plasmozytose und entzündlichen Gefäßveränderungen mit weiten Sinusoiden, eine Wandsklerose und intra sinusoidal gelegene Hämatopoese. Außerdem finden sich Haufen atypischer Megakaryozyten und eine megaloblastoide Erythropoese. Blasten sind bei Diagnose meist nicht vermehrt. Im Verlauf der Erkrankung nehmen die Zytopenien zu, die Splenomegalie kann immense Maße annehmen, der Übergang in eine akute Leukämie wird beobachtet.

Zytogenetisch ist bei Patienten mit PMF der Stückverlust im langen Arm von Chromosom 20 (20q-) die häufigste Chromosomenaberration. Diese wird, wie Deletionen im langen Arm von Chromosom 13, bei 6–7 % der Patienten beobachtet. Als weitere Veränderungen des Karyotyps werden numerische Veränderungen der Chromosomen 7, 8 und 9 sowie strukturelle Aberrationen von 1q und 5q beschrieben /1/. Die Durchführung einer Chromosomen Analyse wird empfohlen, bei Punctio sicca kann auch eine Stanze in physiologischer NaCl Lösung mit etwas Heparin zur weiteren Analyse prozessiert werden.

Daneben sind molekulare Marker zwingend zu bestimmen, an erster Stelle JAK2 und MPLW515 (Tab. 15.17-5 – Diagnosekriterien der Primären Myelofibrose). Neuere gezielte Therapien stehen seit kurzem zur Verfügung /11/.

15.17.4 Essentielle Thrombozythämie (ET)

Zytomorphologie und Histologie

Der Leitbefund bei der ET ist die ausgeprägte Thrombozytose, die bis zu 5 × 10¹⁰/l erreichen kann. Nach WHO sind ≥ 450 × 10⁹/l gefordert (Tab. 15.17-6 – Diagnosekriterien der essentiellen Thrombozythämie). Im Ausstrich sind häufig Riesenthrombozyten und Thrombozyten-Aggregate zu sehen. Die Blutungszeit kann normal oder verkürzt, allerdings wegen funktionaler Störungen der Thrombozyten auch verlängert sein. Aus den Thrombozyten wird Kalium freigesetzt, was zu einer Hyperkaliämie führt. Die ET zeigt im KM zytomorphologisch und histologisch bei normaler Granulopoese und Erythropoese diagnoseführend Megakaryozytenhaufen, die sich häufig um die zentral-intermediär gelegenen Sinus finden. Die Diagnose ET ist bisweilen eine Ausschlussdiagnose. Auch sie verlangt einen Stufenalgorithmus der molekularen Diagnostik (Tabb. 15.15-2 – Frühere FAB-Klassifikation der AML).

Nur ca. 5 % der Patienten mit ET weisen klonale Karyotyp-Anomalien auf. Am häufigsten wird bei diesen der Zugewinn eines Chromosoms 9 beobachtet. Die Durchführung einer vollständigen Chromosomen Analyse erscheint deshalb nicht obligat, aber im Rahmen der Erstdiagnose bei Verdacht auf ein MPN sinnvoll.

15.17.5 Chronische Eosinophilenleukämie (CEL), nicht anders spezifiziert

Nach der WHO-Klassifikation 2008 ist in dem Kapitel der MPN auch die chronische Eosinophilenleukämie (nicht anders spezifiziert) aufgeführt. Diese ist hier eingeordnet, weil im Gegensatz dazu die Erkrankungen mit Eosinophilie und Nachweis von molekularen Veränderungen an den Genen FIP1L1-PDGFRA, FGFR1, oder PDGFRA und PDGFRB ein Extrakapitel einnehmen /1, 12/. So bleibt nach Ausschluss der molekularen Veränderungen oder auch spezifischer zytogenetischer Befunde diese nicht genauer einzuordnende CEL als Teil des MPN-Kapitels übrig. Diese hat Definitions gemäß eine Eosinophilie im Blut (1,5 × 10⁹/l), weniger als 20 % Blasten und zeigt keine Veränderungen der Chromosomen.

15.17.6 Mastozytose

In der WHO-Klassifikation von 2008 sind auch die Mastozytosen in dem Kapitel zu den MPN aufgeführt. Es werden unterschieden: Die kutane Mastozyose (CM), die indolente systemische Mastozytose (ISM), die systemische Mastozytose mit klonaler hämatologischer Erkrankung von einer Zellsorte außerhalb der Mastzellen (SM-AHNMD), die aggressive systemische Mastozytose (ASM), die Mastzellleukämie (MCL), das Mastzellsarkom (MCS) und die extrakutane Mastozytose.

Im Detail wird nicht auf die aufwendigen Diagnosekriterien für die einzelnen Subgruppen genauer eingegangen /13/. Es sind u.a. verschiedene Untersuchungen in der Dermatologie ebenso nötig wie Laborparameter (z.B. die Messung der Tryptase im Serum), Immunphänotypisierung bzw. Histologie und Immunhistologie gehören dazu. Weiterhin sind Genmutationen zu untersuchen wie die Analyse auf KIT (meist D816V)-Mutationen.

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15.18 Immunphänotypisierung von akuten Leukämien und Non-Hodgkin-Lymphomen

Richard Schabath, Wolf-Dieter Ludwig

Die Diagnose und Klassifikation der akuten Leukämien (AL) und der Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) orientiert sich an der Klassifikation der World Health Organization (WHO) von Tumoren hämatopoetischer und lymphatischer Gewebe /1/. In dieser werden akute myeloische Leukämien (AML) und akute lymphatische Leukämien (ALL) der Vorläufer B- bzw. Vorläufer-T-Zellen von reifen B-, T- und NK-Zell-Neoplasien abgegrenzt. Bei der differentialdiagnostischen Unterscheidung der Subtypen der AL bzw. NHL werden morphologische bzw. histologische Merkmale, Immunphänotyp und Genotyp berücksichtigt. Die häufig parallel durchgeführte Analyse dieser zellbiologischen Merkmale von Tumorzellen hat die Erkennung neuer Subtypen bzw. Entitäten, deren klinisches Erscheinungsbild und therapeutische Beeinflussbarkeit differieren, wesentlich erleichtert. Auch konnte anhand der Charakterisierung genetischer Veränderungen in Leukämie-/Lymphomzellen das Verständnis der für die Leukämo- bzw. Lymphomgenese pathogenetisch relevanten Mechanismen verbessert werden /2, 3, 4, 5/.

Die Immunphänotypisierung im Knochenmark (KM) und/oder peripheren Blut ist ein unverzichtbarer Bestandteil in der initialen Diagnostik und im Verlauf der AL und der leukämisch verlaufenden NHL. Sie basiert auf dem Nachweis verschiedener Antigene mittels monoklonaler Antikörper, die von Vorläufer- und/oder reifen Zellen der Myelo- bzw. Lymphopoese, häufig abhängig von deren Reifegrad, exprimiert werden /1, 4, 6, 7, 8/. Die Bindung der monoklonalen Antikörper an membranständige bzw. intrazelluläre Antigene kann mit Hilfe verschiedener Methoden analysiert werden. Dabei gelten die Markierung von Zellsuspensionen mit Techniken der Immunfluoreszenz und deren Auswertung mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie sowie immunenzymatische Färbungen als Routinemethoden /8, 9, 10, 11, 12, 40/.

Die Vorteile der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung sind:

• Schnelle Analyse des Probenansatzes trotz hoher Zellzahlen (über 10⁶ Zellen in einem Ansatz).
• Hohe Nachweisempfindlichkeit.
• Simultane Auswertung verschiedener Parameter wie 2–10 Fluoreszenzen und Streulichteigenschaften der Zellen.
• Exakte Quantifizierung der Ergebnisse.
• Statistische Datenauswertung.

Zu Empfehlungen, Indikationen, Standardisierung und Qualitätssicherung der Immunphänotypisierung bei AL und NHL mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie bzw. immunenzymatischer Verfahren siehe Beitrag 52.2 – Durchflusszytometrie in der klinischen Labordiagnostik und Lit. /4, 7, 9, 10, 11, 40/.

15.18.1 Immunologische Klassifikation der akuten Leukämien

Wesentliche Ziele der Immunphänotypisierung der akuten Leukämien (AL) sind:

• Morphologisch und zytochemisch undifferenzierte Leukämien der B-, T-lymphatischen, NK- bzw. myeloischen Zellreihe zuzuordnen sowie den Reifegrad der Leukämiezellen festzulegen.
• Biologisch und/oder prognostisch relevante Subtypen zu erkennen und in standardisierter, studiengerechter Weise zu diagnostizieren.
• Expression von Proteinen nachzuweisen, die bei der Regulation zellbiologisch wichtiger Funktionen, z.B. Adhäsion, Proliferation, Differenzierung, Apoptose, beteiligt sind.
• Detektion von Zielstrukturen für eine zielgerichtete Therapie (Targeted therapy z.B. mittels monoklonalen Antikörpern gegen CD20, CD33 oder CD52).
• Die Behandlung nicht eliminierter residualer Leukämiezellen (Minimal residual disease, MRD) durch deren Identifikation zu ermöglichen.

Abb. 15.18-1 – Flussdiagramm zur Immunphänotypisierung bei akuten Leukämien zeigt das stufenweise Vorgehen in der immunologischen Zuordnung der AL /4, 20/.

Ausgehend von der morphologischen Diagnose akute Leukämie (AL), die immer auf der lichtmikroskopischen Auswertung panoptisch gefärbter Ausstrichpräparate beruht, erfolgt eine eindeutige Diagnose und Definition des Subtyps durch Linienzuordnung der Leukämieblasten und Festlegung des immunologischen Subtyps und Reifegrads der AL.

Linienzuordnung der Leukämieblasten

Die Linienzuordnung der Leukämieblasten geschieht anhand des Nachweises von membranständigen (m) bzw. intrazytoplasmatischen (cy) Antigenen, die von unreifen lymphatischen oder myeloischen Vorläuferzellen exprimiert werden. Besonders bedeutsam für die Diagnostik der AL sind im Zytoplasma lokalisierte Antigene, die linienspezifisch bereits in sehr unreifen Zellen exprimiert werden /13, 14/, z.B.:

• CD13, CD33, Myeloperoxidase (MPO) und Lysozym in myeloischen Zellen.
• CD19, cyCD22 und cyCD79a in B-lymphatischen Vorläuferzellen.
• cyCD3 in T-lymphatischen Vorläuferzellen.

Diese Antigene, deren Nachweis immunenzymatisch oder nach Fixierung und Permeabilisierung von Leukämiezell-Suspensionen auch mittels Durchflusszytometrie erfolgen kann /14/, werden teilweise von reiferen Leukämie- bzw. Lymphomzellen auch membranständig exprimiert (CD3, CD22, CD79a).

Festlegung des immunologischen Subtyps und Reifegrades

Die Festlegung des immunologischen Subtyps und Reifegrads der AL mittels monoklonaler Antikörper gegen Antigene, deren Expression auf unreife lympho- hämatopoetische Vorläuferzellen beschränkt oder mit unterschiedlichen Differenzierungsstufen der Lympho- oder Myelopoese assoziiert ist.

Anhand des Expressionsmusters werden die für die Immunphänotypisierung der AL wichtigen Antigene unterteilt in:

• Linienspezifische Merkmale, z.B. MPO für die myeloische Zellreihe; cy/m Immunglobuline, CD22, CD79a für die B- sowie T-Zell-Rezeptor α/β bzw. γ/δ; CD3 für die T-Zellreihe.
• Panmyeloische Antigene, z.B. CD13, CD33, CD65.
• Pan-B-, z.B. CD19, CD22, CD79a.
• Pan-T-Antigene, z.B. CD3, CD2, CD5, CD7.
• Linienassoziierte Antigene, z.B. CD14 für monozytäre, CD15 für granulozytäre, CD235a (Glykophorin A) für erythrozytäre und CD41 oder CD61 für megakaryozytäre Zellen.
• Progenitorzell assoziierte Antigene, wie CD10, CD34, CD117, HLA-DR, terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT).

Die Analyse der aufgelisteten Antigene ermöglicht in fast allen Fällen der AL eine eindeutige Linienzuordnung und Definition des Subtyps /20/. Siehe Abb. 15.18-1 – Flussdiagramm zur Immunphänotypisierung bei akuten Leukämien.

Das vom Kompetenznetz Akute und chronische Leukämien empfohlene Basispanel für die initiale Diagnostik bei AL ist gezeigt in Tabelle 15.18-1 – Vom Kompetenznetz Akute und chronische Leukämien empfohlenes Basispanel für die initiale Diagnostik bei akuten Leukämien Morphologisch bzw. zytochemisch AUL, bei denen mittels der Immunphänotypisierung nicht mehr als ein Antigen der myeloischen bzw. B- oder T-lymphatischen Zellreihe nachweisbar ist, werden nur noch sehr selten (unter 1 % aller AL) diagnostiziert /1, 16, 17/. AUL, früher morphologisch auch als akute Stammzell-Leukämie bezeichnet, exprimieren ausschließlich Progenitorzell-assoziierte Antigene (CD34, CD38, CD117, HLA-DR, TdT).

Die für das therapeutische Vorgehen wichtige, endgültige Zuordnung der AUL erfordert zusätzliche Analysen wie z.B. den ultrastrukturellen Nachweis von MPO bzw. Plättchenperoxidase /18, 19/ oder von zyto- oder molekulargenetischen Anomalien /1, 4/, die für AML bzw. ALL charakteristisch sind. Diese aufwendigen Analysen werden jedoch im Rahmen der initialen Leukämiediagnostik nicht regelmäßig durchgeführt.

15.18.1.1 Immunphänotypisierung der ALL

Die Identifizierung und Zuordnung der ALL zur B- oder T-Zellreihe ist anhand der in lymphatischen Vorläuferzellen zunächst intrazytoplasmatisch exprimierten Antigene cyCD3, cyCD22, cyCD79a /14, 20, 21/ sowie der membranständigen Antigene CD7 und CD19 leicht möglich. Diese Antigene können in unreifen B- oder T-Vorläuferzellen und in über 99 % der korrespondierenden immunologischen Subtypen der ALL nachgewiesen werden.

Für die Erkennung unreifer Subtypen der T-ALL ist die gleichzeitige Analyse von CD7 und cyCD3 wichtig, da etwa 10–20 % der unreifen AML CD7 exprimieren /4/, cyCD3 jedoch als spezifisches Merkmal der T-Zellreihe gilt /13/.

Die genaue Charakterisierung des immunologischen Subtyps bzw. Festlegung des Reifegrads der ALL erfolgt anhand der Analyse zusätzlicher genannter B- und T-Zell-assoziierter Antigene und erlaubt die Unterscheidung, in folgender Untergruppen /4, 21/:

• B-Vorläuferzell-ALL.
• B-ALL/Burkitt Lymphom.
• T-Vorläuferzell-ALL.

Siehe auch Abb. 15.18-1 – Flussdiagramm zur Immunphänotypisierung bei akuten Leukämien.

Tab. 15.18-2 – Terminologie, Häufigkeit und Phänotyp der immunologischen Subtypen der ALL verdeutlicht basierend auf den Vorschlägen der „European Group for the Immunological Characterization of Leukemias“ (EGIL) /20/ die Terminologie und Antigenexpression innerhalb der verschiedenen ALL-Subtypen sowie deren Häufigkeit bei Erwachsenen und Kindern /4, 21/.

Bei 5–40 % der Patienten mit ALL zeigen die Blasten eine Koexpression myeloischer Antigene (My+ ALL), die insbesondere mit unreifen Subtypen (pro-B-ALL, pro- bzw. prä-T-ALL) assoziiert ist /26/.

Wichtig für die Definition von Risikogruppen und Zuordnung zu den verschiedenen Therapieformen der deutschen multizentrischen ALL-Therapiestudien bei Kindern (ALL-BFM) bzw. Erwachsenen (GMALL) ist die Abgrenzung folgender Subtypen:

• Pro-B-ALL (Hochrisiko-Therapie in der GMALL-Studie).
• B-ALL (eigenes Protokoll in den GMALL- bzw. ALL-BFM-Studien).
• T-Vorläuferzell-ALL (Subtypen, siehe Tab. 15.18-2, werden unterschiedlich behandelt).

15.18.1.2 Immunphänotypisierung der AML

Die Immunphänotypisierung hat bei der AML nicht den Stellenwert wie bei der ALL erlangt.

Für die Klassifikationen ist die Immunphänotypisierung erforderlich hauptsächlich für die Erkennung der:

• AML mit minimaler myeloischer Differenzierung, M0-Subtyp: MPO zytochemisch negativ, Expression panmyeloischer Antigene und/oder Nachweis von MPO mittels mAk bei Negativität von linienspezifischen B- oder T-Zell-Merkmalen /19/.
• Akuten Megakaryoblastenleukämie, M7-Subtyp: Membranständige, selten nur intrazytoplasmatische Expression von CD41 und/oder CD61 /18/.

Bei etwa 75–90 % aller Patienten mit AML exprimieren Leukämiezellen die Antigene CD13, CD33 und CD65, wobei alle drei panmyeloischen Marker nur in etwa 55 %, zumindest eines dieser Antigene jedoch in über 98 % der Fälle nachweisbar ist /22/. MPO kann mittels monoklonaler Antikörper in knapp 90 % der AML nachgewiesen werden. Zusätzlich hat sich CD117, der Rezeptor für den Stammzellfaktor (c-kit Protoonkogen), der von 1–4 % normaler KM-Zellen, etwa 60–70 % der AML, jedoch nur selten von unreifen ALL exprimiert wird, als wertvoller Marker für die immunologische Charakterisierung der AML erwiesen /23/.

Durch die gleichzeitige Analyse dieser Antigene und Verwendung monoklonaler Antikörper gegen erythroide, z.B. Glykophorin A, Plättchen-assoziierte Antigene, z.B. CD41, CD61, sowie MPO können nahezu 100 % der AML anhand immunologischer Zellmarker identifiziert und eindeutig von der ALL abgegrenzt werden. Für die Unterscheidung zwischen AML und ALL ist der Nachweis von TdT von geringer Bedeutung, da 10–40 % der AML, abhängig von der verwendeten Methode (Immunfluoreszenz bzw. Immunzytochemie), das früher als lymphatischen Marker geltende Enzym TdT intranukleär exprimieren.

Eine Unterscheidung unreifer myeloischer von granulozytär differenzierten Leukämien ist mit Hilfe des kombinierten intra zytoplasmatischen Nachweises von MPO und Lactoferrin (LF) möglich, wobei undifferenzierte myeloische Zellen MPO-positiv und LF-negativ sind, während granulozytär differenzierte Leukämiezellen MPO und LF exprimieren /14/.

Auf Grund des Fehlens von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit Monoblasten reagieren, kann eine immunologische Unterscheidung unreifer monoblastärer Leukämien (FAB-M5a) von anderen Subtypen unreifer AML, z.B. FAB-M0/M1, in der Regel nicht erfolgen.

Auch bei der AML kommt es wie bei der ALL zur aberranten Expression lymphatischer Marker auf Blasten. Bei 10–25 % der Patienten lässt sich eine Koexpression von T-lymphatischen Antigenen, insbesondere CD4, CD7 und/oder CD2 nachweisen, während B-lymphatische Antigene einschließlich CD10 nur selten (unter 10 %) exprimiert werden /25/.

Eine Korrelation des Immunphänotyps mit morphologisch bzw. zytochemisch definierten FAB-Subtypen sowie den zytogenetisch und molekularbiologisch definierten WHO-Subgruppen der AML ist wegen der Heterogenität der Antigenexpression bei AML mit Ausnahme des FAB-M0 bzw. FAB-M7-Subtyps nicht sicher möglich und kann auf den AML Subtyp nur einen ersten Hinweis geben, bis Ergebnisse von Zytogenetik und Molekularbiologie vorliegen (Tab. 15.18-3 – Korrelation von FAB-Klassifikation, Zytogenetik und Immunphänotyp) /22, 24/.

15.18.1.3 AL mit gemischtem Immunphänotyp (Mixed phenotype acute leukemia, MPAL)

Subtypen der AL, bei denen die pathologische Population der Blasten gleichzeitig myeloische und lymphatische Antigene exprimiert (aberrante Antigenexpression), werden zunehmend häufiger diagnostiziert (bis 5 % aller AL) und wurden zunächst als biphänotypische akute Leukämien (BAL) klassifiziert /20, 36/.

Eine international akzeptierte Nomenklatur für diese heterogene Untergruppe der AL existiert seit der WHO-Klassifikation von 2008 /1/. Der in Tab. 15.18-4 – Score für die Definition der „Mixed phenotype acute leukemia“ dargestellte Score für die immunologische Klassifikation der MPAL basiert auf dieser Klassifikation und löste die Empfehlungen der EGIL /20/ ab. Für die Prognose und Therapie der MPAL ist jedoch nicht der Immunphänotyp sondern vor allem die zugrundeliegende zytogenetische oder molekularbiologische Aberration entscheidend /36, 37/.

15.18.1.4 Nachweis residualer Leukämiezellen bei AL mittels Immunphänotypisierung

Der Nachweis residualer Leukämiezellen im Verlauf und nach Abschluss der initialen Chemotherapie bei AL hat Bedeutung für die weitere Therapieplanung und prognostische Einschätzung der Erkrankung erlangt. Die Beurteilung der Remission bei AL beruhte bisher auf der morphologischen Beurteilung von Knochenmark. Auf Grund der geringen Sensitivität der Morphologie (Nachweisgrenze: 10^–2, d.h. eine Leukämiezelle auf 100 normale Zellen) werden zur Suche nach minimaler Resterkrankung (Minimal residual disease, MRD) sensitivere Methoden wie die Immunphänotypisierung (Sensitivität 10^–3–10^–5) und molekulargenetische Analysen (Sensitivität der Polymeraseketten-Reaktion 10^–4–10^–5) eingesetzt /7, 27, 28, 38/.

Der immunphänotypische Nachweis residualer Zellen einer Leukämie beruht auf der Expression Leukämie-assoziierter Immunphänotypen (LAIP), die mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie im überwiegenden Prozentsatz der AL dargestellt werden können. Als wichtige Parameter für die Unterscheidung zwischen leukämischen und normalen Vorläuferzellen gelten:

• Aberrante oder asynchrone Antigenexpression.
• Fehlende Expression von Differenzierungsantigenen.
• Veränderte Antigendichte auf Leukämiezellen.

Als Vorteile des immunphänotypischen Nachweises von Minimal residual disease mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie gelten neben der Geschwindigkeit der Untersuchung die Möglichkeit, die Zahl der residualen Leukämiezellen zu quantifizieren und deren Vitalität zu bestimmen.

Wichtige Voraussetzung für die immunphänotypische Identifizierung residualer Leukämiezellen ist eine genaue Charakterisierung der leukämischen Blasten zum Zeitpunkt der Diagnose. Das erfolgt anhand von multiparametrischer Durchflusszytometrie, mit der neben den Streulichteigenschaften auch die Expression von 3–10 Antigenen pro Zelle gleichzeitig beurteilt werden können. Ein- oder Zweifarbenanalysen von leukämischen Zellen sind nicht ausreichend für die Charakterisierung Leukämie-spezifischer Merkmale und sollten daher nicht mehr zum Nachweis von Minimal residual disease herangezogen werden.

Beispiele für geeignete Antigenkombinationen zum Nachweis von Minimal residual disease bei Patienten mit AL und Angaben zur Häufigkeit des Auftretens verschiedener aberranter bzw. asynchroner Phänotypen in den Leukämiesubtypen sind aufgezeigt in Tab. 15.18-5 – Antigenkombinationen für den Nachweis von Minimal Residual Disease bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie. Anhand des Nachweises dieser Kombinationenvon Antigenen ist es möglich, residuale Leukämiezellen innerhalb von 10.000 normalen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu erkennen (Sensitivität 10^–4).

Für die ALL konnte in mehreren, z.T. multizentrischen, prospektiven Studien die klinische Bedeutung des immunphänotypischen bzw. molekularbiologischen Nachweises residualer Leukämiezellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Behandlung gezeigt werden /27, 38/. Auch bei der AML liegen inzwischen genügend klinische Daten vor, die den routinemäßigen Einsatz des Nachweises von MRD mittels Immunphänotypisierung rechtfertigen /28/. Jedoch konkurriert hier bei der Detektion der Minimal residual disease die Durchflusszytometrie stark mit der bereits länger etablierten Molekularbiologie (quantitative PCR, etc.).

15.18.1.5 Immunphänotypisierung der NHL

Auch für die Diagnostik der leukämisch verlaufenden NHL spielt die Immunphänotypisierung eine entscheidende Rolle. Neben der Unterscheidung der reifen lymphatischen Neoplasien von AL hat sie folgende Ziele:

• Zuordnung der malignen Zellen zur B-, T- bzw. NK-Zellreihe.
• Nachweis oder Ausschluss der Klonalität maligner B-Zellen anhand einer Kappa- oder Lambda-Leichtkettenrestriktion.
• Abgrenzung reifer lymphatischer Neoplasien, insbesondere reifer T-Zell Neoplasien, von reaktiv bedingten Zuständen, z.B. EBV-, Cytomegalievirus-Infektion oder Toxoplasmose.
• Überwachung des Therapieansprechens (Chemotherapie, monoklonale Antikörper) durch frühzeitige Identifizierung residualer Leukämie- bzw. Lymphomzellen.

Die Zuordnung der reifen B-, T- und NK-Zell-Neoplasien zur entsprechenden Zellreihe bzw. einem bestimmten Reifestadium basiert auf einem Panel verschiedener monoklonaler Antikörper, dessen Zusammensetzung wesentlich von der Fragestellung, z.B. initiale Diagnostik oder Nachweis von Minimal residual disease, beeinflusst wird /7/. Die in Tab. 15.18-6 – Immunologisches Marker-Profil normaler B-Zellen und chronischer lymphoproliferativer Erkrankungen vom B-Zelltyp und Tab. 15.18-7 – Immunologisches Marker-Profil normaler T-Zellen und lymphoproliferativer Erkrankungen vom T-Zelltyp dargestellten immunphänotypischen Expressionsprofile normaler B- und T-Zellen bzw. reifer B-, T- und NK-Zell-Neoplasien treffen nicht in jedem Fall zu. Es gibt gelegentlich Überschneidungen im Immunphänotyp bei verschiedenen Subtypen, die eine endgültige Zuordnung nur in Zusammenhang mit weiteren Befunden der Klinik, Morphologie bzw. Histologie, Genotyp erlaubt /1, 7, 11, 29, 30, 31/.

Für die Abgrenzung der chronischen lymphatischen Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) von anderen reifen B-Zell-Neoplasien wurden Scores vorgeschlagen, die anhand eines charakteristischen Expressionsprofils membranständiger Antigene die Genauigkeit in der Unterscheidung zwischen B-CLL und anderen reifen B-Zell-Neoplasien wesentlich verbessern konnten. Durch die Analyse von fünf Antigenen, die auf Leukämiezellen bei B-CLL nicht (CD 79b, FMC7), schwach (membranständige Immunglobuline) oder deutlich (CD5, CD23) exprimiert werden, können in 90–95 % der Fälle typische B-CLL von anderen reifen B-Zell-Neoplasien abgegrenzt werden /31/. Ein weiterer nützlicher Marker ist hier CD200, der von Zellen der B-CLL meist exprimiert wird, während Mantelzell-Lymphome, die als CD5 positive NHL in der Abgrenzung zur B-CLL problematisch sein können, CD200 negativ sind /39/.

Untersuchungen zu Mutationen in den variablen Anteilen der Immunglobulin-Schwerkettengene (IgVH) haben zur Erkennung von zwei unterschiedlichen zellbiologischen Subtypen der B-CLL geführt, die sich hinsichtlich klinischem Verlauf, Immunphänotyp sowie zyto- bzw. molekulargenetischen Befunden eindeutig unterscheiden /32/. Membranständige (CD38) bzw. intrazytoplasmatische Antigene (ZAP-70) werden von diesen beiden Subtypen unterschiedlich exprimiert und deshalb zunehmend als diagnostische bzw. prognostische Parameter verwendet. Positivität von CD38 oder ZAP-70 in B-CLL-Zellen korrelieren meistens mit dem Fehlen von Mutationen der Gene IgVH und einem ungünstigen klinischen Verlauf /33, 34/.

Auch bei reifen B-Zell-Neoplasien ermöglicht die Immunphänotypisierung mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie einen sehr empfindlichen Nachweis (Sensitivität 10^–4) residualer Leukämiezellen /35/.

Trotz zunehmend genauer Kenntnisse des Immunphänotyps reifer B-, T- und NK-Zell-Neoplasien sowie methodischer Weiterentwicklungen, wie z.B. der multiparametrischen Durchflusszytometrie, ist häufig anhand der Immunphänotypisierung im KM oder peripheren Blut bei leukämisch verlaufenden reifen lymphatischen Neoplasien eine eindeutige Zuordnung zu den in der WHO-Klassifikation definierten Entitäten nicht möglich /1/. Weiterführende diagnostische Maßnahmen, z.B. KM- bzw. Lymphknotenhistologie, zyto- bzw. molekulargenetische Analysen, sind deshalb für die endgültige Klassifikation und prognostische Einschätzung der Erkrankung meistens erforderlich.

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