Immungenetik: Klinische und diagnostische Aspekte des Humanen-Leukozyten-Antigen (HLA)-Systems

26 Immungenetik: Klinische und diagnostische Aspekte des Humanen-Leukozyten-Antigen (HLA)-Systems

Christian Seidl, Erhard Seifried

26.1 Genetische Grundlage und Immunologische Funktion des HLA-Systems

Das HLA-System (HLA, Human leukocyte antigen) entspricht dem Haupthistokompatibilitätskomplex (Major histocompatibility complex, MHC) des Menschen und umfasst eine Gruppe von Genen, die wesentlichen Einfluss in der immunologischen Erkennung zwischen körperfremd und körpereigen nehmen. Erste Beschreibungen dieses Merkmalsystem gehen auf Untersuchungen von Peter Gorer und George Schnell Ende der 30er Jahre zurück, die in der Maus (H-2-System) bereits die Bedeutung dieses Merkmalsystem für die Transplantationsmedizin erkannten /1, 2/.

Das erste humane Merkmal, als „Mac“ bezeichnet, wurde 1958 von Jean Dausset mit Hilfe von Seren polytransfundierter Personen beschrieben und entspricht dem heutigen Merkmal HLA-A2 /3/. Weitere Merkmale wurde in der Folge von Jon van Rood (4a und 4b, entsprechen Bw4 und Bw6) gefunden.

Schon früh wurde erkannt, dass das HLA-System durch eine besondere Vielgestaltigkeit der Antigene gekennzeichnet ist, sodass bereits 1964 in Durham (USA) der erste internationale Workshop ausgerichtet wurde, an dem zahlreiche Laboratorien aus aller Welt mit einheitlichen Seren oder Zellproben unterschiedliche Aspekte des HLA-Systems untersuchten. Die Ergebnisse dieser inzwischen 13 internationalen Workshops werden in speziellen Buchbänden veröffentlicht und bilden eine wichtige Grundlage für standardisierte Untersuchungsverfahren zur Bestimmung der HLA-Merkmale und die Definition von klinisch relevanten Funktionen /4/.

Die Aufklärung der Struktur der HLA-Moleküle sowie die Charakterisierung der Regeln für die Präsentation von Peptiden durch HLA-Moleküle hat zu einer Erweiterung des Verständnisses der Interaktion zwischen dem Komplex aus HLA-Molekül, präsentiertem Peptid und T-Zell-Rezeptor geführt /5, 6, 7, 8/. Die von den HLA-Molekülen ausgeübte Funktion der Präsentation von extra- und intrazellulären Peptiden und der Induktion einer spezifischen T-Zell-Reaktion ist von wesentlicher Bedeutung in der Regulation einer spezifischen Immunantwort. Diese von Peter Doherty und Rolf Zinkernagel als MHC-Restriktion charakterisierte Immunfunktion von HLA-Molekülen spielt eine zentrale Rolle in der Erkennung von fremden und körpereigenen Strukturen /9/.

In Folge der Kodierungen von Genen und der Analyse der Sequenz der HLA-Region, haben sich zunehmend molekulargenetische Methoden durchgesetzt, die eine direkte Analyse des genetisch kodierten Polymorphismus ermöglichen. Diese Techniken sind im Gegensatz zu den serologischen Methoden in der Lage, auch kleinste Unterschiede zwischen den verschiedenen HLA-Allelen zu erkennen, und haben sich in der Klinik insbesondere im Bereich der Transplantationsdiagnostik und Risikoabschätzung bei der Diagnose von Autoimmunerkrankungen bewährt.

26.1.1 Struktur und Funktion von HLA-Molekülen

Die grundlegende Funktion von HLA-Molekülen ist die Präsentation von Peptiden gegenüber T-Zellen /6, 7/. Die Bindung von Peptidfragmenten in der HLA-Bindungsfurche ist gleichzeitig eine wesentliche Voraussetzung für die Stabilität der HLA-Heterodimere auf der Zelloberfläche. Ein sehr komplexer Mechanismus garantiert hierzu die intrazelluläre Synthese und Peptidbeladung der HLA-Moleküle. Diese Peptide können entweder körpereigene oder aber körperfremde Strukturen, z.B. nach einer Infektion mit Bakterien oder Viren, darstellen. Die Präsentation von körpereigenen Peptiden durch HLA-Moleküle führt normalerweise zu keiner T-Zell-Stimulation, da die entsprechenden autoreaktiven T-Zellen entweder bereits während der Reifung im Thymus entfernt wurden (negative Selektion) oder eine T-Zell-Stimulation aufgrund des Fehlens eines kostimulatorischen Signals nicht möglich ist (periphere Anergie). Sobald jedoch Fremdpeptide durch HLA-Moleküle auf einer Antigen-präsentierenden Zelle dargestellt werden, erfolgt die T-Zell-Aktivierung und die nachfolgende Elimination aller Körperzellen, die diese Fremdpeptide über ihre HLA-Moleküle präsentieren.

HLA-Klasse-I-Moleküle aktivieren bevorzugt zytotoxische CD8⁺T-Zellen, während HLA-Klasse-II-Moleküle vorwiegend CD4⁺T-Helferzellen oder inflammatorische CD4⁺T-Zellen aktivieren. Hierdurch ergeben sich bedeutende funktionelle Aspekte von HLA-Molekülen in der Regulation der T-Zell-vermittelten Immunantwort:

Da T-Zellen über CD4-Moleküle bzw. CD8-Moleküle spezifisch an membranständige HLA-Moleküle binden, sind sie ausschließlich in der Lage, Fremdpeptide zu erkennen, die von den entsprechenden HLA-Molekülen präsentiert werden. Lösliche Antigene können nicht direkt erkannt werden. Die membranständige Erkennung von Antigen dient jedoch auch dazu, die Effektorfunktion der aktivierten T-Zellen auf Fremdantigen präsentierende lokale Zielzellen zu lenken.
HLA-Moleküle steuern zusammen mit den von ihnen präsentierten Antigenen den Typ der T-Zell-Antwort. Extrazelluläre Antigene, z.B. Bakterien, werden vorwiegend durch HLA-Klasse-II-Moleküle präsentiert, während intrazelluläre Antigene (z.B. Viren) aus dem Zytosol überwiegend über HLA-Klasse-I-Moleküle präsentiert werden. Dadurch bedingt werden diese Fremdpeptide durch funktionell völlig verschiedene Populationen von T-Zellen erkannt.
Die Immunantwort auf ein Fremdprotein hängt wesentlich von der Fähigkeit der HLA-Moleküle ab, Peptidfragmente, d.h. Bruchstücke dieses Fremdproteins, in der Antigenbindungsfurche zu binden und auf der Zelloberfläche gegenüber T-Zellen zu präsentieren. Die Bindungsfähigkeit und Möglichkeit, Peptidantigene eines Fremdproteins zu präsentieren, ist jedoch zwischen den verschiedenen HLA-Allelen unterschiedlich. HLA-Moleküle modulieren hierdurch möglicherweise die Immunreaktion gegenüber bestimmten Antigenen.
T-Zellen, die sich gegen körpereigene Antigene und/oder HLA-Moleküle richten, werden im Thymus durch negative Selektion eliminiert, während T-Zellen, die Fremdpeptide im Kontext mit eigenen HLA-Molekülen erkennen, zu reifen T-Zellen proliferieren (positive Selektion). Die Thymus abhängige T-Zell-Selektion wird durch direkten Kontakt zwischen HLA-Molekül, Peptid und reifender T-Zelle ermöglicht. Unterschiede in der Fähigkeit der verschiedenen HLA-Allele, Peptidfragmente gegenüber T-Zellen zu präsentieren, können die Thymus abhängige T-Zell-Selektion verändern.
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind phylogenetisch primitive zytotoxische T-Zellen, die keinen T-Zell-Rezeptor besitzen und damit ohne HLA-Restriktion agieren. NK-Zellen besitzen jedoch Rezeptoren (KIRs, Killer cell immunoglobuline (Ig)-like receptors), die sowohl aktivierend als auch inhibierend wirken /10/. Die Inhibition wird hierbei durch den Kontakt von KIR, Rezeptoren mit langer zytoplasmatischer Domaine (DL, domain long), an Bindungsmotive auf der α₁-Helix von HLA-Klasse-I-Molekülen vermittelt. Unterschieden werden drei Bindungsmotive, HLA-C Gruppe 1 (Ser77/Asn80), HLA-C Gruppe 2 (Asn77/Lys80) und HLA-Bw4 (AS 77–83). Weitere Bindungsinteraktion sind für die Merkmale HLA-A3 und HLA-A11 nachgewiesen.

Die Expression von HLA-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen schützt normalerweise die Zellen vor der Zerstörung durch NK-Zellen. Kommt es jedoch zur verminderten Ausprägung oder zum Fehlen von einzelnen HLA-Klasse-I-Molekülen auf der Zelloberfläche, z.B. nach Virusinfektionen oder bei Tumoren, werden diese Zellen von NK-Zellen eliminiert.

26.1.2 Genetik des HLA-Systems

Das HLA-System ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert (6p21.1–6p-21.3) und umfasst 3.800 Kilobasenpaare. Es wird unterteilt in die Klasse-I-, Klasse-II- und Klasse-III-Region (Abb. 26-1 – Genomische Organisation des Haupthistokompatibilitätskomplexes).

26.1.2.1 HLA-Klasse-I-Region

Die HLA-Klasse-I-Region, die am weitesten telomerwärts liegt, beinhaltet die Genorte für die klassischen Transplantationsantigene HLA-A, HLA-B und HLA-C, die auf allen kernhaltigen Zellen ausgeprägt werden (Tab. 26-1 – Expression von HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Merkmalen). Das Genprodukt dieser Genorte ist ein Polypeptid, das als schwere α-Kette bezeichnet wird und sich mit einem auf Chromosom 15 (15q21–15q22) kodierten Polypeptid, dem β₂-Mikroglobulin, zu einem funktionell aktiven HLA-Molekül verbindet. Darüber hinaus werden von den HLA-Klasse-I-Genorten HLA-E, HLA-F, HLA-G und HLA-H α-Ketten exprimiert.

Die Transkription dieser HLA-Gene findet nur in wenigen Geweben statt und bedingt teilweise eine spezifische Immunregulation durch Interaktion mit Rezeptoren von NK-Zellen. HLA-G wird auf fetalen Zellen der Plazenta exprimiert, die in die Uteruswand einwandern. Diese Zellen exprimieren keine klassischen HLA-Klasse-I-Moleküle und können so nicht als fremd erkannt werden. Im Gegensatz zu anderen Zellen (z.B. Tumorzellen), die keine HLA-Klasse-I-Moleküle ausprägen, werden sie aber nicht von NK-Zellen getötet, da HLA-G als Ligand für den inhibitorischen Rezeptor ILT-2 auf den NK-Zellen fungiert. Dem HLA-G Molekül kommt somit möglicherweise eine wichtige Funktion in der Immunität des bezüglich der Mutter semi-allogenen Feten zu /11/. HLA-E, ein anderes HLA-Klasse-I-Molekül bindet vorwiegend Peptide, die von Signalpeptiden (Leader-peptides) anderer HLA-Klasse-I-Moleküle abstammen. Als Ligand für den Peptid-HLA-E-Komplex dient der NK-Zell-Rezeptor NKG2A, der in dem Oberflächenkomplex CD94 integriert ist. NKG2A besitzt eine inhibitorische Funktion und hemmt bei Stimulation die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen, sodass die HLA-E exprimierende Zelle nicht lysiert wird.

Eine weitere Gengruppe der HLA-Klasse-I-Region sind die MIC-Gene, die zwischen dem HLA-B und HLA-C Locus liegen. Diese Gene besitzen nur sehr geringe strukturelle Gemeinsamkeiten mit den klassischen HLA-Klasse-I-Genen und weisen eine andere regulatorische Steuerung als klassische HLA-Klasse-I-Gene auf. Von den fünf MIC-Genen werden zwei MICA und MICB exprimiert; MICC/D/E sind Pseudogene. Im Gegensatz zu den klassischen HLA-Klasse-I-Genen erfolgt ihre Expression in Fibroblasten und Epithelzellen, vor allem auf intestinalen Epithelzellen.

Zellulärer Stress (UV-Bestrahlung, Hitzeschock, oxidativer Stress, Karzinogene, Infektionen mit Herpesviren, M. tuberculosis oder E. coli) führen zur Induktion von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche. MIC-Moleküle sind Liganden für den NK-Zellrezeptor NKG2D. Mehr als 50 MICA- und 5 MICB-Allele sind bekannt. Die Induktion der MIC Expression führt über eine zunehmende Bindung-Affinität von NKG2D-Rezeptoren zu einer Aktivierung von NK-Zellen, sodass eine NK-Zelle eine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimierende Zelle lysieren kann /12/.

Ein weiterer interessanter Genort in der HLA-Klasse-I-Region stellt der HFE-Genlocus dar. Das Gen HFE transkribiert ebenfalls eine HLA-Klasse-I-ähnliche α-Kette. Einzelne Punktmutationen im Gen HFE können zum Krankheitsbild der hereditären Hämochromatose führen /13/.

Neben HLA-Klasse-I-Genloci, die funktionell intakte HLA-Moleküle exprimieren, gibt es auch eine Vielzahl von Genloci, die als Pseudogene oder Genfragmente imponieren und nicht exprimiert werden (z.B. HLA-J, HLA-K, HLA-L).

26.1.2.2 HLA-Klasse-II-Region

Die HLA-Klasse-II-Region (früher oft als HLA-D-Region bezeichnet) unterteilt sich in drei Subregionen: HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP. Jede dieser Subregionen beinhaltet mindestens ein funktionelles α-(A)-Gen und ein β-(B)- Gen, das jeweils die α-Polypeptidkette und β-Polypeptidkette der funktionell aktiven HLA-Klasse-II-Moleküle (DR, DQ, DP) kodiert. Die HLA-Klasse-II-Moleküle weisen gegenüber den HLA-Klasse-I-Molekülen eine deutlich eingeschränkte Gewebsexpression auf (Tab. 26-1 – Expression von HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Merkmalen). Konstitutiv werden HLA-Klasse-II-Moleküle auf Antigen präsentierenden Zellen, wie B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen sowie einigen Epithelzellen und Endothelzellen, exprimiert. Die Ausprägung von HLA-Klasse-II-Molekülen ist jedoch in den meisten Zellen induzierbar, z.B. nach Stimulation mit IFN-γ oder IL-4.

Eine Besonderheit der HLA-DR-Region ist, dass die Anzahl der HLA-DRB-Gene auf einem Chromosom nicht konstant ist, sondern sich entsprechend der Haplotypkonstellation verändert (Abb. 26-1 – Genomische Organisation des Haupthistokompatibilitätskomplexes). Das HLA-DRB1-Gen ist bei jedem Individuum vorhanden und kodiert zusammen mit dem Gen HLA-DRA die Spezifitäten von HLA-DR1 bis -DR18. Das Gen HLA-DRB3 ist auf Haplotypen, die DR11, DR12, DR13, DR14, DR1403, DR1404, DR17 und DR18 exprimieren, und kodiert zusammen mit HLA-DRA die DR52-Spezifität. Das Gen HLA-DRB4 findet sich auf den DR4-, DR7- und DR9-Haplotypen und kodiert zusammen mit DRA die DR53-Spezifität. Das Gen HLA-DRB5 hingegen findet sich auf DR15- und DR16-Haplotypen, selten auch auf Haplotypen der DR1-Gruppe und kodiert mit HLA-DRA die DR51-Spezifität. Lediglich die Gene HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4 und DRB5 exprimieren jedoch β-Ketten, die übrigen HLA-DRB-Gene sind Pseudogene. Der HLA-DRB1-Genlocus ist hierbei durch einen ausgeprägten Polymorphismus gekennzeichnet, während die Genloci HLA-DRB3, -DRB4 und -DRB5 nur geringgradig polymorph sind.

In der HLA-DQ-Region liegen zwei α- und zwei β-Kettengene: HLA-DQA1, -DQB1, -DQA2 und -DQB2 sowie ein verkürztes β-Kettengen (HLA-DQB3). Lediglich HLA-DQA1 und HLA-DQB1 exprimieren funktionell aktive Polypeptide, die das HLA-DQ-Molekül bilden. Die anderen Genloci sind Pseudogene. Sowohl HLA-DQA1 als auch HLA-DQB1 sind hochgradig polymorph, wobei die serologisch nachweisbaren HLA-DQ-Antigene wahrscheinlich auf der β-Kette liegen. Die HLA-DP-Region umfasst 4 Genloci: Zwei α-Kettengene, HLA-DPA1 und HLA-DPA2 sowie zwei β-Kettengene, HLA-DPB1 und HLA-DPB2. Entsprechend der HLA-DQ-Region exprimieren lediglich HLA-DPA1 und HLA-DPB1 Genprodukte, die das HLA-DP-Molekül bilden. HLA-DPA2 und HLA-DPB2 stellen Pseudogene dar.

Neben den Genloci für die Merkmale HLA-DR, -DQ und -DP liegen strukturell verwandte Genloci in der HLA-Klasse-II-Region, die als DOB, DNA, DMA und DMB bezeichnet werden. Von diesen exprimieren DMA und DMB α- bzw. β-Polypeptidketten, die ein membranständiges heterodimeres Molekül bilden, das eine wesentliche Funktion in der intrazellulären Assoziation von Peptid und HLA-Klasse II-Molekül während der Antigenprozessierung übernimmt /14/.

In der HLA-Klasse-II-Region sind auch die Gene TAP, die eine funktionelle Bedeutung für die Antigenprozessierung besitzen. Die TAP1- und TAP2- (TAP, Transporter associated with antigen processing) Genprodukte bilden ein heterodimeres membranständiges Molekül, das den Transport von prozessierten Antigenen in das endoplasmatische Retikulum ermöglicht.

26.1.2.3 HLA-Klasse-III-Region

Zwischen der HLA-Klasse-II-Region und der HLA-Klasse-I-Region liegt noch ein als HLA-Klasse-III-Region bezeichneter Abschnitt, der eine Vielzahl von Genen mit sehr unterschiedlichen Funktionen umfasst. Es existieren keine etablierten funktionellen oder strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den HLA-Klasse-III-Genprodukten und den HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Genprodukten. Einige dieser Gene können jedoch funktionell aktiv im Rahmen einer Immunreaktion sein, z.B. die Gene für die Komplementfaktoren C2, C4 und BF, Gene für TNF-α und Lymphotoxin (LTα und LTβ) sowie das Gen für das Hitze-Shock-Protein 70. Zwischen dem Gen C4A und C4B liegen die Gene, die für die C21-Hydroxylase kodieren. Deletionen und Duplikationen des C21-B-Genlocus, sofern sie in homozygoter Form vorliegen, können zum Krankheitsbild des adrenogenitalen Syndroms (AGS) führen.

26.1.2.4 HLA-Polymorphismus

Die HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Genloci der HLA-Klasse-I-Region sowie die Mehrzahl der HLA-Klasse-II-Genloci zeichnen sich durch einen hohen Grad an Polymorphismus aus. Siehe Tab. 26-2 – Aufstellung der HLA-Klasse-I-Allele und Tab. 26-3 – Aufstellung der HLA-Klasse-II-Allele. Zur Charakterisierung des ausgeprägten Polymorphismus des HLA-Systems werden molekulargenetische Untersuchungen der Sequenzunterschiede auf DNA-Ebene einzelner HLA-Genorte eingesetzt. Die vormals dominierenden serologischen Techniken zur Typisierung von Antigen werden im Rahmen der Testung der Gewebekompatibilität bei Blutstammzelltransplantationen häufig nur noch als ergänzende Untersuchungen (z.B. zum Ausschluss eines molekularbiologisch nicht abgrenzbaren Null-Allels) angewendet /15/. In der Nomenklatur werden zur Unterscheidung von molekulargenetischen und herkömmlichen serologischen Techniken, neben der Angabe des Genortes ein durch ein *-Zeichen getrennter Nummernkode verwendet, wobei die ersten beiden Ziffern die Haupt- und die weiteren Ziffern die Nebengruppen bzw. Subtypen angeben. Weitere Ziffern werden zur Angabe von Sequenzunterschieden zwischen Allelen aufgeführt, die zu keiner Veränderung der Aminosäurensequenz führen, Intron-Variationen darstellen oder nicht-exprimierte Allele darstellen (N, Null Allele) (Tab. 26-4 – Überarbeitete Nomenklatur für serologische und molekularbiologisch bestimmte HLA-Merkmale).

Aufgrund der stetig zunehmenden Anzahl an Allelen, ist die Nomenklatur überarbeitet worden, in dem die verschiedenen Ziffernfelder durch einen Doppelpunkt (:) voneinander getrennt werden (Beispiel: HLA-A*0101 = HLA-A*01:01). Weiterhin hat man bei der molekularbiologischen Bezeichnung der HLA-C-Locus Allele das w (ursprünglich für Workshop) entfernt (Beispiel: Cw*0103 = C*01:03), für serologische Bestimmungen (Antigenbezeichnungen) wird es jedoch weiterhin zur Unterscheidung mit dem Komplement System beibehalten (Beispiel: HLA-Cw3).

Die Vererbung und Expression der HLA-Moleküle erfolgt in kodominanter Weise. Jedes Individuum besitzt maximal zwei Allele für jeden HLA-Genort. Die Gesamtheit der ausgeprägten HLA-Allele wird als HLA-Phänotyp bezeichnet. Der HLA-Phänotyp entspricht somit der genetisch vorhandenen Allelkonstellation der einzelnen HLA-Genloci, die auf dem paternalen und maternalen Chromosom vorhanden sind (Abb. 26-2 – Kodominante Expression von HLA-Klasse I- und Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche). Die jeweilige chromosomale Anlage von HLA-Merkmalen mehrerer HLA-Genorte (z.B. HLA-A, -B, -DRB1) wird demgemäß als HLA-Haplotyp, die Merkmalskonstellation beider Haplotypen als HLA-Genotyp bezeichnet. Die Frequenz der Rekombination des HLA-Systems liegt hierbei bei unter 3 % /16, 17/. Innerhalb einer Familie werden die chromosomalen Anlagen (Haplotypen) entsprechend den Mendelschen Regeln von den Eltern an die Kinder weitervererbt (Abb. 26-3 – Segregation der HLA-Haplotypen innerhalb einer Familie). Ausgehend von je zwei Haplotypen eines Individuums, d.h. maximal 4 Haplotypen der Eltern (zwei des Vaters und zwei der Mutter) wird von jedem Elternteil je ein Haplotyp an die Kinder in beliebiger Konstellation vererbt. Da jedes Kind je einen Haplotyp des Vaters und einen der Mutter erhält, besteht eine 25 %-ige Wahrscheinlichkeit, dass zwei Geschwister innerhalb einer Familie in ihren paternalen und maternalen Haplotypen übereinstimmen.

Die genotypische Übereinstimmung bewirkt, dass die Geschwister im Bezug auf die HLA-Merkmale untereinander identisch sind und somit eine maximale immunologische Übereinstimmung im HLA-System aufweisen. Die Eltern weisen nur einen gemeinsamen Haplotyp mit den Kindern auf und sind HLA-haplo identisch. Während die HLA-Übereinstimmung bei der Organtransplantation vorteilhaft aber nicht zwingend ist, stellen HLA-genotypisch identische Geschwister ein ideales Spender/Empfänger-Paar für die Blutstammzelltransplantation dar.

Auf Grund der großen Zahl von Allelen der verschiedenen HLA-Genorte kommt es zu einer großen Zahl von möglichen Allelkombinationen in der Bevölkerung, so dass sich nicht verwandte Individuen häufig in ihrem HLA-Phänotyp voneinander unterscheiden.

Ein wesentliches Charakteristikum des HLA-Systems ist, dass verschiedene HLA-Merkmale in Abhängigkeit von der entsprechenden Population häufiger vorkommen als andere HLA-Merkmale. Zudem besteht zwischen den verschiedenen HLA-Genorten ein deutliches Kopplungsungleichgewicht, d.h. bestimmte Allele eines Genortes werden häufiger mit den entsprechenden Allelen eines anderen Genortes vererbt, als aufgrund der Häufigkeit der Einzelmerkmale zu erwarten wäre. Die Abweichung der erwarteten von der beobachteten Häufigkeit zweier HLA-Merkmale wird als Delta-(Δ)-Wert bezeichnet und drückt somit die Stärke des Kopplungsungleichgewichts zwischen zwei HLA-Merkmalen aus /18/.

Die Verteilung des Kopplungsungleichgewichts zwischen verschiedenen HLA-Merkmalen kann ebenfalls von der Population (z.B. Europiden oder Orientalen) abhängig sein. Es ergeben sich daraus unterschiedliche Wahrscheinlichkeiten für das Vorliegen bestimmter HLA-Merkmalskombinationen innerhalb einer Population, die als Haplotypfrequenzen angegeben werden. Diese Unterschiede in der Häufigkeit von HLA-Merkmalen beruhen mit großer Wahrscheinlichkeit auf der natürlichen Selektion bestimmter HLA-Merkmale, die eine bessere Präsentation von Krankheitserregern ermöglichen. Populations bedingte Unterschiede in der Antigenfrequenz können jedoch auch einen Einfluss auf die Stärke der Krankheitsassoziation nehmen oder auf die Wahrscheinlichkeit einen HLA kompatiblen nicht verwandten Blutstammzellspender oder HLA kompatiblen unverwandten Thrombozytenspender zu finden.

26.1.3 Molekulare Struktur der HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Moleküle

Durch die kristallographische Darstellung der HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Moleküle besteht eine exakte Vorstellung über die Struktur und den damit verbundenen funktionellen Aspekten von HLA-Molekülen (Abb. 26-4 – HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Molekülstruktur und Genaufbau) /5, 8/.

HLA-Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer glykosilierten schweren Polypeptidkette von 45 kDa, die als α-Kette bezeichnet wird und nicht kovalent mit β₂-Mikroglobulin, einem Polypeptid von 12 kDa, assoziiert ist. Siehe Abb. 18.12-1 – HLA-Antigene auf der Zellmembran kernhaltiger Zellen. Die α-Kette des HLA-Klasse-I-Moleküls besteht aus drei extrazellulären Domänen, der α₁- (N-terminal), der α₂- und der α₃-Domäne sowie einer transmembranen und einer zytoplasmatischen Region. Diese strukturelle Gliederung der Moleküle findet sich auch im Aufbau der Intron-Exon-Bereiche des Gens der HLA-Klasse-I wieder. Jede der drei extrazellulären Domänen besteht aus etwa 90 Aminosäuren. Die α₂- und α₃-Domänen besitzen jeweils eine Disulfidbrücke, die zur Ausbildung einer Schleife führt, die aus 63 (α₂) und 86 (α₃) Aminosäuren besteht. Die β-Faltblattstruktur der α₃-Domäne sowie das β₂-Mikroglobulin weisen eine deutliche Homologie mit den konstanten Regionen der Immunglobuline auf. Die Anlagerung des β₂-Mikroglobulins, das auch über eine Disulfidbrücke verfügt, erfolgt zwischen den Domänen α₂ und α₃ und stabilisiert die Tertiärstruktur des membranständigen Heterodimers. Das β₂-Mikroglobulin ist hierbei vollständig extrazellulär gelegen, wodurch das HLA-Klasse-I-Molekül lediglich durch die α-Kette in der Zellmembran verankert ist. Die α₃-Domäne der α-Kette ist der wesentliche Bindungsort für das CD8-Molekül des T-Zell-Rezeptors.

Demgegenüber bilden dieDomänen α₁ und α₂ die Peptidbindungsfurche des HLA-Moleküls sowie die Kontaktstelle zu dem T-Zell-Rezeptor aus. Der Boden der Peptidbindungsfurche besteht aus 8 antiparallelen β-Strängen, auf die sich zwei antiparallele α-Helices befinden, die die Wände der Peptidbindungsfurche ausbilden. Die Enden der HLA-Klasse-I-Peptidbindungsfurche stehen sich hierbei relativ eng gegenüber, sodass lediglich kurze Peptidfragmente von 8–11 Aminosäuren (vorwiegend 9 Aminosäuren) eingelagert werden können. Die Peptidbindungsfurche beinhaltet den größten Teil der allelischen Aminosäurenvariation und weist eine Reihe von Taschen und Unebenheiten auf, die mit Aminosäureresten der eingelagerten Peptide interagieren. Veränderungen der Aminosäurensequenz der Peptidbindungsfurche, die durch allelische Variationen der HLA-Moleküle bedingt sind, können so zu Affinitätsveränderungen im Bindungsverhalten von Peptiden führen und das Muster der präsentierten Peptide und nachfolgend die Art der Immunantwort bestimmen.

Diese einfache Beziehung zwischen Interaktion der HLA-Peptidbindungsfurche und Peptid (MHC-Restriktion) stellt somit einen grundlegenden strukturellen Mechanismus in der genetischen Kontrolle der Immunantwort dar.

HLA-Klasse-II-Moleküle besitzen ebenfalls einen heterodimeren Aufbau, wobei jeweils eine schwere α-Kette (30–35 kD) und eine leichte β-Kette (26–29 kDa) nicht kovalent assoziieren /4/. Der Unterschied im Molekulargewicht der HLA-Klasse-II-α/β-Ketten beruht im Wesentlichen auf der unterschiedlichen Glykosilierung. Beide Ketten weisen je zwei extrazelluläre Domänen (α₁, α₂ und β₁, β₂), eine transmembrane und eine zytoplasmatische Region auf, die sich auch in der Intron-Exon-Struktur wiederfindet. Die membranständigen Domänen α₂ und β₂ entsprechen der α₃-Domäne und dem β₂-Mikroglobulin der HLA-Klasse-I-Moleküle und stabilisieren die Konformation des Heterodimers. Beide Domänen (α₂ und β₂) weisen strukturelle Ähnlichkeit mit den konstanten Regionen der Immunglobuline auf.

Im Gegensatz zu HLA-Klasse-I-Molekülen sind sowohl die β₂- als auch die β₁-Domänen an der Bindung mit dem CD4-Molekül des T-Zell-Rezeptors beteiligt. Die Peptidbindungsfurche des HLA-Klasse-II-Moleküls wird durch die α₁- und β₁-Domänen gebildet und besteht ähnlich den HLA-Klasse-I-Molekülen aus einer β-Faltblattstruktur und zwei darüber liegenden α-Helices. Im Gegensatz zu den HLA-Klasse-I-Molekülen ist die HLA-Klasse-II-Bindungsfurche jedoch zu den Enden hin offen, sodass auch längere Peptidfragmente (11–25 Aminosäuren) darin gebunden werden, wobei die Enden der Peptide an beiden Seiten der Peptidbindungsfurche herausragen. Entsprechend den HLA-Klasse-I-Molekülen weist die Peptidbindungsfurche der HLA-Klasse-II-Moleküle die größte Zahl der allelischen Veränderungen in der Aminosäurensequenz auf.

26.1.4 Antigenprozessierung und Antigenpräsentation

Die Anlagerung von Peptiden an HLA-Moleküle ist eine essentielle Voraussetzung für die Stabilität des HLA-Heterodimers und findet bereits bei der Zusammensetzung der HLA-Moleküle im Zellinneren statt. Sowohl HLA-Klasse-I-Molekülen als auch HLA-Klasse-II-Molekülen steht hierfür ein sehr komplexer Mechanismus zur Verfügung. Dieser garantiert, dass in Abhängigkeit von der Bindungsmöglichkeit der verschiedenen HLA-Moleküle für unterschiedlich lange Peptidfragmente entsprechende Peptide generiert werden, die sich in die HLA-Bindungsfurche einlagern können. Auch garantiert dieser Mechanismus, dass eine intrazelluläre Trennung der Schritte der Antigenprozessierung für die unterschiedlichen Klassen von HLA-Molekülen erfolgt /13, 14/. Durch diesen komplexen intrazellulären Mechanismus der Antigenprozessierung von körpereigenen und körperfremden Peptiden und der anschließenden Antigenpräsentation kommt den HLA-Molekülen eine Schlüsselstellung in der ständigen Überwachung des intra- und extrazellulären Raumes der Zelle zu.

Die Prozessierung von intrazellulären zytoplasmatischen oder nukleären Proteinen, die überwiegend von HLA-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, erfolgt zunächst im Zytoplasma als enzymatische Degradation durch multikatalytische Proteinkomplexe, den Proteasomen. Die von den Proteasomen generierten Peptidfragmente werden anschließend durch einen ATP-abhängigen aktiven Transport über die TAP1/2-Heterodimere (TAP, Transporter associated with antigen processing) in das endoplasmatische Retikulum (ER) überführt. Im ER erfolgt die Beladung des HLA-Moleküls mit einem Peptid. Anschließend wird der HLA-Peptid-Komplex an die Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert. Die Kombination aus Proteinfragmentierung durch Proteasomen und Peptidtransport durch TAP-Moleküle bewirkt, dass der überwiegende Teil der von HLA-Klasse-I-Molekülen präsentierten Peptide aus dem Zytoplasma der Zelle stammt. Hierdurch wird auch verständlich, dass z.B. die meisten Viren oder eine große Zahl von Tumorantigenen von HLA-Klasse-I-Molekülen dargestellt wird.

Proteine können auch über einen speziellen endozytotischen Mechanismus, wie er bei Makrophagen oder dendritischen Zellen vorhanden ist, in das Zytoplasma übertreten und somit durch HLA-Klasse-I-Moleküle präsentiert werden.

Im Gegensatz zu den HLA-Klasse-I-Molekülen, binden HLA-Klasse-II-Moleküle vorwiegend Peptidfragmente extrazellulärer Proteine, die durch Endozytose in das Zellinnere gelangen. Diese extrazellulären Proteine gelangen über das Endosomen- in das Lysosomen-Kompartiment und werden während dieser Schritte durch verschiedene proteolytische Enzyme degradiert. Die Bindung von Peptiden mit HLA-Klasse-II-Molekülen findet hierbei vorwiegend im Lysosomen-Kompartiment und nur zu einem geringen Anteil im Endosomen-Kompartiment statt.

Ähnlich den HLA-Klasse-I-Molekülen werden nur diejenigen Peptide in der Bindungsfurche des HLA-Moleküls eingelagert, die eine möglichst hohe Stabilität des Heterodimers mit sich bringen. Nachfolgend werden die mit Peptid beladenen HLA-Klasse-II-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert und die eingelagerten Peptidfragmente gegenüber T-Zellen präsentiert. Neben der vorwiegenden Prozessierung und Präsentation von extrazellulären Peptiden, sind HLA-Klasse-II-Moleküle auch in der Lage, zytoplasmatische Proteine, die in den Orozess der Endozytose gelangen, zu präsentieren.

Die Möglichkeit von HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Molekülen, sowohl extra- als auch intrazelluläre Peptide zu präsentieren, stellt sicherlich einen zusätzlichen Schutz gegenüber den verschiedenen Formen von Pathogenen dar und weist auf die besondere Bedeutung hin, die der Regulation von Antigenprozessierung und Antigenpräsentation für die Steuerung der Immunantwort zukommt.

26.1.5 Lösliche HLA-Antigene

Im Vergleich mit den gut charakterisierten Membran ständigen HLA-Molekülen ist die Funktion der löslichen HLA-Klasse-I (lsHLA-Klasse I)-Antigene und HLA-Klasse-II- (lsHLA-Klasse II) Antigene weniger gut definiert. Neben Proteolyse und Membrane shedding werden lsHLA-Antigene durch alternatives Spleißen von RNA-Transkripten generiert /19, 20/.

Verschiedene Untersuchungen haben Hinweise darauf gegeben, dass lsHLA-Antigene einen immunmodulatorischen Einfluss ausüben /21/. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass lsHLA-Klasse-II-Antigene möglicherweise mit einer HIV-1-Infektion interferieren. Lösliche HLA-Klasse-II-Antigene können auch Anergie von autoreaktiven T-Zellen bewirken oder T-Zell-Apoptose induzieren und so möglicherweise zur Induktion einer Toleranz bei Autoimmunerkrankungen führen. Vergleichbar hierzu können lsHLA-Klasse-I-Antigene eine Apoptose in alloreaktiven zytotoxischen T-Zellen induzieren. Erhöhte Serumkonzentrationen von lsHLA-Klasse-I-Antigenen finden sich assoziiert mit der Graft-versus-Host-Erkrankung /22/ und Episoden von akuter Abstoßung nach Organtransplantation /23, 24, 25/. Lösliche HLA-Klasse-I-Antigene binden auch an Rezeptoren von NK-Zellen und können dadurch die lytische Aktivität dieser Zellen inhibieren /26, 27/. Veränderungen von lsHLA-Antigenen konnten ebenfalls bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen gefunden werden /28/. Eine klinische Bedeutung in der Diagnostik ist den löslichen HLA-Antigenen jedoch nicht zugekommen.

26.1.6 HLA und Pharmakovigilanz (Abacavir-bedingtes Hypersensitivitäts-Syndrom)

Patienten, die im Rahmen einer HIV-Infektion erstmals mit den Virusstatika NRTI Abacavir behandelt werden, zeigen in bis zu 5 % der Fälle eine schwere Immunreaktion in Form einer Hypersensitivitäts Reaktion /29, 30/. Die Symptome treten zwischen wenigen Tage und 6 Wochen nach Therapiebeginn auf und können bei Fortführung der Therapie lebensbedrohlich werden. Die als Abacavir-bedingte HypersensitivitätsSyndrom bezeichnete Nebenwirkung tritt bei ca. 5 % der Patienten auf. Ein diagnostischer in vitro-Test existiert nicht, es besteht jedoch eine enge Assoziation zwischen dem Merkmal HLA-B*5701 und der Hypersensitivitäts Reaktion unter Abacavir.

Da die Hypersensitivitäts Reaktion gegen Abacavir nur unter Merkmalsträgern des HLA-B*57:01 Allels auftritt, kann nach bisheriger Datenlage bei negativem Test auf HLA-B*57:01 eine immunologisch bedingte Hypersensitivitäts Reaktion ausgeschlossen werden. Bei positivem Nachweis von HLA-B*57:01 ist die Gabe von Abacavir kontraindiziert. Eine Testung auf HLA-B*57:01 sollte daher entweder im Rahmen der Erstuntersuchung oder vor Therapieumstellung auf eine Abacavir haltiges Regime erfolgen.

26.2 HLA-Moleküle in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen

Die Ursache für Autoimmunreaktionen ist teilweise komplex und nur unvollständig verstanden. Häufig spielen sowohl Umwelt bedingte als auch erbliche Faktoren eine Rolle. Interessanterweise findet sich bei einer Reihe von Autoimmunerkrankungen eine deutliche Assoziation mit bestimmten HLA-Allelen (Tab. 26-5 – Assoziation von HLA-Merkmalen mit Krankheiten). Ein charakteristisches Merkmal von Autoimmunerkrankungen ist, dass es zu einer lang andauernden Stimulation von autoreaktiven T-Zellen kommt, die nachfolgend durch Zerstörung der Zellen, die das Selbstantigen tragen, zu Gewebeschäden führen.

Verschiedene Mechanismen werden im Zusammenhang mit HLA-Molekülen für das Auftreten von autoreaktiven T-Zellen diskutiert. Siehe Beitrag 25.1.3 – Autoantikörperbestimmung bei Autoimmunkrankheiten:

Eine mangelhafte negative Selektion von autoreaktiven T-Zellen während der Thymusentwicklung. Autoreaktive T-Zellen werden normalerweise während der Entwicklung im Thymus durch Kontakt mit HLA-Molekülen und Selbstantigen eliminiert. Siehe Abb. 21.1-7 – Selektion von T-Zellen im Thymus. Allelische Variation in der Struktur von HLA-Molekülen könnten jedoch zum einen dazu führen, dass die Affinität von T-Zellen mit dem HLA-Molekül verringert ist oder aber, dass es zu einer mangelhaften Präsentation von körpereigenen Peptiden kommt.
Aufgrund von Allel spezifischen Veränderungen der HLA-Peptidbindungsfurche und der dadurch bedingten Veränderung in der Auswahl von Peptidfragmenten könnte es zur Präsentation von in die Peptidfragmente eindringende Krankheitserreger kommen, die zusammen mit bestimmten HLA-Merkmalen die Aktivität regulatorischer T-Zellen beeinflussen, deren normale Funktion in der Verhinderung der Autoimmunität besteht.
Strukturelle Ähnlichkeiten von Pathogen und HLA-Molekülen könnten zu Autoimmunerkrankungen als Folge von Infektionen führen. Dieser Mechnismus wird als Molecular mimicry bezeichnet.
Veränderung in der Membranexpression von HLA-Molekülen könnten die Balance zwischen Th1-Zellen und Th2-Zellen und die von diesen Zellen sezernierten Zytokine verändern. Tatsächlich bestehen Allel spezifische Unterschiede in den konservierten Sequenzen der Promotorregionen von HLA-Molekülen, die möglicherweise zu einer unterschiedlichen Rate der Transkription führen. Beispiele für diese Art von Mechanismen finden sich für HLA-DRB1-Allele und HLA-DQB1-Allele. Neben funktionellen Aspekten von HLA-Molekülen ist es jedoch auch möglich, dass einige krankheitsassoziierte HLA-Merkmale lediglich im Kopplungsungleichgewicht mit pathogenetisch relevanten Genen für bestimmte Autoimmunerkrankungen stehen (z.B. HLA-A3 und Assoziation mit der Hämochromatose. Siehe auch Beitrag 26.2.2 – Genetische Hämochromatose und HFE-Gendiagnostik.

26.2.1 Statistische Verfahren zur Beurteilung der Krankheitsassoziation

Grundlage der Ermittlung von Krankheitsassoziation ist der Vergleich der Häufigkeit eines Merkmales zwischen Patienten und gesunden Kontrollen /31/. Die Anzahl der Patienten und Kontrollen, die für ein Allel positiv ist wird hierbei mit dem Chi-Quadrat-Test verglichen (X²-Test auf der Basis von Vierfelder- bzw. Mehrfeldertafeln). Dazu wird in der Regel für Patienten und Kontrollen pro betrachteten Allel eine Vierfeldertafel der absoluten Häufigkeit erstellt.

Der X²-Test ist ein Ausdruck der Abweichung von den erwarteten Werten unter der Annahme, dass keine Assoziation besteht. Die Werte sollten in keinem Fall kleiner als fünf und die Gesamtsumme der Häufigkeiten sollte größer 50 sein. Für die Vierfeldertafel besitzt der Test einen Freiheitsgrad (FG = 1). X² berechnet sich nach der Formel:

a = Anzahl der Patienten mit dem Merkmal; b = Anzahl der Patienten ohne das Merkmal; c = Anzahl der Kontrollen mit dem Merkmal; d = Anzahl der Kontrollen ohne das Merkmal; N = Gesamtzahl von Patienten und Kontrollen

Werden Fallzahlen unter 50 bearbeitet, so empfiehlt es sich, noch eine Yates-Korrektur einzuführen, um den X²-Wert etwas konservativer zu gestalten nach der Formel:

Die erhaltenen Werte für X² lassen sich in Signifikanzstufen einteilen. Für unkorrigierte p-Werte gilt:

3,84 > p < 6,64 (5%-Stufe): wahrscheinlich signifikant

6,64 > p < 10,83 (1 %-Stufe): signifikant

10,83 > p (0,1 %-Stufe): höchst signifikant

Aufgrund der Zufalls bedingten Möglichkeit einer signifikanten Abweichung (Typ I-Fehler) sollten grundsätzlich die p-Werte (p_nk-nicht korrigiert) für die Anzahl der durchgeführten Vergleiche korrigiert (p_k-korrigiert) werden nach der Formel:

p_k = 1 – (1 – p_nk)ⁿ

Dabei ist n die Zahl der Vergleiche (beispielsweise die Zahl der vorhandenen HLA-DRB1-Allele).

Die Stärke einer Assoziation wird ermittelt durch Berechnung des relativen Risikos (RR) bzw. der Odds Ratio (OR) mit den 5–95 %-Konfidenzintervallen /32, 33/. Das relative Risiko gibt einen Risikofaktor an, inwieweit ein Individuum mit einem Krankheits assoziierten Merkmal (beispielsweise HLA-DRB1*04) im Vergleich zu einem Individuum ohne dieses Merkmal erkrankt. Das relative Risiko wird nach der Formel von Woolf berechnet /34/:

Die Berechnung der ätiologischen (ÄF) oder präventiven Fraktion (PF) kann zusätzlich erfolgen um abzuschätzen, wie stark der betrachtete Faktor in der Stichprobe einer Population zur genetischen Prädisposition für die Erkrankung beiträgt /34/.

Die ÄF-Werte < 0,0 bis maximal 0,99 zeigen den Beitrag der genetischen Komponenten für die Manifestation der betreffenden Erkrankung an; PF-Werte < 1,0 bis 0,0 zeigen die protektive Wirkung eines HLA-Antigens gegenüber der Manifestation einer Erkrankung an. Neben der Berechnung der ÄF-Werte und PF-Werte können zur Abschätzung der Assoziation bei Betrachtung von zwei oder mehr Genloci der positive prädiktive Wert (PPV) bzw. der negative prädiktive Wert (NPV) entsprecht der folgenden Formel ermittelt werden /35/.

26.2.2 Genetische Hämochromatose und HFE-Gendiagnostik

Das Gen HFE liegt auf Chromosom 6 innerhalb des Haupthistokompatibilitätskomplexes. Die Klonierung und Sequenzuntersuchung konnte zeigen, dass Genvarianten des Gens HFE mit der Prädisposition der hereditären Hämochromataose korrelieren /36/. Diese HLA-A3 (–B7)-assoziierte Erkrankung verursacht eine Eisenüberladung /37/. Siehe weiterführend Tabelle 7.1-6 – Klinik und Labordiagnostik der hereditären Hamochromatose. Patienten mit einer hereditären Hämochromatose weisen zu 70–90 % eine homozygote Punktmutation des Gens HFE auf. Diese findet sich an Position 282 des Gens HFE in Form eines A/G-Austausches, der zu einem Aminosäurenaustausch an Codon 282 führt (Tyr/Cys) und wird als C282Y bezeichnet. Die C282Y Mutation führt zu einer Dissoziation mit dem β₂-Mikroglobulin und verhindert die Expression eines intakten Moleküls HFE auf der Zelloberfläche. Zwei weitere Punktmutationen mit klinischer Relevanz sind ebenfalls beschrieben worden. Diese als H63D (Position 187 G → C, Codon 63 Asp → His) und S65Y (Pos 193 A → T und Codon 65 Ser → Cys) bezeichneten Genvarianten können insbesondere bei gleichzeitigem Vorliegen einer C282Y Mutation in trans-Stellung die Prädispositon der Krankheit erhöhen. Neben einer Vielzahl weiterer HFE-Genvarianten ist eine klinisch relevante Mutation E168X (Codon 168, Glu zu Stop-Codon) beschrieben worden, die zu einem Stop-Codon führt, mit vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese. Eine funktionelle Expression findet nicht statt (Null-Allel).

Beim kombinierten Auftreten (Compound Heterozygotie) der E168X-Mutation in trans-Stellung mit der C282Y-, H63D- oder S65Y-Variante ist dieser Befund daher ebenfalls als prädisponierend für die Erkrankung einzustufen. E168X-homozygote Merkmalsträger sind bisher nicht beobachtet worden. Der Nachweis der HFE-Mutationen kann durch PCR-Amplifikation der jeweiligen HFE-Genregionen und anschließenden Nachweis der Sequenzvariation durch Restriktionsenzymverdau oder durch Hybridisierung mit Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden erfolgen.

26.3 Das HLA-System und Transplantation

26.3.1 Organtransplantation

Die Transplantation von soliden Organen stellt eine entscheidende therapeutische Option in der Behandlung von schweren Organdisfunktionen statt. Dabei steht die Übereinstimmung in den AB0-Blutgruppen-Merkmalen und in Abhängigkeit von dem zu transplantierenden Organ die Gewebeverträglichkeit im HLA-System im Vordergrund (Tab. 26-6 – Mittlere Organüberlebenszeit nach Nierentransplantation). Neben der Vermeidung hyperakuter Abstoßungsreaktionen durch natürlich vorkommende Alloantikörper im AB0-System kommt der Vermeidung von Transplantationen gegen präformierte HLA-Alloantikörper und einer partiellen Übereinstimmung in den Merkmalen des HLA-System ein Einfluss auf das Überleben des Transplantats zu (Collaborative Transplant Study).

In der Transplantation von Organen ist die Berücksichtigung des HLA-Systems trotz der zunehmenden Fortschritte in der imunsuppressiven Therapie eindrucksvoll für die Nierentransplantation belegt. HLA identische Geschwister weisen hierbei gegenüber Haplotyp identischen Eltern oder HLA-kompatiblen Nieren unverwandter Spender eine deutlich bessere Überlebenszeit des Transplantats auf. Die Unterschiede in dem Überleben des Transplantats kommen dabei insbesondere im Langzeitverlauf zum Tragen. Berücksichtigung in der Beurteilung der Verträglichkeit des Gewebes finden die Genloci HLA-A, HLA-A-B, und HLA-A-DRB1 auf Ebene einer zweistelligen niedrig auflösenden HLA-Typisierung (z.B. HLA-DRB1*01). Zur Verbesserung der Gewebeverträglichkeit, insbesondere bei präformierten HLA-Antikörpern werden auf Empfehlung des Tissue Typing Advisory Committees (TTACT) von Eurotransplant auch die Merkmale HLA-C und HLA-DQB1 bestimmt und in die Zuordnung der Spenderorgane (Allokation) mit einbezogen.

Die molekularbiologische Bestimmung findet in der Regel eine Anwendung als Technik der Typisierung. Untersuchungen der Patienten sollten durch eine zweite Bestimmung aus einer unabhängig gewonnenen Blutprobe bestätigt werden. Weisen die Ergebnisse der Gewebetypisierung bei Patienten nach der Erstuntersuchung an den allokations relevanten Genorten jeweils nur ein Merkmal auf (Verdacht auf Reinerbigkeit) sollte eine Familienuntersuchung oder eine weiterführende, z.B. hochauflösende, molekularbiologische Untersuchung erfolgen.

Die Nierentransplantation und kombinierte Nieren-/Pankreastransplantation steht dabei eindeutig im Vordergrund bei der Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität. Weiterhin sollte bei immunisierten Empfängern für eine Herz oder Lungentransplantation und Empfängern von Dünndarmtransplantaten die Organvergabe unter Einbindung der Gewebekompatibilität unter Berücksichtigung der HLA-Antikörperspezifitäten erfolgen. Bei anderen soliden Organtransplantationen bzw. nicht immunisierten Empfängern von Herz- oder Lungentransplantaten ist die HLA-Kompatibilität von untergeordneter Bedeutung. Ein Grund hierfür liegt in der durch die Bestimmung der HLA-Merkmale verursachten Verlängerung der Ischämiezeit, die insbesondere bei der Transplantation von Herzen und Lungen kritisch ist.

Neben der Übereinstimmung von HLA-Merkmalen zwischen Spender (Lebendspender oder Kadaverorgan) und Empfänger kommt der Diagnostik von präformierten HLA-Alloantikörpern eine große Bedeutung in der Vermeidung von akuten und chronischen Abstoßungsreaktionen zu. Vergleichbar mit den präformierten Blutgruppenantikörpern AB0 können HLA-Alloantikörper zu einer (hyper)akuten Abstoßung führen. Zur Vermeidung von solchen schweren Nebenwirkungen werden Patienten, die auf ein Transplantat warten in regelmäßigen Abständen (120–180 Tage) auf präformierte HLA-Alloantiköper untersucht.

Die Untersuchungen erfolgen sowohl serologisch mittels Lymphozytotoxizitäts-Test (LCT) als auch durch Festphasentestung im ELISA, Mikropartikel (Luminex) Assay oder durchflusszytometrisch. Bei immunisierten Patienten erfolgt in der Regel eine Testung der HLA-Antikörperspezifität mittels LCT und Festphasentestung.

Das Ergebnis dieser Untersuchungen der Antikörper wird anschließend in der zentralen Datenbank der überregionalen Transplantationsorganisation (z.B. bei Eurotransplant) registriert und bei der Vergabe von Organen entsprechend dem Organtyp berücksichtigt. Von allen HLA-Alloantikörper positiven Patienten werden Serumproben innerhalb der verschiedenen Transplantationslaboratorien und Länder ausgetauscht, die für eine serologische leukozytäre Verträglichkeitsprobe (Crossmatch) im 24-Stunden-Bereitschaftsdienst vorgehalten werden. Entsprechende Serumproben von HLA-Alloantikörper negativen Empfängern stehen in den regionalen Laboratorien zur Verfügung. Diese aufwendige Logistik in der Diagnostik und Bereitstellung von Serumproben für die Beurteilung der Organverträglichkeit ermöglicht durch die gezielte Auswahl HLA-kompatibler Organempfänger eine deutliche Verbesserung des Transplantatüberlebens.

26.3.2 Blutstammzell-Transplantation

Die Blutstammzell-Transplantation stellt eine besondere Anforderung an die immunologische Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger dar. Therapeutische Endstrecke der Blutstammzell-Transplantation ist in der Regel die vollständige Entfernung eines erkrankten leukämischen Knochenmarkes und der Ersatz durch ein gesundes Blutstammzell-Transplantat eines Spenders. Praktische Konsequenz ist ein chimärer Patient, dessen Immunsystem und blutbildendes System ausgetauscht ist. Insbesondere das transplantierte neue Immunsystem muss daher möglichst perfekt zu dem Empfänger passen, um schwere häufig auch letal verlaufende Abstoßungen zu vermeiden (Tab. 26-7 – Indikation und Stadien für eine erweiterte molekularbiologische HLA-Bestimmung zur Vorbereitung einer allogenen Ersttransplantation von blutbildenden Stammzellen).

Im Gegensatz zur Organtransplantation, bei der eine Abstoßung des Transplantates durch das Immunsystem des Empfängers vermittelt wird (Empfänger gegen Wirt-Reaktion, Host-versus-graft (HvG)-reaction), kommt es bei der Blutstammzell-Transplantation zu einer Aktivierung des Transplantates gegen den Empfänger (Graft-versus-host (GvH)-reaction). Neben der GvH-Reaktion findet sich auch eine HvG-Reaktion, die jedoch aufgrund der intensiven Vorbehandlung (Konditionierung) des Patienten mit dem Ziel der Entfernung der eigenen Blutstammzellen weitaus geringer ausgeprägt ist. Die Folge einer solchen GvH-Reaktion ist der Angriff körpereigener Strukturen, wie z.B. Darm, Haut, Schleimhäute, Leber durch das transplantierte fremde Immunsystem. Je nach Intensität kann dies zu Organversagen und in Folge der Schleimhautveränderungen zu schweren exsudativen Darmentzündungen gefolgt von Infektionen führen.

Mäßig ausgeprägte GvH-Reaktionen werden jedoch auch bei HLA kompatiblen Spendern beobachtet und sind durchaus vorteilhaft. Diese Reaktionen sind klinisch kontrollierbar und bewirken einen Schutz gegen Rezidive der Grunderkrankung durch einen Angriff der transplantierten Immunzellen gegen verbliebene leukämische Zellen (Graft-versus-leukemia (GvL) reaction) des Patienten.

Der ausgeprägte Polymorphismus des HLA-Systems stellt besondere Anforderungen an die Auswahl eines HLA-kompatiblen Spenders von Blutstammzellen. Der ideale Spender ist ein HLA genotypisch identisches Individuum. Dieses findet sich auf Grund der Vererbungsregeln bei 25 % der Geschwister eines erkrankten Patienten. Zur Festlegung der Genotypen (Stammbaum) werden in diese Untersuchung neben den Geschwistern auch die Eltern mit einbezogen. Wird in dieser Kernfamilie kein genotypisch identischer Spender ermittelt, kann die Untersuchung auf weitere Familienangehörige, d.h. Onkel/Tanten, Cousinen/Cousins ausgedehnt werden. Hierbei findet sich nur in seltenen Fällen noch ein HLA kompatibler Spender. Die Suche nach einem HLA kompatiblen Spender wird daher bei fehlendem Spender aus der Kernfamilie sofort durch Suche nach einem HLA kompatiblen nicht verwandten freiwilligen Blutstammzellspender weitergeführt.

Die Fortschritte in der immungenetischen Auswahl und der Therapie von Nebenwirkungen der Transplantation von Blutstammzellen haben dazu geführt, dass die Ergebnisse einer Transplantation zwischen genetisch HLA identischen Geschwistern/Verwandten und nicht verwandten Spendern vergleichbar gut sind.

Grundsätzlich gilt jedoch, dass bei nicht verwandten Spendern aufgrund der fehlenden Familienuntersuchung lediglich eine phänotypische HLA-Übereinstimmung vorliegt. Der Umfang der HLA-Untersuchung ist daher deutlich größer, um HLA-Kompatibilität zu gewährleisten. Praktisch bedeutet dies, dass bei allen nicht verwandten Blutstammzellspendern eine hochauflösende (4-stellige, z.B. HLA-A*02:01,03:01) molekularbiologische Bestimmung der Merkmale des HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 und HLA-DQB1 Genlocus gefordert ist /39/. Auf Grund des enormen Polymorphismus müssen hierfür komplexe und aufwendige molekularbiologische Untersuchungstechniken (z.B. durch Sequenzierung bzw. erweiterte Hybridisierungs- und oder Amplifikationstechniken) eingesetzt werden.

Klinisch erfolgt die Bewertung der HLA-Kompatibilität der fünf relevanten Loci als Übereinstimmung in 10/10 der untersuchten Allele (jeweils 2 Alle pro HLA-Locus). In die erweiterte Bewertung der HLA-Kompatibilität werden teilweise auch die HLA-Merkmalskonstellation der HLA-Klasse I (insbesondere HLA-C-Locus) Merkmale und die Bestimmung von NK-Zellrezeptoren (KIR) mit einbezogen /40, 41/. In diesen Fällen kann eine differente HLA-Konstellation zwischen Spender und Empfänger im Kontext der NK-/T-Zell vermittelten Immunantwort einen positiven Effekt auf das Überleben nach Transplantation von Stammzellen ausüben /42, 43/.

Insgesamt sind weltweit über 17 Millionen freiwillige Spender von Blutstammzellen (davon in Deutschland mehr als 4 Millionen) registriert, so dass für 80–90 % der Patienten mit hämatologischen Erkrankungen, die keine verwandten Spender haben, nicht verwandte HLA-kompatible Spender gefunden werden durch das Bone Marrow Donor World Wide Registry (BMDW) und das Zentrale Knochenmarkspender Register Deutschland (ZKRD). Die Heilungsrate (über 5-Jahres-Rezidivfreiheit) für leukämische Erkrankungen beträgt, abhängig von der Grunderkrankung, dem Erkrankungsstadium und der Altersgruppe 30–90 %. Für die Behandlung von genetischen Defekten, wie z.B. Hämoglobinopathien (z.B. homozygote Formen der β-Thalassämie) konnten Erfolgsraten von über 90 % erzielt werden. Bei primären Immundefizienzen (z.B. SCID) finden sich ähnlich hohe Überlebensraten, insbesondere wenn die Blutstammzelltransplantation bei Patienten durchgeführt wird, die nicht bereits schwere Infektionen infolge der Grunderkrankung durchlaufen haben.

26.3.3 Transfusionsmedizinische Relevanz und Diagnostik

Transfusionsmedizinisch kommt den Merkmalen des HLA-Systems eine Bedeutung in der differentialdiagnostischen Erkennung von Nebenwirkungen und bei der Applikation von zellulären Komponenten zu. Im Vordergrund steht die unerwünschte Alloimmunisierung nach Transfusion mit Blutkomponenten, die einen Restgehalt an Leukozyten aufweisen. Dieser ist aufgrund der Herstellungsverfahren durch Differentialzentrifugation mit anschließender Trennung von Blutkomponenten (Erythrozyten, Plasma,Thrombozyten) aus Vollblut unumgänglich.

Die Einführung der In-Line-Leukozytenfiltration zellulärer Blutkomponenten (Erythrozyten und Thrombozyten) sowie der Einsatz von vergleichbaren Filtersystemen für die Plasmaherstellung haben bereits zu einer deutlichen Reduktion in der Rate von Alloimmunisierungen geführt. Als kritischer Wert für die Bildung zytotoxischer Antikörper wird ein Leukozytengehalt von 5 × 10⁶ (CILL, Concentration of immunogenic leukocyte load) betrachtet.

Moderne Filtersysteme für Leukozyten oder Apherese-Verfahren zur Gewinnung von Blutkomponenten reduzieren den Restgehalt von Leukozyten auf unter 1 × 10⁶/Präparat und liegen somit deutlich unter dem kritischen CILL-Wert. Dennoch können z.B. Transfusionen von Thrombozyten bei Patienten mit einer vorausgegangenen Immunisierung ein Wiederauftreten von HLA-Antikörpern bewirken /44, 45/.

HLA-Antikörper sind neben Antikörpern gegen Granulozyten (Human neutrophile antibodies, HNA) auch verantwortlich für die immunologische Form der Transfusions assoziierten akuten Lungeninsuffizienz (TRALI). Um diese teilweise schwer oder sogar letal verlaufende Nebenwirkung einzugrenzen hat der Deutsche Arbeitskreis Blut eine Empfehlung (Votum) und die Bundesoberbehörde (Paul-Ehrlich-Institut) einen Maßnahmenkatalog (Stufenplan) verabschiedet, der durch Befragung oder Testung von Spendern die Transfusion von HLA/HNA Antikörper haltigen Blutkomponenten verhindern soll.

26.3.3.1 Thrombozytentransfusion

Thrombozyten exprimieren neben den Antigenen von Blutgruppen (insbesondere des ABH-Systems), die Antigene des Glykoproteinrezeptor-Systems (Human platelet antigens, HPA), und auch HLA-Klasse-I-Merkmale auf ihrer Zelloberfläche. AB0-inkompatible Thrombozytengaben (z.B. A auf 0) führen, aufgrund der schwachen Ausprägung der AB0-Merkmale, nur in seltenen Fällen zu einer verkürzten Wiederfindungsrate (Recovery). Akute und hämolytische Transfusionsreaktionen treten in der Regel nicht auf, eine serologische erythrozytäre Kreuzprobe ist daher nicht erforderlich. Wegen der geringen Mengen an verbliebenen Erythrozyten im Thrombozytenkonzentrat sollte jedoch nach Möglichkeit bei der Auswahl der Rhesusfaktor D berücksichtigt werden.

Klinische bedeutsam bei der Alloimmunisierung sind Antikörper gegen HLA-Klasse-I-Antigene sowie Humane Plättchen Antigene (Human platelet antigens, HPA) /46/. Klinisch imponiert die Alloimmunisierung durch eine deutliche Reduzierung des erwarteten therapeutischen Thrombozytenanstieges nach Transfusion infolge massiven Thrombozytenabbaus (Refraktärzustand). Refraktärzustände werden häufig bei Patienten gesehen, die wiederholt oder über einen längeren Zeitraum mit Thrombozyten versorgt werden, z.B. in Folge einer Chemotherapie oder Transplantation mit Blutstammzellen. Weiterhin sind insbesondere Frauen mit vorausgegangenen Schwangerschaften davon betroffen.

Der Refraktärzustand wird durch ein wiederholtes (mindestens 2-maliges) Ausbleiben eines Anstiegs der Thrombozyten unter Berechnung des korrigierten Inkrementes (KI) wie folgt definiert:

Bei einem KI < 5 × 10⁹/l nach 1 Stunde wird von einem Refraktärzustand ausgegangen.

Differentialdiagnostisch sollten bei einem Refraktärzustand neben immunologischen Ursachen aufgrund von Alloantikörpern gegen HLA- oder HPA-Antigene auch nicht-immunologische Auslöser (z.B. Fieber, Sepsis, antibiotische Therapie, disseminierte intravasale Gerinnung und Splenomegalie) bewertet werden. Sind HLA- und/oder HPA-Antikörper nachweisbar, sollte möglichst ein HLA- bzw. HPA- kompatibler Thrombozytenspender gefunden werden. Hierzu ist in einigen transfusionsmedizinischen Abteilungen eine große Anzahl von HLA- bzw. HPA-.typisierten Spendern registriert, die im Bedarfsfall als Thrombozytenspender herangezogen werden können. Eine serologische leukozytäre Untersuchung auf Verträglichkeit (Crossmatch) kann insbesondere bei nicht vorhandener HLA-Identität zwischen Spendern und Empfänger zur weiteren Abschätzung des Transfusionserfolges heran gezogen werden.

26.3.3.2 Granulozytentransfusion

Die Granulozytentransfusion hat durch die Möglichkeit der Vorbehandlung des Spenders mit Wachstumsfaktoren für Granulozyten (G-CSF, Neupogen) und der damit verbundenen deutlichen Steigerung des Gehaltes an Granulozyten in Präparaten, die durch Aphereseverfahren gewonnen werden, an Bedeutung gewonnen /47, 48/. Indikationen für Granulozytentransfusionen bestehen bei Patienten mit progredienten Infektionen und schwerer Neutropenie von weniger als 0,5 × 10⁹/l neutrophiler Granulozyten sowie als prophylaktische Therapie bei Granulozytopenien mit hohem Risiko für das Auftreten von lebensbedrohlichen Bakterien- oder Pilzinfektionen. Weiterhin können Patienten mit seltenen angeborenen Funktionsstörungen der Granulozyten bei progredienten Infektion von Transfusionen mit Granulozyten profitieren /49/.

Aufgrund des großen Anteils an Erythrozyten in den Konzentraten von Granulozyten muss das AB0-System einschließlich einer prospektiven serologischen erythrozytären Kreuzprobe berücksichtigt werden. Vorteilhaft ist ebenfalls eine Rhesus (D)-Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger. Weiterhin sollte zur Beurteilung der Verträglichkeit ein leukozytäres Crossmatch durchgeführt werden sowie eine Untersuchung auf leukozytäre Antikörper vor und im Verlauf der Behandlung erfolgen. Die Beurteilung der leukozytären Verträglichkeit dient insbesondere zur Vermeidung von Nebenwirkungen in Form von febrilen nicht hämolytischen Transfusionsreaktionen, pulmonalen Reaktionen und der Vermeidung von Refraktärzustanden. Granulozyten müssen vor der Anwendung bestrahlt werden. Die Bestrahlung erfolgt mit einer mittleren Dosis von 30 Gy.

Refraktärzustande nach Gabe von Granulozytenkonzentraten können neben nicht-immunologischer Ursachen, z.B. Fieber, Sepsis, Splenomegalie, durch Alloimmunisierung des Empfängers gegen HLA-Antigene und Granulozyten spezifische Antigene bedingt sein. Zur Beurteilung eines Refraktärzustandes sollte das Inkrement 4–8 g nach Gabe des Granulozytenkonzentrats (1,5–3,5 × 10⁸ Granulozyten/kg Körpergewicht) herangezogen werden. Ein Inkrement unter 500 × 10⁶/l, insbesondere bei Patienten ohne klinischen Hinweis auf nicht immunologische Ursachen, weist auf einen Refraktärzustand infolge einer Alloimmunisierung hin.

26.3.3.3 Febrile nicht hämolytische Transfusionsreaktionen (FNHTR)

Die Ursachen einer febrilen nicht hämolytischen Reaktion auf eine Transfusion sind neben Antikörpern des Empfängers gegen kontaminierende Leukozyten in der zellulären Blutkomponente (Thrombozyten-, Erythrozyten- und Granulozytenkonzentrate) vor allem während der Lagerung freigesetzte Zytokine. Aufgrund der klinischen Symptomatik mit Fieber, Schüttelfrost und moderater Dyspnoe sollten neben der Abgrenzung zum hämolytischen Transfusionszwischenfall, insbesondere das Vorliegen von Alloantikörpern gegen HLA und/oder HPA (Thrombozyten) und/oder HNA (Granulozyten) untersucht werden.

26.4 HLA-Typisierung und HLA-Antikörper

Die Bestimmung von HLA-Merkmalen basiert auf serologischen und molekularbiologischen Methoden. Grundlage der serologischen Bestimmung ist der von Paul Terasaki entwickelte Lymphozytotoxizitäts-Test, der mittels Antikörpern (Antiseren) entsprechende HLA-Antigene nachweist. Dieses Verfahren eignet sich auch in umgekehrter Anwendung zum Nachweis von HLA-spezifischen Antikörpern und findet aufgrund seiner relativen Einfachheit und Robustheit Anwendung in der Basisdiagnostik zum Nachweis von HLA-spezifischen Antikörpern sowie als Standardmethode für die serologische leukozytäre Kreuzprobe (Crossmatch).

Die Anwendung serologischer Verfahren zum Nachweis von HLA-Klasse-II-Merkmalen ist auf Grund der geringen Nachweismöglichkeit, mangels ausreichender Antiseren, durch molekularbiologische Verfahren weitgehend ersetzt worden. Ebenso diese Verfahren zum Nachweis von HLA-Klasse-I-Merkmalen einen Einzug in die Routinediagnostik gefunden. Die Einführung von molekularbiologischen Verfahren hat auch zur Reduzierung der Bedeutung von zellulären Techniken der Typisierung geführt. Die gemischte Lymphozytenkultur (Mixed lymphocyte culture, MLC) ist vollständig durch eine molekulargenetisch Feinanalyse (hochauflösend) der HLA-Klasse-II-Merkmale in der diagnostischen Beurteilung der Gewebeverträglichkeit verdrängt worden. Im Folgenden werden wesentliche serologische und molekularbiologische Untersuchungstechniken dargestellt.

26.4.1 Serologische HLA-Typisierung mittels des Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test (Standard-NIH-Methode)

Prinzip

Der Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test beruht auf der Komplement vermittelten Zytolyse von Lymphozyten durch HLA spezifische Antikörper /50/. Voraussetzung für die Bindung des Antikörpers ist das Vorhandensein des entsprechenden Antigens auf der Zellmembran des Lymphozyten. Die Durchführung des Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Tests ist Komplement abhängig (Complement dependent cytotoxicity (CDC) test) und bildet die Grundlage für die serologische Bestimmung von HLA-Klasse-I/II-Merkmalen sowie des Nachweises von HLA-Antikörpern. Hierbei werden die Komplementfaktoren durch Immunkomplexe von IgG (IgG₁, IgG₂, IgG₃) und IgM aktiviert und vermitteln nachfolgend eine Zytolyse von Lymphozyten durch HLA spezifische Antikörper. Die zytotoxisch geschädigte Zellmembran wird durchlässig für bestimmte Farbstoffe, z.B. Eosin oder Acridin-Orange/Ethidiumbromid (Fluorescein).

Die Verwendung von immunmagnetischen Beads ermöglicht eine schnellere, saubere und spezifische T- oder B-Zelltrennung für die Typisierung von HLA-Klasse-I (T-Zellen)- oder HLA-Klasse-II (B-Zellen) unter Verwendung von Fluoreszenz-Lösungen. IMB sind supermagnetische Polystyrolkügelchen, an die anti-CD2 monoklonale Antikörper gebunden sind. Die verwendeten Antiseren sind überwiegend polyklonal humanen Ursprungs. Es stehen jedoch auch einige monoklonale Antiseren zur Verfügung.

26.4.1.1 Indikation

Autoimmunerkrankungen mit HLA-Assoziation, Organtransplantation, Blutstammzelltransplantation, Thrombozytenrefrakterität, Voruntersuchung von Blutstammzellspendern, forensische Untersuchungen.

26.4.1.2 Untersuchungsmaterial

Lymphozyten, in der Regel aus peripherem Vollblut (mit Heparin, ACD oder CPDA antikoaguliert). Transport bei Raumtemperatur für maximal 3 Tage ab Entnahmezeitpunkt (in der Regel sollte das Material innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden). In Abhängigkeit von der Zellzahl wird ein Mindestvolumen von 5 ml benötigt.

26.4.1.3 Bestimmungsmethode

Terasaki-Platten (72 Kavitäten) werden mit Öl-beschichtet. Anschließend werden in jede Kavität 1 μl Antiserum getropft. Die Wahl der unterschiedlichen Antiseren ist von den zu bestimmenden HLA-Antigenen abhängig. Die Isolierung der zu untersuchenden Lymphozyten erfolgt durch Dichtegradienten-Zentrifugation oder immunomagnetische Beads. Anschließend werden 1 μl (ca. 2.000 Lymphozyten) der Zellaufschwemmung in jede Kavität gegeben. Darauf achten, dass sich Antiserum und Zellsuspension gut mischen und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Nachfolgend Zugabe von 5 μl Komplement und 60 min Inkubation bei Raumtemperatur. Zugabe von 5 μl Farbstoff (Eosin- oder Fluoreszenz-Lösung) und bei Verwendung von Eosin zusätzlich Zugabe von 5 μl Formalin zum Abstoppen der Reaktion. Die Reaktionen können dann unter dem Mikroskop abgelesen werden.

26.4.2 Molekularbiologische Bestimmung der HLA-Merkmale

Die molekularbiologischen Verfahren der Bestimmung von HLA beruhen auf dem direkten Nachweis von allel- oder gruppenspezifischen Sequenzunterschieden der untersuchten HLA-Genorte nach Amplifikation von genomischer DNA mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Bedingt durch die strukturellen Unterschiede der HLA-Moleküle werden zum Nachweis der polymorphen Sequenzposition bei der Bestimmung der HLA-Klasse-I- Merkmale in der Regel die Bereiche von Exon 2 und 3 (evtl. auch Exon 1 und 4), bei HLA-Klasse-II-Merkmalen die Untersuchung von Exon 2 (evtl. auch Exon 1, 3 und 4) in die Bewertung einbezogen. Für die Routinediagnostik haben sich Nachweisverfahren mittels Sequenz-spezifischer Oligonukleotide (SSO) oder Sequenz-spezifischer Primer (SSP) bewährt. Zusätzlich findet insbesondere für die hochauflösenden (4-stellige) HLA-Typisierung die direkte Sequenzierung genomischer DNA (Sequence-based-typing, SBT) Anwendung.

26.4.2.1 SSO (Sequenz-spezifische Oligonukleotid) HLA-Typisierung

Nachweis von Allel- und Gruppen-spezifischen Variationen der Sequenz durch Hybridisierung mit kurzen synthetischen DNA Sonden, sogenannten Oligonukleotiden. Basenunterschiede zwischen einzelnen Allelen oder Allelgruppen werden für die Auswahl der Oligonukletid-Sonden genutzt.

26.4.2.1.1 Indikation

Autoimmunerkrankungen mit HLA-Assoziation, Organtransplantation, Thrombozytenrefraktärität, Voruntersuchung von Blutstammzellspendern, forensiche Untersuchungen.

26.4.2.1.2 Untersuchungsmaterial

Peripheres venöses Vollblut antikoaguliert mit EDTA (Mindestmenge abhängig von Zellzahl und Vitalität ca. 1 ml), ansonsten alle Arten von kernhaltigen Zellen einschließlich Gewebeproben, die zur DNA-Isolation geeignet sind. Lagerung und Transport von Zellen bei Raumtemperatur.

26.4.2.1.3 Bestimmungsmethode

Aus Gewebe oder peripheren Vollblut isolierte genomische DNA wird mittels einer Genort spezifische PCR amplifiziert. Die Amplifikation erfolgt zum späteren Reaktionsnachweis mittels eines Biotin-markierten 5’-Primers. Anschließend wird die DNA in ihre Einzelstränge denaturiert. Im DOT-Blot Verfahren werden die amplifizierten DNA Fragmente anschließend räumlich getrennt auf eine Membran (Nitrozellulose oder Nylon) übertragen. Die Differenzierung der HLA-Merkmale erfolgt durch Hybridisierung mit den unterschiedlichen Oligonukleotid-Sonden.

Bei dem ebenfalls verwendeten Verfahren der reversen Hybridisierung sind die unterschiedlichen Oligonukleotid-Sonden in Umkehrung des DOT-Blot-Verfahrens parallel getrennt auf einem Membranstreifen immobilisiert oder in unterschiedlichen Kavitäten einer Elisa-Platte vorgelegt. Alternativ können die Sonden auch auf Mikropartikeln (sog. Micro beads oder Luminex beads) aufgebracht sein, die sich durch unterschiedliche Fluoreszenzemission in einer Art Durchflußzytometer (Luminex-Analyser) nachweisen lassen. Eine Weiterentwicklung des klassischen reversen- DOT-Blot Verfahrens ist der Einsatz von Sonden, die in Mikrowellplatten eng nebeneinander aufgebracht werden. Diese Spots bestehen aus einzelnen oder Kombinationen von zwei oder mehreren Sonden (sog. Mosaik-Sonden).

Die Genort spezifisch amplifizierten DNA-Fragmente werden anschließend hinzugegeben. Die Hybridisierung erfolgt durch komplementäre Anlagerung von Oligonukleotid und DNA-Zielsequenz. Die Spezifität wird durch anschließende Waschschritte gewährleistet. Die Detektion erfolgt mittels einer Farbreaktion. Hierzu wird z.B. nach Hybridisierung Streptavidin gekoppelt mit alkalischer Phosphatase hinzugegeben. Streptavidin bindet an die Biotin-markierten DNA- Fragmente, die auf den Nitrozellulosestreifen oder Mosaik-Spot hybridisiert sind und ermöglicht eine Violett/braun-Verfärbung nach Inkubation mit einem chromogenen Substrat (BCIP/NBT). Alternativ können mit FITC-markierte SSO-Sonden verwendet werden, die durch FITC-spezifische Antikörperfragmente, die mit Meerrettich-Peroxidase (POD) gekoppelt sind, in einer Farbreaktion mittels Elisa-Reader oder Spot-Fotoprozessor nachgewiesen werden.

Der zeitliche Aufwand für eine solche Typisierung liegt je nach Typisierungsformat und Auflösung (2- oder 4-stellige Typisierung) zwischen einem bis mehreren Tagen (Dot-Blot-Verfahren) oder wenigen Stunden (reverses Dot-Blot-Verfahren). Das SSO-Typisierungsverfahren eignet sich insbesondere zur Automatisierung und ermöglicht einen großen Probendurchsatz. In der Notfalldiagnostik, wie sie insbesondere bei der Organtransplantation benötigt wird ist sie jedoch dem SSP-Typisierungsverfahren unterlegen.

26.4.2.1.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

DNA-Verunreinigung durch Proteine, Kontamination mit Fremd-DNA. Verunreinigungen der DNA durch PCR-Inhibitoren wie Hämoglobin, Heparin, Äthanol können empfindliche Störungen der PCR zur Folge haben. Kreuzreaktion von Oligonukleotiden können mangels unzureichend stringender Waschbedingungen oder Sequenzhomologien vorkommen.

26.4.2.2 SSP (Sequenz-spezifischer Primer) HLA-Typisierung

Die Durchführung des Tests basiert auf der Amplifikation von HLA-spezifischen Genabschnitten mittels der PCR unter Verwendung von Sequenz-spezifischen Primern. Innerhalb der Zielsequenz der Primer befindet sich eine allel- oder gruppenspezifische polymorphe Sequenzposition. Diese Methode nutzt die Tatsache, dass für eine erfolgreiche Reaktion beide Primer, speziell am sogenannten 3’-Ende, keine Fehlpaarungen aufweisen dürfen. Somit führt nur eine vollständige Übereinstimmung der Primer mit der Zielsequenz zu einem Amplifikat. Liegt die mit dem Primer nachzuweisende allelische Sequenz nicht vor, kann der Primer auf Grund der Fehlpaarung nicht binden und kein Amplifikat nachgewiesen werden.

26.4.2.2.1 Indikation

Autoimmunerkrankungen mit HLA-Assoziation, Organtransplantation (einschließlich Notfalltypisierung im Bereitschaftsdienst), Thrombozytenrefraktärität, Voruntersuchung von Blutstammzellspendern, forensiche Untersuchungen.

26.4.2.2.2 Untersuchungsmaterial

26.4.2.2.3 Bestimmungsmethode

Nach Isolation genomischer DNA, werden 50–200 μg DNA je PCR-Ansatz verwendet. Die Zahl der für eine HLA-Typisierung benötigten PCR-Ansätze ist abhängig von dem Auflösungsgrad (2 oder 4-stellig) und der Zahl der untersuchten Genorte. Die eingesetzten Primerpaare sollten jedoch so gewählt sein, dass die verschiedenen PCRs unter gleichen Temperaturbedingungen ablaufen können. Der Nachweis der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgt anschließend mit Hilfe einer Agarosegel-Elektrophorese. Eine erfolgreiche Amplifikation erzeugt ein DNA-Fragment von definierter Länge, das im Gel als Bande erkennbar ist. Findet keine Amplifikation statt, fehlt diese Bande. Es wird daher in jedem PCR-Ansatz eine interne Amplifikationskontrolle als Koamplifikation eines nicht-polymorphen Genabschnitts (z.B. humanes Wachstunhormon-Gen) durchgeführt.

26.4.2.2.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

DNA-Verunreinigung durch Proteine, Kontamination mit Fremd-DNA. Verunreinigungen der DNA durch PCR-Inhibitoren wie Hämoglobin, Heparin, Äthanol können empfindliche Störungen der PCR zur Folge haben. Primerfehlpaarung können durch Sequenzhomologien oder unzureichende Annealingtemperatur entstehen.

26.4.2.3 HLA-Typisierung durch direkte Sequenzierung

Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach HLA-Genort spezifischer Amplifikation genomischer DNA. Testprinzip ist die Kettenabbruch-Reaktion nach Sanger mittels ddNTP’s.

Indikation: Hochauflösende Typisierung vor Transplantation von Blutstammzellen oder zur Riskoabschätzung bei Autoimmunerkrankungen mit HLA-Subtyp relevanter Assoziation.

26.4.2.3.1 Indikation

Hochauflösende Typisierung vor der Transplantation von Blutstammzellen oder Risikobestimmung einer Autoimmunerkrankung vermittels der HLA-Typisierung.

26.4.2.3.2 Untersuchungsmaterial

Peripheres venöses Vollblut antikoaguliert mit EDTA (Mindestmenge abhängig von Zellzahl und Vitalität ca. 1 ml), ansonsten alle Arten von kernhaltigen Zellen einschließlich Gewebsproben, die zur DNA-Isolation geeignet sind. Lagerung und Transport von Zellen bei Raumtemperatur.

26.4.2.3.3 Bestimmungsmethode

Die Sequenzierung erfolgt mittels PCR unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten Kettenabbruch-Nukleotiden (ddNTPs; ddAdenin, ddGuanin, ddCytosin, ddThymin). Bestimmte Techniken ermöglichen es, jedes ddNTP mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff zu markieren und die nach Abschluss der Sequenzierungsreaktion erhaltenen Fluoreszenz markierten Fragmente mittels Polyacrylamid- oder Kapillarpolymer-Gelelektrophorese ihrer Länge nach aufzutrennen. Die Registrierung der Fluoreszenzemissionen und Festlegung der Basenpaarabfolge der erhaltenen Sequenz erfolgt in der Regel durch ein automatisiertes und Computer gestütztes Auswertesystem. Die abschließende HLA-Allelbestimmung wird durch einen Vergleich der erhaltenen Sequenz mit in Sequenzdatenbanken gespeicherten Sequenzen ermöglicht.

26.4.2.3.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

DNA-Verunreinigung durch Proteine, Kontamination mit Fremd-DNA. Verunreinigungen der DNA durch PCR-Inhibitoren wie Hämoglobin, Heparin, Äthanol können empfindliche Störungen der PCR zur Folge haben. Primerfehlpaarungen können durch Sequenzhomologien oder unzureichender Annealing-Temperatur vorkommen.

26.4.3 HLA-Antikörpernachweis und serologische leukozytäre Kreuzprobe (Crossmatch)

HLA-Antikörper können gegen HLA-Klasse-I-Merkmale und auch gegen HLA-Klasse-II-Merkmale gebildet werden und sind in der Regel IgG-Antikörper. Nur nach Antigenexposition können auch vorübergehend IgM-Antikörper beobachtet werden. HLA-Antikörper bilden sich infolge von Schwangerschaften, Bluttransfusionen und Transplantationen. Eine Trennung HLA-spezifischer Antikörper von Autoantikörpern in der Diagnostik ist entscheidend, da Autoantikörper mit autologen Zellen (Patienten eigenen Zellen) und mit Spenderlymphozyten einen positiven Antikörpernachweis oder eine positive Kreuzprobe verursachen können und solche Antikörper für die Organtransplantation irrelevant sind.

Üblicherweise gehören Autoantikörper der IgM-Klasse an und sind natürliche oder bei bestimmten Erkrankungen vorkommende Lymphozytotoxine /51/. Zerstört man ihre Pentamerstruktur mit Dithiothreitol (DTT), so verlieren sie ihre zytotoxische Aktivität. Die HLA spezifischen IgG-Alloantikörper werden durch Behandlung mit DTT nicht beeinträchtigt. Patienten mit dem Verdacht auf Autoantikörper sollten daher in einem autologen Crossmatch Ansatz sowie im Crossmatch gegen ein anderes Individuum (z.B. Kadaverspender) unter Zusatz von DTT getestet werden.

Folgende Kriterien können auf Autoantikörper hindeuten /52/:

Schwach positive Ergebnisse beim Screening ohne erkennbare Spezifität
Nachgewiesene IgM-Antikörper im DTT Screening
Patientenseren mit schon nachgewiesenem Autoantikörper. Es ist empfehlenswert, das Serum solcher Patienten mindestens einmal pro Jahr auf Autoantikörper zu testen.

Eine Unterscheidung zwischen IgM-Autoantikörpern und HLA-spezifischen IgM-Alloantikörpern ist hierdurch ebenfalls möglich. HLA-IgM-Autoantikörper reagieren im autologen Crossmatch negativ und sollten in der Antikörperdifferenzierung eine HLA-Spezifität zeigen.

Klinisch relevant sind HLA-Klasse-I-Antikörper und HLA–Klasse-II-Antikörper der IgG-Klasse /53/. Ein negativer Einfluss für den Verlauf nach Organtransplantation besteht bei vorsensibilisierten Patienten (Collaborative Transplant Study).

26.4.3.1 Antikörpernachweis mittels Mikrolymphozytotoxizitäts-Test

Prinzip: Der Mikrolymphozytotoxizitätstest beruht auf der Komplement-vermittelten Zytolyse von Lymphozyten durch HLA spezifische Antikörper (Antiseren) und entspricht der zur HLA-Klasse I/II Typisierung verwendeten Methodik. Siehe Beitrag 26.4.1 – Serologische HLA-Typisierung mittels des Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test.

26.4.3.1.1 Indikation

Organtransplantation, Thrombozytenrefraktärität, Voruntersuchung von lediglich partiell HLA-kompatiblen Blutstammzellspendern, Transfusionzwischenfälle (febrile nicht-hämolytische Transfusionsreaktion), Granulozytentransfusion.

26.4.3.1.2 Untersuchungsmaterial

Serum; Transport bei Raumtemperatur für maximal 5 Tage ab Abnahmezeitpunkt (in der Regel sollte das Material innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden) ansonsten Transport bei mehr als –20 °C. Lagerung bei mehr als –25 °C für mehrere Jahre. In Abhängigkeit von der Untersuchung wird ein Volumen von 5 ml benötigt. Aufgrund der Vorgabe Aliquots von Antikörper-positiven Seren innerhalb des Organtransplantationsverbundes (z.B. Eurotransplant) an eine Vielzahl von Laboratorien der unterschiedlichen nationalen und europäischen Transplantationszentren zu versenden, sollte bei Patienten auf der Warteliste für eine Organtransplantation die Mindestmenge bei 10 ml Serum liegen.

26.4.3.1.3 Bestimmungsmethode

Entspricht dem Standard-Mikrolymphozytotoxizitätstest. Zur Spezifizierung der Antikörperreaktivität werden jedoch Lymphozytensuspensionen von verschiedenen Individuen mit bekanntem HLA-Phänotyp eingesetzt (sogenanntes Zellpanel). Dieses Zellpanel (in der Regel 50 verschiedene Individuen) wird entweder frisch durch Entnahme von Blut bekannter Spender hergestellt oder kann auch in Form von tief gefrorenen Zellen aufbewahrt werden. Alternativ zu Lymphozyten gesunder Spender können auch Suspensionen von Lymphozyten von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie eingesetzt werden.

26.4.3.1.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

Komplementaktivität, Spezifität und Kreuzreaktivität der Antiseren, Autoantikörper

26.4.3.2 Antikörpernachweis mittels ELISA-Verfahren

Die eingesetzten Verfahren verwenden lösliche HLA-Antigene, die es ermöglichen über eine Enzym-Substrat-Reaktion HLA-Klasse-I-Antikörper und HLA-Klasse-II-Antikörper im Patientenserum nachzuweisen. Im Unterschied zum Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test können IgG- oder IgM-Antikörper, unabhängig von ihrer Eigenschaft Komplement zu binden, in getrennten Testansätzen erfasst werden.

26.4.3.2.1 Indikation

Wie unter serologischem Antikörpernachweis.

26.4.3.2.2 Untersuchungsmaterial

Wie unter serologischem Antikörpernachweis.

26.4.3.2.3 Bestimmungsmethode

Entsprechend der unterschiedlichen kommerziellen Testformate werden für das Screening von Antikörpern häufig Mischungen aus verschiedenen löslichen Antigenen, die eine Unterscheidung zwischen Antikörper positiv und Antikörper negativ ermöglichen verwendet. Zur Differenzierung der Antikörper sind die verschiedenen HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Antigenextrakte einzelner Individuen in den Kavitäten einer ELISA-Platte getrennt vorgelegt. Bei der Zugabe von Patientenserum, das spezifische HLA-Antikörpern enthält, werden in einem gebildeten Antigen-Komplex die gebundenen Anti-HLA-IgG -Antikörper oder HLA-IgM-Antikörper mit einem konjugierten anti-Human-IgG- oder anti-Human-IgM-Antikörper sichtbar gemacht. Durch die Verwendung von z.B. alkalischer Phosphatase und 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) wird eine einfache Identifizierung (Blau bei 630 nm) möglich.

26.4.3.2.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

Wichtig sind die Konformität der löslichen Antigene, deren Spezifität und keine Kreuzreaktivität der Antikörper.

26.4.3.3 Antikörpernachweis mittels Mikropartikel (Luminex Mikro-Beads)

Grundlage dieses Verfahrens sind mikroskopisch kleine Polystyrolpartikel, so genannte Mikro-Beads, die analog zum ELISA als Festphase dienen. Die Mikro-Beads sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Rot und Infrarot) gefärbt, die in unterschiedlichen Bereichen des optischen Spektrums emittieren. Die Kombination dieser beiden Farbstoffe in jeweils zehn verschiedenen Konzentrationsstufen führt zu einhundert spektral unterscheidbaren Schattierungen von Rot und Infrarot. Jede der daraus resultierenden Intensitäten der Fluoreszenzi definiert eine Population von Mikro-Beads, die als Basis für unterschiedliche Testformate dienen. Neben dem Nachweis und der Spezifizierung von HLA-Antikörpern, werden Mikro-Bead (Luminex-basierte Testformate auch für die HLA-Typisierung eingesetzt. Siehe Beitrag 26.4.2.1 – Sequenz-spezifische Oligonukleotid HLA-Typisierung.

Im Falle des Nachweises von HLA-Antikörpern erfolgt die Beschichtung der Mikro-Beads durch lösliche HLA-Antigene, die es ermöglichen HLA-Klasse-I- und/oder -Klasse-II-Antikörper im Patientenserum nachzuweisen.

Aufgrund des unterschiedlichen Farbemmissonsspektrums der Micro-Beads erlaubt das Verfahren die Untersuchung von bis zu 100 verschiedenen Parametern in einen Testansatz (Kavität) und eignet sich daher als Screening und auch als Differenzierungsmethode. Luminex-basierte Techniken ermöglichen insbesondere die Spezifizierung von Antikörperspezifitäten im Single Antigenformat. Hierbei wird für jede unterschiedliche Fluoreszenzintensität ein spezifisches HLA-Antigen aufgebracht. Das Single-Antigen Testformat ist jedoch aufwendig und wird daher bei der HLA-Antikörperdiagnostik als erweitere Stufendiagnostik eingesetzt.

26.4.3.3.1 Indikation

Wie unter serologischen Antikörpernachweis. Aufgrund der besonders hohen Sensitivität wird der Single-Antigen-Testung bei folgenden Indikationen eingesetzt: Lebendnierenspender, immunisierte Patienten mit stark polyspezifischem Antikörpermuster. Im Post-Transplantationsverlauf zum Nachweis möglicher Transplantat spezifischer Antikörper.

26.4.3.3.2 Bestimmungsmethode

Es gibt ELISA basierte kommerzielle Testformate (Luminex-Screening Formate), zur Unterscheidung zwischen HLA-Klasse-I- und/oder HLA-Klasse-II-Antikörper positiv und negativ. Auch ist eine HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Antikörper-Differenzierung möglich. Wichtige Einflussgrößen und Störfaktoren zum Erhalt zuverlässiger Resultate sind die Konformität der löslichen Antigene, die Spezifität und Kreuzreaktivität der Antikörper.

26.5 Statistische Regeln zur Bewertung von HLA-Antikörpern

Die Auswertung vondes Screenings und Differenzierung von Antikörpern erfolgt nach statistischen Regeln um die Spezifitäten der Antikörper zu ermitteln. Ausgangspunkt ist eine Vierfeldertafel zwischen der Serumreaktion und der vorhandenen Antigenspezifität, d.h. der wahren positiven (a), der falsch positiven (b), der falsch negativen (c, und der wahren negativen Reaktionen (d). Die Berechnung der Signifikanz einer ermittelten HLA-Spezifität erfolgt mittels des X²-Werts und des Korrelationskoeffizienten (r.

Für X²-Werte > 3,84 findet sich ein positives Signifikanzniveau von p < 0,05. r-Werte > 0,85 weisen auf eine positive Korrelation hin.

Die Reaktionsstärke eines Serums gegen eine HLA-Spezifität kann anhand des Stärke-Index (Si) beurteilt werden. Die Berechnung des Einfluss-Index (Ii) ermöglicht bei polyspezifischen Seren den Anteil einer HLA-Spezifität an der Gesamtheit der HLA-Spezifitäten dieses Serums abzuschätzen.

Die Summe der positiven Reaktionen lässt sich auch als prozentualer Anteil an dem Panelumfang (Zahl der verwendeten Lymphozyten unterschiedlicher Personen) darstellen und wird als %-PRA (Percentage of panel reactive antibodies) bezeichnet.

Panelreaktivität (PRA = [(a + c)/N] × 100 (%)

Dieser Wert lässt eine Abschätzung zur Wahrscheinlichkeit zu, ein positives serologisches Crossmatch-Ergebnis mit einem beliebigen unverwandtem Individuum (z.B. Kadaverdonor) zu erhalten. Vorrausetzung ist jedoch, dass das gewählte Zellpanel als Stichprobe den Frequenzen der entsprechenden ethnischen Bevölkerung (z.B. Europiden) entspricht.

26.6 Serologische leukozytäre Verträglichkeitsprüfung (Crossmatch)

Grundlage ist der Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test. Siehe Beitrag 26.4.1 – Serologische HLA-Typisierung mittels des Mikro-Lymphozytotoxizitäts-Test. Eine Lymphozytensuspension des Spenders wird mit dem entsprechenden Serum des Empfängers in Gegenwart von Komplement bei Vorliegen von Antikörpern gegen Lymphozytenmerkmale in einer Weise reagieren, dass die Zellmembran zytotoxisch geschädigt wird.

26.6.1 Indikation

Organ (insbesondere Nieren)- oder bei partiell HLA-differenter Knochenmarkstransplantation, Thrombozytentransfusion bei refraktären Patienten die mit HLA kompatiblen Thrombozyten Präparaten versorgt werden, Granulozytentransfusion.

26.6.2 Untersuchungsmaterial

10 ml Serum des Empfängers und Lymphozyten des Spenders (aus peripherem venösen Heparinblut alternativ bei Kadaverspendern Lymphozyten isoliert aus 3–5 cm³ Milz oder 2–3 Lymphknoten).

26.6.3 Bestimmungsmethode

Das Crossmatch wird unter Verwendung von nicht separierten Lymphozyten (T- und B-Zellen) und/oder separierten T- bzw. B-Lymphozyten aus peripherem Blut oder Milz/Lymphknoten (bei Kadaverspender im Rahmen der Organtransplantation) durchgeführt. T-Zellen exprimieren im nicht aktivierten Zustand HLA-Klasse-I-Antigene, während B-Zellen konstitutiv sowohl HLA-Klasse-I-Antigene als auch HLA-Klasse-II-Antigene exprimieren. Die Durchführung des Crossmatches mit nicht separierten Lymphozyten ermöglicht somit die Detektion von HLA-Klasse-I-Antikörpern und auch HLA-Klasse-II-Antikörpern. Bei Verwendung von Blut muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Anteil der B-Zellen deutlich geringer ist als in der Milz oder Lymphknoten. Zusätzlich zum ungetrennten Crossmatch Ansatz kann zur Unterscheidung von HLA-Klasse-I-Antikörpern und HLA-Klasse-II-Antikörpern ein Ansatz getrennt nach T- bzw. B-Zellen erfolgen.

Die Standardinkubation erfolgt bei Raumtemperatur. Im Serum vorhandene Antikörper binden dabei an Antigene auf der Zelloberfläche. Wenn genügend Antikörper gebunden sind und die Antikörper der richtigen Immunglobulinklasse angehören (IgM, IgG₁, IgG₃) kann Komplement aktiviert und die Zellmembran zerstört werden. Die Inkubationszeiten sind daher sehr wichtig. Ist die Inkubation zu lange, kann sich der gebundene Komplex wieder von der Zellmembran lösen oder in die Zelle internalisiert werden.

26.6.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

Wichtig bei der Durchführung der Kreuzprobe ist der Ausschluss von Autoantikörpern (IgM) durch Ansatz entsprechender Seren mit Dithiotreitol.

26.7 Webseiten bezugnehmend der Immungenetik

HLA nomenclature and current overview of existing alleles and gene loci

Anthony Nolan Bone Marrow Thrust:
www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html
IMGT/HLA database:
www.ebi.ac.uk/imgt/hla/
dbMHC database:
www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc

Guidelines for organ and blood stem cell transplantation – standards for laboratory accreditation

Deutsche Gesellschaft für Immungenetik (DGI):
www.immungenetik.de
European Federation for Immunogenetics (EFI):
www.efiweb.org
Deutsche Transplantationsgesellschaft (DTG):
www.d-t-g-online.de
Deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (DGHO):
www.dgho.de
International Histocompatibility Working Group:
www.ihwg.org

Transfusion medicine guidelines and recommendations on hemotherapy

Deutsche Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie (DGTI):
www.dgti.de

Allocation and clinical outcomes of organ transplantation

Eurotransplant (ET):
www.eurotransplant.nl
Collaborative Transplant Study (CTS):
www.ctstransplant.org

Bone marrow and blood stem cell databases and donor search

Zentrales Knochenmarkspenderregister Deutschland (ZKRD):
www.zkrd.de
Bone Marrow Donor World Wide Registry (BMDW):
www.bmdw.org

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Tabelle 26-1 Expression von HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Merkmalen

HLA	Gewebeexpression
Klasse I	Alle kernhaltigen Zellen, Thrombozyten und geringgradig auf Erythrozyten*
Klasse II	B-Lymphozyten Makrophagen/Monozyten Dendritische Zellen Thymus Epithelzellen Induzierbar (durch γ-IFN oder TNF-α): Aktivierte T-Lymphozyten Darmepithel Gefäßendothel Fibroblasten Sonovialzellen Verschiedene weitere Gewebe

HLA

Gewebeexpression

Klasse I

Alle kernhaltigen Zellen, Thrombozyten und geringgradig auf Erythrozyten*

Klasse II

B-Lymphozyten

Makrophagen/Monozyten

Dendritische Zellen

Thymus Epithelzellen

Induzierbar (durch γ-IFN oder TNF-α):

Aktivierte T-Lymphozyten
Darmepithel
Gefäßendothel
Fibroblasten
Sonovialzellen
Verschiedene weitere Gewebe

* Bg (Bennett-Goodspeed) Antigene auf Erythrozyten entsprechen HLA-B7 (Bg^a), HLA-B17 (Bg^b), HLA-A18 (Bg^c)

Tabelle 26-2 Aufstellung der HLA-Klasse-I-Allele¹

HLA-A		HLA-B		HLA-C
Serologie²	Allele³	Serologie²	Allele³	Serologie²	Allele³
A1	A*01:01 – 01:85	B7	B*07:02 – 07:124	Cw1	C*01:02 – 01:51
A2	A*02:10 – 02:301N	B8	B*08:01 – 08:69	Cw2	C*02:02 – 02:47
A3	A*03:01 – 03:117	B13	B*13:01 – 13:46	Cw3	C*03:02 – 03:108
A11	A*11:01 – 11: 93	B14	B*14:01 – 14:21	Cw4	C*04:01 – 04:84
A23(9)	A*23:01 – 23:36	B15	B*15:01 – 15:221	Cw5	C*05:01 – 05:53
A24(9)	A*24:02 – 24:171	B18	B*18:01 – 18:59	Cw6	C*06:02 – 06:58
A25(10)	A*25:01 – 25:16	B27	B*27:01 – 27:79	Cw7	C*07:01 – 07:171
A26(10)	A*26:01 – 26:65	B35	B*35:01 – 35:160	Cw8	C*08:01 – 08:46
A29(19)	A*29:01 – 29:28	B37	B*37:01 – 37:28	–	C*12:02 – 12:51
A30(19)	A*30:01 – 30:51	B38(16)	B*38:01 – 38:27	–	C*14:02 – 14:29
A31(19)	A*31:01 – 31:49	B39(16)	B*39:01 – 39:63	–	C*15:02 – 15:48
A32(19)	A*32:01 – 32:31	B40	B*40:01 – 40:162	–	C*16:01 – 16:32
A33(19)	A*33:01 – 33:42	B41	B*41:01 – 41:18	–	C*17:01 – 17:08
A34(10)	A*34:01 – 34:09	B42	B*42:01 – 42:16	–	C*18:01 – 18:04
A36	A*36:01 – 36:05	B44	B*44:02 – 44:127
A43	A*43:01	B45(12)	B*45:01 – 45:13
A66(10)	A*66:01 – 66:16	B46	B*46:01 – 46:27
A68(29)	A*68:01 – 68:72	B47	B*47:01 – 47:08
A69(28)	A*69:01	B48	B*48:01 – 48:25
A74(19)	A*74:01 – 74:15	B49(21)	B*49:01 – 49:16
A80	A*80:01 – 80:02	B50(21)	B*50:01 – 50:13
		B51(5)	B*51:01 – 51:109
		B52(5)	B*52:01 – 52:23
		B53	B*53:01 – 53:24
		B54(22)	B*54:01 – 54:24
		B55(22)	B*55:01 – 55:49
		B56(22)	B*56:01 – 56:31
		B57(17)	B*57:01 – 57:43
		B58(17)	B*58:01 – 58:33
		B59	B*59:01 – 59:05
		B67	B*67:01 – 67:03
		B73	B*73:01 – 73:02
		B78	B*78:01 – 78:07
		B81	B*81:01 – 81:05
		–	B*82:01 – 82:03
			B*83:01

Serologische Gruppen: B14 ( B64, B65 ), B15 ( B70(71/72), B75, B62; B63 ), B40 ( B60, B61 )

Bw4 Epitope umfasst: B5, B5102, B5103, B13, B17, B27, B37, B38(16), B44(12), B47, B49(21), B51(5), B52(5), B53, B57(17), B58(17), B59, B63(15), B77(15)

und A9, A23(9), A24(9), A2403, A25(10), A32(19)

Bw6 Epitope umfasst: B7, B703, B8, B14, B18, B22, B2708, B35, B39(16), B3901, B3902, B40, B4005, B41, B42, B45(12), B46, B48, B50(21), B54(22), B55(22), B56(22), B60(40), B61(40), B62(15), B64(14), B65(14), B67, B70, B71(70), B72(70), B73, B75(15), B76(15), B78, B81.

¹ Die Aufstellung entspricht dem Stand 03/2011. Eine jeweils aktuelle Form dieser Liste findet sich unter https://hla.alleles.org/alleles/index.html

² serologisch bestimmbare HLA-Merkmale, sowie zusätzlich serologische Gruppen

³ molekularbiologisch gefundene Merkmale (Darstellung nur der ersten bedien Zifferngruppen)

Tabelle 26-3 Aufstellung der HLA-Klasse-II-Allele (DRB1)¹

HLA-DR		HLA-DQ		HLA-DP
Serologie²	Allele	Serologie	Allele	Serologie³	Allele
DR1	DRB1*01:01 – 01:34	DQ5(1)	DQB1*05:01 – 05:11	DPw1	DPB1*01:01
DR15(2)	DRB1*15:01 – 15:52	DQ6(1)	DQB1*06:01 – 06:43	DPw2	DPB1*02:01,02:02
DR16(2)	DRB1*16:01 – 16:18	DQ2	DQB1*02:01 – 02:06	DPw3	DPB1*03:01
DR3	DRB1*03:01 – 03:60	DQ3	DQB1*03:01 – 03:36	DPw4	DPB1*04:01,04:02
DR4	DRB1*04:01 – 04:95	DQ7(3)	DQB1*03:01	DPw5	DPB1*05:01
DR11(5)	DRB1*11:01 – 11:102	DQ8(3)	DQB1*03:02	DPw6	DPB1*06:01
DR12(5)	DRB1*12:01 – 12:26	DQ9(3)	DQB1*03:03	–	DPB108:01 DPB1132:01
DR13(6)	DRB1*13:01 – 13:113N	DQ4	DQB1*04:01 – 04:08
DR14(6)	DRB1*14:01 – 14:109
DR7	DRB1*07:01 – 07:21
DR8	DRB1*08:01 – 08:42
DR9	DRB1*09:01 – 09:11
DR10	DRB1*10:01 – 10:03
	DRB2*01:01
DR52	DRB3*01:01 – 01:14
	DRB3*02:01 – 02:25
	DRB3*03:01 – 03:03
DR53	DRB4*01:01 – 01:08
	DRB4*02:01N – 03:01N
DR51	DRB5*01:01:01 – 01:02
	DRB5*01:03 – 01:06

¹ Die Aufstellung entspricht dem Stand 03/2011.

Eine jeweils aktuelle Form dieser Liste findet sich unter https://hla.alleles.org/alleles/index.html

² Serologische Gruppe DR3 umfasst DR17/18.

³ DP serologisch bestimmbare HLA-Merkmale (DPw1-DPw6) mit mehr als 130 Allele molekularbiologisch nachweisbar.

Tabelle 26-4 Überarbeitete Nomenklatur für serologische und molekularbiologisch bestimmte HLA-Merkmale am Beispiel für das Merkmal HLA-DR13 bzw. Kategorien für nicht expremierte (Null) oder unterschiedlich stark expremierte Allele (L, S oder Q)

Serologisch	Locus (A, B, C, DR, DQ)	Antigen (1, 2, 3, 4, etc.)
HLA-DR13	DR	13
Molekularbiologisch	Locus	Allel-Hauptgruppe	Allel-Untergruppe (Aminosäurenvariante)	Sequenzvariation	Nicht-kodierende Sequenzvariation
HLA-DRB1*1301	DRB1*	13	:01
HLA-DRB1*13:01:02	DRB1*	13	:01	:02
HLA-DRB1*13:01:01:02	DRB1*	13	:01	:01	:02
Expressionsunterschiede			N- (Null-) Allel mit fehlender Expression
HLA-A*24:09N	A*	24	:09N
			L- (Low-) Allel mit verminderter Expression
HLA-A*30:14L	A*	30	:14L
			S- (Secreted-) Allel mit Expression als lösliches Antigen
HLA-B*44:02:01:02S	B*	44	:02	:01	:02S
			Q- (Questionable-) Allel mit einer Mutation, die zu einem Expressionsverlust/-reduzierung führt, jedoch ohne eindeutige Bestätigung, so dass die Expression als fraglicher angesehen wird.
HLA-A*32:11Q	A*	32	11Q

HLA-Nomenklatur Report: https://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html

Tabelle 26-5 Assoziation von HLA-Merkmalen mit Krankheiten (Auswahl)

Erkrankung	Merkmal	Relatives Risiko
Rheumatologisch / Dermatologische Krankheitsbilder
Ankylosierende Spondylarthritis (M. Bechterew)	HLA-B27	87,4
Urethro-okulo-artikuläres Syndrom (M. Reiter)	HLA-B27	37,0
Akute Iridozyklitis	HLA-B27	10,4
Shigellen-Arthritis	HLA-B27	20,7
Salmonellen-Arthritis	HLA-B27	17,6
Yersinia-Arthritis	HLA-B27	17,6
Gonokokken Arthritis	HLA-B27	13,9
Juvenile chronische Polyarthritis	HLA-B27	3,2
Juvenile Oligoarthritis	HLA-DR8	9,9
Juvenile Oligoarthritis	HLA-DPB1*0201	6,0
Rheumatoide Arthritis	HLA-DR4	4,2
	HLA-DRB10401/0404/*0408	6–14
	HLA-DRB10101/0102	1–2
	HLA-DRB1*1001
	HLA-DRB1*1402	1–2
Felty-Syndrom	HLA-DR4
Psoriasis-Arthropathie	HLA-B27	4,0
Psoriasis vulgaris	HLA-B13	4,7
	HLA-B17	4,7
	HLA-Cw6	13,3
M. Behcet	HLA-B51	3,8
Dermatitis herpetiformis	HLA-DR3	15,4
Dermatitis herpetiformis	HLA-B8	8,7
Sicca-Syndrom	HLA-DR3	9,7
Pemphigus vulgaris	HLA-DR4
Pemphigus vulgaris	HLA-DRB1*0402	14,4
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)	HLA-DR3	5,8
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)	HLA-B8	2,8
Sjögren-Syndrom	HLA-DR3	9,7
Endokrinologische Erkrankungen
Juveniler Diabetes Mellitus (IDDM)	HLA-DR3	3,3
	HLA-DQB*0201	2,4
	HLA-DR4	6,4
	HLA-DQB1*0302	9,5
	HLA-DR2	0,19
	HLA-DRB1*1501
	HLA-DRB5*0101
	HLA-DQB1*0602	0,15
Primär chronische Nebennierenrindeninsuffizienz (M. Addison)	HLA-DR3	6,3
	HLA-DQ2
	HLA-DQB10201 – DQA10501
	HLA-DQ8
	HLA-DQB10302 – DQA10301
	HLA-B8	3,9
Hashimoto-Thyreoiditis	HLA-DR11	3,2
Postnatale Thyreoiditis	HLA-DR4	5,3
Subakute Thyreoiditis	HLA-B35	13,7
Gastroenterologische Erkrankungen
Coeliakie (Glutenenteropathie)	HLA-DR3	10,8
	HLA-DQB1*0201
	HLA-DQA1*0501
	HLA-DR7,11	6–10
	HLA-DR7 – DQB1*0201
	HLA-DR11 – DQA1*0501
Hereditäre Hämochromatose	HFE-Genmutation C282Y	387
Nephrologisch/pneumologische Erkrankungen
Idiopathische membranöse Glomerulonephritis	HLA-DR3	12,0
IgA-Nephropathie	HLA-DR4	4,0
Goodpasture-Syndrome	HLA-DR2	15,9
Gold-Nephropathie	HLA-A1	9,0
	HLA-B8	14,0
	HLA-A1 + B8 + DR3	28,9
Chronisch exogen-allergische Alveolitis	HLA-DR6	16,5
Neurologische Erkrankungen
Multiple Sklerose	HLA-DR2	4,1
	HLA-DRB1*1501
	HLA-DRB5*0101
	HLA-DQB1*0602
Opticus-Neuritis	HLA-DR2	2,4
Myasthenia gravis	HLA-DR3 HLA-B8	2,5 3,4
Narkolepsie	HLA-DR2 HLA-DRB115 HLA-DQB10602 – DQA1*0102	169
Weitere Erkrankungen
Birdshot-Chorioretinopathie	HLA-A29	109
Malaria	HLA-B53	0,61
Malaria	HLA-DRB11302 – DQB10501
Alopecia areata	HLA-DR4 + HLA-DR11	6,1
Alopecia areata	HLA-DQB1*0301

Tabelle 26-6 Mittlere Organüberlebenszeit nach Nierentransplantation

HLA-Kompatibilität des Spenders	Organüberleben in Jahren*
HLA-identisches Geschwister	28,4
1-Haplotyp-identisches Elternteil	16,1
Post-mortale Spenderniere	13,6
HLA-(A-B-DR) identische Kadaverniere	17,0
0-Antigen übereinstimmende Kadaverniere	11,3

* aus Collaborative Transplant Study (CTS) , K-15103-0711, K-21103-0711, www.ctstransplant.org

Tabelle 26-7 Indikation und Stadien für eine erweiterte molekularbiologische HLA-Bestimmung zur Vorbereitung einer allogenen Ersttransplantation von blutbildenden Stammzellen

Indikation und Stadium
Leukämie Akute myeloische Leukämie (AML) in 1. CR und nicht 1. CR Akute lymphatische Leukämie (ALL) in 1. CR und nicht 1. CR Chronisch myeloische Leukämie (CML) in 1. CP und nicht 1. CP Myelodysplastisches Syndrom (MDS) (und transformierte sekundäre akute Leukämie) Myeloproliferatifes Syndrom (MPS) Chronisch lymphatische Leukämie (CLL)
Lymphoproliferative Erkrankung Plasmazellerkrankung: Myelom und andere Morbus Hodgkin Non-Hodgkin-Lymphom
Solide Tumore Neuroblastom Weichteiltumor Brustkrebs Ewing-Sarkom Nierenkrebs Melanom Andere solide Tumore
Nicht Maligne Erkrankung Knochenmarkaplasie: Schwere Aplastische Anämie (SAA) und andere Hämoglobinopathie: Thalassämie und andere primäre Immundefekte Angeborene Metabolismusdefekte
Andere Autoimmunerkrankung

Indikation und Stadium

Leukämie

Akute myeloische Leukämie (AML) in 1. CR und nicht 1. CR
Akute lymphatische Leukämie (ALL) in 1. CR und nicht 1. CR
Chronisch myeloische Leukämie (CML) in 1. CP und nicht 1. CP
Myelodysplastisches Syndrom (MDS) (und transformierte sekundäre akute Leukämie)
Myeloproliferatifes Syndrom (MPS)
Chronisch lymphatische Leukämie (CLL)

Lymphoproliferative Erkrankung

Plasmazellerkrankung: Myelom und andere
Morbus Hodgkin
Non-Hodgkin-Lymphom

Solide Tumore

Neuroblastom
Weichteiltumor
Brustkrebs
Ewing-Sarkom
Nierenkrebs
Melanom
Andere solide Tumore

Nicht Maligne Erkrankung

Knochenmarkaplasie: Schwere Aplastische Anämie (SAA) und andere
Hämoglobinopathie: Thalassämie und andere primäre Immundefekte
Angeborene Metabolismusdefekte

Andere

Autoimmunerkrankung

aus Deutsches Register Stammzelltransplantation (DRST) unter www.drst.de

CR, Complete remisson (Komplette Remission)

CP‚ Chronic phase (Chronische Phase)

Abbildung 26-1 Genomische Organisation des Haupthistokompatibilitätskomplexes (Major histocompatibility complex, MHC) /13/. Die Abbildung gibt eine Übersicht über die wesentliche HLA-Klasse-I-, -Klasse-II- und -Klasse-III-Genloci. Eine Besonderheit der HLA-DR-Region ist, dass eine unterschiedliche Zahl von HLA-DRB-Genen neben dem DRA-Gen ausgeprägt wird. Die exprimierten Gene sind durch schwarze Rechtecke, Pseudogene durch offene Rechtecke gekennzeichnet. DR1-Gruppe: DR1, DR10, DR103, (DR15); DR51-Gruppe: DR15, DR16, (DR1); DR52-Gruppe: DR3, DR11, DR12, DR13, DR14, DR1403, DR1404; DR53-Gruppe: DR4, DR7, DR9; DR8-Gruppe: DR8.

Abbildung 26-2 Kodominante Expression von HLA-Klasse I- und Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche. Die HLA-Klasse-II-Moleküle bestehen jeweils aus einer A- und B-Kette, während die schwere A-Kette der HLA-Klasse-I-Moleküle mit dem β₂-Mikroglobulin assoziiert. Das Gen für das β₂-Mikroglobulin liegt außerhalb der HLA-Region auf Chromosom 15.

Abbildung 26-3 Segregation der HLA-Haplotypen innerhalb einer Familie. Bei den Eltern liegen vier verschiedene Haplotypen vor, die auf die Kinder weiter vererbt werden. Hierbei besteht eine 25 %-ige Wahrscheinlichkeit, dass zwei Kinder HLA-identisch sind, d.h. die gleiche HLA-Region vererbt bekommen. Es sind dies Kind 2 und 3. Auch ist eine Wahrscheinlichkeit von 50 % vorhanden, dass die Kinder lediglich HLA-halb-identisch sind (Kind 4 im Vergleich zu Kind 2 und 3) und eine Wahrscheinlichkeit von 25 %, dass die Kinder völlig verschiedene Haplotypen aufweisen (Kind 1 im Vergleich zu Kind 2 und 3).

Abbildung 26-4 HLA-Klasse-I- (A: HLA-A68) und HLA-Klasse-II-(B: HLA-DR1) Molekülstruktur und Genaufbau. A: Die Bindung von Peptiden (dunkelgrau) findet zwischen den beiden C-Helices und dem Boden der Antigenbindungsfurche, der β-Faltblattstruktur, statt. Obwohl die Organisation der Klasse-I-(α₁, α₂, α₃, β₂M) und Klasse-II- (α₁, α₂, β₁, β₂) Domänen unterschiedlich ist, ähnelt sich die Molekülstruktur sehr stark /10/. HLA-Klasse-I-Moleküle binden Peptide von 8–11 Aminosäuren. Die amino- und carboxyterminalen Enden sind dabei tief in der Peptidbindungsfurche eingelagert.

HLA-Klasse-II-Moleküle hingegen können Peptide von 12–25 Aminosäuren binden, deren Enden aus der Peptidbindungsfurche herausragen. Aufgrund der Bindungsverhältnisse sind bestimmte Aminosäurepositionen des Peptids von entscheidender Bedeutung für die Einlagerung. Diese Positionen sind abhängig von den allelischen Sequenzvariationen der HLA-Moleküle /5/. B: Exon-Intron-Struktur von HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Genen. SP, Signalpeptid; TM, Transmembranregion; ZP, Zytoplasmatische Region; 3’NT, 3’ nicht-translatierte Region.

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