1.1 Enzymdiagnostik

Lothar Thomas

1.1.1 Enzyme im Serum

Die zu diagnostischen Zwecken im Serum, Plasma, Sekreten und Gewebsflüssigkeiten gemessenen Enzyme sind biologische Katalysatoren. Schon geringe Mengen können die Gleichgewichtseinstellung einer chemischen Reaktion durch Herabsetzen der Aktivierungsenergie herbeiführen. Enzyme haben eine Reaktionsspezifität, das bedeutet, die Katalyse einer chemischen Reaktion kann nur durch ein speziell für diese Reaktion erforderliches Enzym erfolgen. Eine weitere Eigenschaft ist die Substratspezifität, nur eine bestimmte Substanz oder Substanzgruppe dient als Reaktionspartner und wird zum Produkt umgesetzt.

Faktoren mit Einfluss auf die Enzymaktivität

Die Enzyme im Serum kommen aus den Zellen der Gewebe oder resultieren aus dem Übertritt sekretorischer Enzyme in das Blut. Die Gewebeenzyme entstammen vorwiegend den Hauptstoffwechselketten der Zellen und liegen dort entweder im Zytoplasma gelöst oder gebunden an Zellstrukturen, z.B. die Mitochondrien, vor. Sekretorische Enzyme wie die Peptidasen und Hydrolasen werden gewöhnlich in inaktiver Form sezerniert, wenige wie die Cholinesterasen gelangen in aktiver Form ins Plasma. Bestimmend für die Enzymaktivität im Plasma sind Faktoren, die das Ausmaß der Freisetzung bestimmen. Bei zellständigen Enzymen bestimmt das Ausmaß der Schädigung die Freisetzung, bei den sekretorischen Enzymen ist die vermehrte Enzymproduktion der einzelnen Zelle oder eine Vermehrung von Gewebe, welches das Enzym bildet, maßgebend /1/.

Enzymfreisetzung: Die niedrige Aktivität zellständiger Enzyme im Blut Gesunder beruht auf der Dichtigkeit einer metabolisch aktiven Zellmembran. Jedes pathologische Geschehen, das die Energieversorgung der Zellmembran beeinträchtigt, z.B. eine mangelnde Versorgung mit ATP oder anderen energiereichen Substraten durch Ischämie oder Anoxie, kann zur Desintegration der Zellmembran und konsekutivem Austritt von Enzymen führen. Zuerst wird das Membranpotential gestört. K⁺ verlassen die Zelle und Na⁺ und Wasser treten ein, was eine Schwellung der Zelle bewirkt. Der nachfolgende Eintritt von Ca²⁺ aktiviert Hydrolasen und Peptidasen, was zur Zerstörung intrazellulärer Strukturen und einer Undichtigkeit der Zellmembran führt. Zuerst erscheinen zytoplasmatische Enzyme im Blut, dann mitochondriale und Membran-gebundene Enzyme. Ausmaß und Geschwindigkeit des Austritts von Enzymen sind von der Größe und dem Konzentrationsgradienten des jeweiligen Enzyms zwischen Zytoplasma zu Extrazellulärraum abhängig. Die intrazelluläre Enzymkonzentration beim Gesunden ist sehr viel höher als im Plasma. So sind die Aktivitäten in Leber, Niere, Herz und Skelettmuskel jeweils höher als im Plasma des Gesunden von:

• AST 7.000-, 4.500-, 8.000 und 5.000 fach.
• ALT 2.800-, 1.200-, 400- und 300 fach.

Der Enzymübertritt vom Interstitium in das Blut erfolgt entweder über einen direkten Transfer durch die Kapillarwand oder indirekt über die Lymphwege. Ersteres ist der Fall bei gut vaskularisierten Geweben wie dem Leberparenchym, letzteres in Geweben mit wenig permeabler Kapillarmembran wie der Muskulatur. Das Ausmaß des Enzymaustritts ist von der intrazellulären Lokalisation des Enzyms abhängig. Zytoplasmatisch gelöste Enzyme erscheinen relativ früh nach Zellschädigung in gut messbarer Aktivität im Blut. An subzelluläre Strukturen, z.B. die Mitochondrien, gebundene Enzyme benötigen länger. In der Regel tritt innerhalb von 24 h nach Zellschädigung mit Nekrose ein der intrazellulären Enzymverteilung entsprechendes Enzymmuster im Blut auf /1/.

Veränderte Enzymbildung: Veränderungen der Enzymbildung können als gegenüber dem Referenzbereich verminderte oder erhöhte Aktivitäten im Blut auftreten, ohne dass eine Zellschädigung vorliegt. Die verminderte Aktivität steht weniger im Mittelpunkt diagnostischen Interesses und beruht vorwiegend auf einer genetischen Störung bei den Gewebsenzymen wie z.B. der AP. Die Verminderung der Aktivität sekretorischer Enzyme beruht demgegenüber häufig auf einer Abnahme der dieses Enzym bildenden Gewebe, z.B. Verminderung der CHE bei Leberzirrhose. Der vermehrten Enzymabgabe in das Blut ohne Vorliegen einer Gewebsschädigung können folgende Ursachen zu Grunde liegen:

• Die Erhöhung der Anzahl und/oder der biochemischen Aktivität von Gewebezellen. So bewirkt z.B. die Vermehrung und Aktivitätserhöhung der Osteoblasten bei Heranwachsenden eine Erhöhung der AP durch verstärkte Bildung des Knochenisoenzyms.
• Eine Enzyminduktion. Gewebezellen bilden vermehrt Enzyme, z.B. durch einen chemischen Reiz der Hepatozyten durch Alkohol, Barbiturate oder Phenytoin bilden diese vermehrt GGT. Auch erfolgt z.B. durch eine Obstruktion der Gallenwege eine Stimulation der Synthese des Leberisoenzyms der AP.
• Die Bildung neuer Gewebe. So synthetisiert die Plazenta im letzten Trimenon eine AP, die im Blut der Schwangeren als Plazenta Isoenzym nachgewiesen wird. Ein ähnliches Isoenzym können auch maligne Hodentumoren bilden.

Organschädigung und Enzymerhöhung

Die häufigsten Enzymerhöhungen beruhen auf einer Schädigung von Leber, Herz- und Skelettmuskel und der roten Blutzellen. Leber-bedingte Enzymerhöhungen sind entweder durch die direkte Schädigung der Zellmembran durch Viren, die toxische Wirkung von Pharmaka und Giften oder eine Gewebshypoxie bedingt. Letztere bewirkt meist eine zentrilobuläre Nekrose von Hepatozyten und kann aus einer akuten Rechtsherzinsuffizienz, einer portalen Hypertension oder einer arteriellen Hypoxie, z.B. bei Schock, resultieren. Infarkte der Leber sind demgegenüber selten, denn die Leber hat eine duale Blutversorgung aus den Leberarterien und dem Pfortadersystem.

Anders ist die Situation am Herzen. Hier ist auf Grund der segmentalen Versorgung des Herzmuskels durch Endarterien bei deren Verschluss die hypoxämische Nekrose von Myozyten die Regel. Innerhalb von 24 h tritt im Blut ein der Herzmuskelzelle entsprechendes Enzymmuster auf.

Die Schädigungen der Skelettmuskulatur mit Enzymaustritt sind vielfältig. Im Vordergrund stehen Verletzungen, hypoxische Nekrosen, Entzündungen, Infektionen, degenerative Erkrankungen, toxische Schädigungen (Alkohol), Urämie und neurogene Myopathien.

Die Lyse roter Blutzellen führt zur Freisetzung der LDH, dem Enzym mit der höchsten Aktivität in diesen Zellen. Unterschieden wird die in-vivo von der in-vitro Hämolyse. Erstere erfolgt intravaskulär und ist meist immun-bedingt, letztere beruht auf einer Zerstörung der Erythrozyten während der Blutentnahme oder der mehrtägigen Lagerung von Vollblut vor der Untersuchung.

Die in der klinisch-chemischen Routinediagnostik angewendeten kinetischen Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität weisen Konzentrationen bis zu 10^–10 mol/l nach. Auf Grund dieser hohen analytischen Sensitivität werden durch Enzym Bestimmungen auch geringe Organschäden angezeigt. So kommt es schon zu einem Anstieg der ALT über den oberen Referenzbereichswert, wenn nur 1 von etwa 750 Hepatozyten geschädigt ist.

Clearance von Serumenzymen

Zur Beurteilung der Enzymaktivität als diagnostischer Marker von Organerkrankungen ist es wichtig, Kenntnisse über die Clearance von Enzymen zu haben. Niedermolekulare Enzyme wie die α-Amylase werden teilweise renal eliminiert. Vorwiegend werden aber aus den Geweben in das Blut übertretende Enzyme in die Zellen des retikulo-endothelialen Systems über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. So gibt es z.B. auf der Zellmembran des Hepatozyten spezifische Rezeptoren, die mit den N-galactosyl-Resten des intestinalen Isoenzyms der AP reagieren. Es erfolgt dann eine intrazelluläre Degradation in Peptide, die für den Stoffwechsel bereit gestellt werden. Die Halbwertszeit vieler Enzyme liegt im Blut bei 4–24 h (Tab. 1.1-1 – Halbwertszeiten von Serumenzymen). Eine Verlängerung der Halbwertszeit kann resultieren aus einer Komplexierung des Enzyms mit Immunglobulinen oder einer verminderten Funktion der für die Clearance verantwortlichen Gewebe oder Organe. So ist bei Leberzirrhose die Clearance von Enzymen auf Grund einer Verminderung von Lebergewebe reduziert. Die Verlängerung der Halbwertszeit der α-Amylase kann die Folge einer renalen Insuffizienz oder der Komplexierung mit Immunglobulin sein, wie das z.B. der Fall bei Makro­amylasämie ist.

1.1.1.1 Bestimmung der Enzymaktivität

Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms (E) ist seine Fähigkeit, die Umwandlung einer Substanz, auch Substrat (S) genannt, in ein Produkt (P) zu katalysieren. Das geschieht nach folgendem Reaktionsablauf /2/:

In einem ersten Reaktionsschritt bindet das Substrat an das Enzym unter Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, von diesem wird das Substrat in ein Produkt umgewandelt und das Produkt freigesetzt. Das frei gewordene Enzym bindet sofort ein weiteres Substratmolekül. Die Umsatzzahl der meisten Enzyme, auch Turnover number bezeichnet, beträgt mindestens 100 Substratmoleküle pro Enzymmolekül und Sekunde.

Die Bestimmung der Konversionsrate, gemessen als Änderung einer Substanz (Abnahme des Substrates oder Zunahme des Produktes) pro Zeiteinheit, ist die Basis der quantitativen Enzymbestimmung. Die Konversionsrate wird bei der Enzymanalytik auch als Reaktionsrate bezeichnet.

Die Bestimmung der Konzentration eines Enzyms erfolgt über die Messung seiner katalytischen Aktivität. Diese wird bevorzugt im kinetischen Test bestimmt.

Kinetischer Test /2/: Unter Bedingungen, bei denen die Enzymkonzentration im Testansatz sehr viel geringer ist als die seines Substrates folgen viele Enzyme dem Michaelis-Menten Modell, das die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion in Beziehung zur molaren Konzentration des Enzyms und seines Substrates setzt. So besteht zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit V der Enzymreaktion, ihrer Maximalgeschwindigkeit (V_max) und der Substratkonzentration [S] die folgende Beziehung:

Die Michaelis-Menten-Konstante (K_m) beschreibt die Substratkonzentration, bei der die Hälfte von V_max einer Enzym-katalysierten Reaktion erreicht wird. Sie beträgt in der Regel 10^–2 bis 10^–5 mol/l. Je kleiner der K_m-Wert, desto höher ist die Affinität des Substrates zum Enzym. Unter definierten Bedingungen wie Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke usw. und bei konstanter Enzymkonzentration beschreibt die Beziehung zwischen V und [S] eine Hyperbel, die asymptotisch dem Grenzwert V_max zustrebt. Liegt [S] in hohem Überschuss gegenüber dem K_m vor, ist V von [S] unabhängig. Man sagt dann, dass das Enzym mit Substrat gesättigt ist. In dieser Situation ist die vom Enzym umgesetzte Substratmenge proportional der Enzymmenge im Testansatz und der Reaktionsdauer.

Enzymatische Reaktionen, bei denen sich einzelne Untereinheiten kooperativ verhalten, Enzyme mit allosterischen Reaktionen und Mehrsubstrat-Reaktionen werden durch das Michaelis-Menten Modell nur unzureichend beschrieben.

Photometrische Messung der Enzymreaktion /3/: Bei der photometrischen Messung einer Enzymreaktion findet durch Abnahme der Substrat- oder Zunahme der Produktkonzentration eine Änderung der Lichtabsorption (ΔA) in einem Zeitintervall (Δt) statt. Die Änderung der Absorption (ΔA/Δt), wird in eine zeitliche Änderung der Substrat- oder Produktkonzentration umgewandelt. Das geschieht durch Multiplikation mit dem Faktor V/ε × l, wobei V das Volumen des Testansatzes, ε der molare Absorptionskoeffizient und l die Länge des Lichtweges durch die Kuvette ist. ΔA ist dimensionslos und die Dimensionen der anderen Größen sind jeweils T = Δt, L³ = Volumen V, L² × N^–1 = ε, N = Substratkonzentration und L= Liter. Die Reaktionsrate berechnet sich nach der Formel:

N × T^–1 ist die pro Zeiteinheit umgesetzte Menge Substrat oder entstehende Menge Produkt und ein Maß der katalytischen Aktivität eines Enzyms. Die Dimension der katalytische Aktivität ist das Katal.

Die photometrische Messung der umgesetzten Menge Substrat oder entstehenden Menge Produkt beruht auf dem Prinzip der Absorption von Licht durch eine absorbierende Substanz in einem nicht absorbierenden Lösungsmittel nach dem Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz:

A = ε × c × d

Dabei ist A die Absorption, c die Substrat- oder Produktkonzentration, d die Länge des Lichtweges durch die Küvette und ε der molare dekadische Absorptionskoeffizient von Substrat oder Produkt das gemessen wird. Die Dimension ε von ist:

ε = A/c × d = 1 × mol^–1 × mm^–1

Die physiologischen Substrate und Produkte der meisten Enzyme sind farblos. Deshalb werden entweder synthetische (chromogene) Substrate eingesetzt, bei denen ein farbiges Reaktionsprodukt entsteht, oder der eigentlichen Messreaktion wird eine Indikator-Reaktion nachgeschaltet. Bei einigen Enzymen, die direkt mit den Ko-Substraten (Koenzymen) NADH₂ und NADPH₂ reagieren und die oxidierten Koenzym-Formen NAD oder NADP entstehen, wird die Abnahme von NADH₂ und NADPH₂ bei 344 nm, 334 nm oder 365 nm als Indikator der enzymatischen Aktivität bestimmt (einfacher optischer Test). Das typische Beispiel eines einfachen optischen Tests ist die Bestimmungsreaktion für die LDH. Siehe Beitrag 1.11.2 – Bestimmungsmethode. Kann das in der Messreaktion anfallende Substrat nicht direkt photometrisch erfasst werden, so wird es in einer Reaktionsfolge vermittels einer Hilfsreaktion mit der Indikator-Reaktion unter Beteiligung der Koenzyme NADP/NADPH₂, verknüpft. Ein Beispiel hierfür ist die Bestimmungsreaktion der CK. Siehe Beitrag 1.8.2 – Bestimmungsmethode.

Vergleichbare Ergebnisse können nur erhalten werden, wenn die Enzymaktivitäten unter gleichen Bedingungen gemessen werden. Deshalb wurde für die Messung der katalytischen Aktivität vieler Enzyme von der International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) ein Referenzsystem etabliert /4/. Die Messtemperatur ist 37 °C. Das Referenzsystem besteht aus primären Referenzmethoden, zertifizierten Referenzpräparationen und einem weltweiten Netz von Referenzlaboratorien.

Da die Enzyme an Hand ihrer katalytischen Aktivität quantitativ bestimmt werden, erfolgt die Angabe der Aktivität in kinetischen Einheiten. Als Maßeinheiten sind definiert:

• International unit (IU) von der Commission of Enzymes der International Union of Biochemistry (IUB). 1 IU ist diejenige Enzymmenge, die einen Substratumsatz von 1 μmol pro Minute katalysiert. Die katalytische Konzentration der Enzyme wird in U/l, kU/l oder mU/l angegeben.
• Katal von der International Union of Pure and Applied Chemistry und der IUB. Ein Katal katalysiert den Substratumsatz von 1 mol pro Sekunde. Die Enzymaktivität wird in Katal/l oder μKatal/l angegeben. Das Katal steht im Einklang mit dem Systeme Internationale (SI), bei dem das Mol die Einheit des umgesetzten Substrates ist und die Sekunde die Zeiteinheit. Somit entsprechen 1 U = 1 μmol/60 s = 0,0167 μmol/s oder 1,0 μKatal/l = 60 U/l.

1.1.1.2 Isoenzyme und Isoformen

Isoenzyme: Nach Definition der IUPAC-IUB Kommission für Biochemische Nomenklatur sind Isoenzyme folgendermaßen definiert: Proteine mit ähnlicher enzymatischer Aktivität, die durch verschiedene Gene kodiert werden. Neben einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz und abweichenden katalytischen Eigenschaften können sie in der Affinität zu Substraten, Aktivatoren und Inhibitoren, im pH- und Temperaturoptimum sowie der Hitzestabilität different sein.

Die folgenden Kategorien von Isoenzymen werden unterschieden /5/:

• Genetisch unabhängige Enzyme, die von verschiedenen Genloci kodiert werden wie z.B. die mitochondriale und zytoplasmatische Form der Malat-Dehydrogenase und der AST.
• Alloenzyme, es handelt sich um Enzymvarianten, die von allelen Genen eines singulären Genlocus kodiert werden. Beispielhaft sind die Alloenzyme der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase.
• Hetero-polymere Enzyme. Es handelt sich um nicht- kovalente Hybridmoleküle von zwei oder mehr Polypeptidketten, beispielhaft sind die intermediären Isoenzyme der Lactat-Dehydrogenase.

Isoformen: Enzymisoformen entstehen durch posttranslationale Modifikation eines Enzyms. Ein Beispiel ist die Gewebe-unspezifische AP, aus der posttranslational die Isoformen Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP gebildet werden.

Analytik der Isoenzyme und Isoformen

Bestimmung der Aktivität: Die katalytische Aktivität einer Isoenzym-Familie kann ähnlich sein, ist aber nicht identisch. Meist liegen leichte Änderungen im pH-Optimum, der Affinitätskonstanten für das Substrat und der Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren oder denaturierenden Reagenzien vor. Alloenzyme können, müssen sich aber nicht in ihrer katalytischen Aktivität unterscheiden. Ist das mutante Allel dafür verantwortlich, dass kein oder kein aktivierbares Enzym gebildet wird und hat dies eine wichtige Funktion im Stoffwechsel, so kann eine schwere oder gar letale Erkrankung resultieren.

Zur Unterscheidung der Isoenzyme durch die Bestimmung ihrer enzymatischen Aktivität werden Unterschiede in ihrer katalytischen Aktivität gegenüber Substrat-Analogen oder in Anwesenheit von Inhibitoren gemessen. Auch verhält sich die katalytische Aktivität von Isoenzymen unterschiedlich in ihrer Stabilität gegenüber denaturierenden Reagenzien. Multiple Enzyme zeigen in der Regel keine Differenzen in der Stabilität gegenüber denaturierenden Reagenzien.

Separative Methoden: Die Veränderung weniger Aminosäurenreste verursacht keine oder nur sehr geringe Änderungen des Molekulargewichts der Isoenzyme. Deshalb sind chromatographische Methoden in der Differenzierung von Alloenzymen wenig erfolgreich, wohl aber in der Differenzierung von multiplen Enzymformen.

Bewirken strukturelle Veränderungen von Isoenzymen eine Veränderung der elektrischen Ladung, so können die Agarosegel-Elektrophorese oder die Isoelektrofokussierung geeignete Separationsmethoden sein. Bestehen Variationen in den Kohlenhydrat-Seitenketten, so kann die Lektin-Affinitätschromatographie hilfreich sein.

Immunologische Analytik: Isoenzyme oder multiple Enzymformen können Unterschiede in ihren antigenen Determinanten aufweisen und durch Bindung spezifischer Antikörper identifiziert werden.

Klinische Bedeutung von Isoenzymen und Isoformen

Die Präsenz von Isoenzymen und Isoformen im Serum erhöht die diagnostische Sensitivität und Spezifität zur Erkennung von Organerkrankungen. Die klinische Aussagekraft wird in den jeweiligen Enzymbeiträgen dieses Kapitels abgehandelt.

1.1.1.3 Makroenzyme

Abgegrenzt von den Isoenzymen und Isoformen werden Enzyme mit einer Multiplizität (multiple Enzyme) wie sie auf Grund posttranslationaler Veränderungen entstehen durch /6, 7/:

• Konjugation mit weiteren Molekülen oder Bindung an andere Moleküle nach Degradation.
• Polymerisation singulärer Untereinheiten zu einem größeren Komplex.
• Komplexbildung, zwischen Enzym und Immunglobulin.
• Allosterische Modifikationen von Enzymen.

Die häufigsten Makroenzyme sind Immunglobulin assoziiert (Typ 1-Makroenzyme), alle anderen werden als Typ 2-Makroenzyme bezeichnet.

Immunglobulin-assoziierte Enzyme: Sie sind die häufigste Form der Makroenzyme und beruhen auf der Bildung eines Immunkomplexes zwischen Enzym und einem Autoantikörper. Es handelt sich um eine normale Antigen-Antikörper-Reaktion. Die antigene Determinante des Enzyms bindet am Fab-Teilstück des Antikörpers unter Bildung eines großmolekularen Enzym-Immunglobulin-Komplexes. Auf Grund des höheren Molekulargewichtes mit konsekutiv verzögerter Clearance resultiert im Serum eine Akkumulation und ein höhere Enzymaktivität.

Einige Autoantikörper reagieren nur mit einer Isoform des Enzyms andere mit allen. Die Bindung des Enzyms an das Fab-Teilstück des Antikörpers stabilisiert die Aktivität des Enzyms gegenüber thermischen Einflüssen, beeinflusst die Eliminations Geschwindigkeit aus der Blutbahn und wirkt sich auch auf seine Enzym kinetischen Eigenschaften aus. Vielfach ist eine geringe Hemmung nachweisbar, selten finden sich stark inhibierende Antikörper.

An andere Moleküle gebundene Enzyme: Nicht nur mit Autoantikörpern, sondern auch mit Molekülen wie Hydroxyäthylstärke, Lipoproteinen und α₂-Makroglobulin ist eine Komplexbildung möglich. Zusätzlich fallen unter diese Einteilung auch oligomere Formen wie die mitochondriale CK, die bei tiefen zellulären Nekrosen ins Plasma übertritt. Eine andere Form von Makroenzym ist die Gallengang-AP, eine alkalische Phosphatase, die an Membranfragmente gebunden ist und bei Cholestase im Serum nachweisbar sein kann.

Makroenzyme persistieren oft lange, können eine Erhöhung der Enzymaktivität verursachen und somit eine Krankheit vortäuschen.

Klinische Bedeutung der Makroenzyme

Makroenzyme haben ein höheres Molekulargewicht als die freien Enzyme und zirkulieren deshalb länger im Plasma. Makroenzyme sind keine spezifischen Krankheitsmarker. Bewirken sie eine Enzymerhöhung im Serum, so verursachen sie oft eine Konfusion von behandelndem Arzt und Labor mit der Folge einer Vielzahl weiterer kostenintensiver unnötiger Untersuchungen. Die Bedeutung klinisch wichtiger Makroenzyme ist aufgezeigt in Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

Immunglobulin-gebundene Makroenzyme: Für folgende labordiagnostisch wichtigen Enzyme sind Makro-Formen beschrieben: ALT, AP, α-Amylase, AST, CK, GGT, LDH, Lipase. Makroenzyme sind beim Gesunden ein seltenes Ereignis, ist ein Enzymwert aber pathologisch erhöht, persistiert er lange. Die Persistenz der Aktivität kann dabei über Jahre hinweg nahezu unverändert sein. Zwar wurde vereinzelt das gemeinsame Auftreten von Makroenzymen und Autoimmunerkrankungen beschrieben, der Nachweis darf aber deswegen nicht als spezifischer und sensitiver Hinweis auf eine besondere, manifeste Erkrankung gewertet werden. Es gibt weder sichere Hinweise dafür, dass Immunglobulin-gebundene Makroenzyme Ausdruck einer Autoimmunerkrankung sind, noch dafür, dass diese zirkulierenden Enzym-Immunkomplexe selbst schädliche Auswirkungen haben. Im Allgemeinen nimmt die Prävalenz der Makroenzyme mit steigendem Lebensalter zu.

Eine weitere Besonderheit der Immunglobulin-gebundene Makroenzyme besteht darin, dass die Antikörper oft im Überschuss zum Enzym vorliegen. Zum einen können Enzymmoleküle, die durch eine akute Organschädigung freigesetzt werden, jetzt sofort an diese freien Bindungsplätze gebunden und in die Makroform umgewandelt werden. Sie werden dadurch möglicherweise einer elektrophoretischen Isoenzym-Bestimmung entgehen. Zum anderen führen die überschüssigen Antikörper zu einer Kompetition um das Enzymmolekül bei immunologischen Enzym- und Isoenzym-Bestimmungen; insbesondere bei kurzen Inkubationszeiten können fälschlich-erniedrigte Konzentrationen die Folge sein.

Die oft zufällig entdeckten Immunglobulin-gebundene Makroenzyme stellen nur die Spitze eines Eisbergs dar; man kann leicht eine deutlich höhere Prävalenz ermitteln, wenn man gezielt nach ihnen sucht. Je sensitiver das angewendete Nachweisverfahren ist, desto häufiger werden Makroenzyme im Blut von Patienten und auch von Normalpersonen nachweisbar. Ihre Enzymaktivitäten liegen dann allerdings im Referenzbereich. Aus diesem Grund sind die Literaturangaben zur Prävalenz oft unterschiedlich und müssen auf den ersten Blick widersprüchlich erscheinen.

An andere Moleküle gebundene Enzyme: Für folgende diagnostisch wichtige Enzyme sind Makroformen beschrieben worden: AP, Amylase, CK und GGT. Makroenzyme dieses Typs spiegeln mit ihrer Aktivitäts-Zeit-Kurve meist einen Krankheitsverlauf wieder oder können auch vorübergehend nach therapeutischen Eingriffen beobachtet werden. Deshalb können diese Formen bei Besserung oder Heilung nicht mehr nachweisbar sein. Die Ermittlung von Prävalenzen für Nicht-Immunglobulin-gebundene Makroenzyme hängt in noch stärkerem Maße vom angewendeten Untersuchungsverfahren und der Auswahl der untersuchten Patienten ab, als dies bei Immunglobulin-gebundenen Makroenzymen der Fall ist.

Unklare Enzym-Konstellation: Bei allen nicht zur Klinik passenden Enzym-Konstellationen ist es wichtig, das Vorliegen von Makroenzymen zu bestätigen oder auszuschließen. Da zu diesen Aktivitätserhöhungen kein entsprechendes klinisches Korrelat gefunden wird, werden sie oft vorschnell als Laborfehler klassifiziert. Die Kenntnis über das Vorliegen eines Makroenzyms kann den Patienten vor falschen diagnostischen und therapeutischen Entscheidungen bewahren. Hier ist insbesondere die Makro-CK zu nennen, die relativ häufig die Bestimmung der CK-MB stört.

1.1.1.4 Antikörper gegen gewebeständige Enzyme

Es handelt sich um im Serum zirkulierende Autoantikörper, die gegen gewebeständige Enzyme oder Regulatoren bestimmter Enzymaktivitäten gerichtet sind /8/. Die Enzyme werden entweder nur in einem Gewebe exprimiert, wie gegen die Schilddrüsenperoxidase, oder in mehreren, wie gegen die Pyruvatdehydrogenase (Tab. 1.1-3 – Antikörper mit regulatorischer Wirkung auf die Aktivität gewebeständiger Enzyme). Während die Makroenzyme gehäuft bei älteren Menschen vorkommen und meist von keiner klinischen Signifikanz sind, haben Antikörper gegen gewebeständige Enzyme oder ihre Regulatoren eine signifikante Krankheitsassoziation.

1.1.2 Diagnostische Aussage von Enzymen

Indikationen der Enzymbestimmung im Serum oder Plasma sind:

• Feststellung eines Gewebeschadens.
• Organ-bezogene Lokalisierung der Schädigung.
• Feststellung der Ausdehnung des Schadens.
• Erkennung der Schwere der Einzelzellschädigung (reparabel oder irreparabel).
• Diagnostik der zu Grunde liegenden Erkrankung.
• Differentialdiagnose der Krankheit eines Organs (Lokalisation der Einzelzellschädigung im betroffenen Organ).

Informationen werden gewonnen auf Grund:

• Der Höhe der Enzymaktivität im Serum.
• Der Bestimmung von Enzymmustern (Gesamtheit eines Spektrums gleichzeitig im Serum ermittelter Enzymaktivitäten).
• Der Bewertung von Enzymaktivitäten in Relation zueinander, z.B. Berechnung von Enzymquotienten.
• Der Verlaufsbeurteilung von Enzymaktivitäten.
• Der Bestimmung von Isoenzymen.

Die Höhe der Enzymaktivität ist die Resultante aus mehreren mit typischem Zeitverlauf einhergehenden Prozessen. Zur Interpretation eines erhöhten Enzymwerts müssen folgende Fragen gestellt werden:

• Liegt die vermehrte Freisetzung des Enzyms aus einem Organ vor, z.B. Gewebeschaden?
• Sind die üblichen Mechanismen der Elimination, die das Enzym üblicherweise aus der Zirkulation entfernen, gestört, liegt z.B. eine Niereninsuffizienz oder eine Leberzirrhose vor?
• Kann sich das Enzym an einen Serumbestandteil angelagert haben, liegt z.B. ein Makroenzym vor?
• Ist eine vermehrte Enzymbildung, z.B. Enzyminduktion die Ursache?

Sitz der Erkrankung (Organlokalisation)

Die Lokalisation des geschädigten Gewebes oder Organes kann erfolgen durch:

• Bestimmung von Leitenzymen.
• Isoenzym-Differenzierung.
• Bewertung Symptom-orientierter Enzymmuster.

Leitenzyme: Es handelt sich um Enzyme, die ausschließlich in einem bestimmten Organ/Gewebe vorkommen oder aber dort in sehr hoher Aktivität im Vergleich zu anderen Organen/Geweben vorliegen. Eine vermehrte Präsenz im Serum weist auf die Herkunft hin (Tab. 1.1-4 – Leitenzyme wichtiger Organe).

Isoenzyme: Die Isoenzymausstattung der Gewebe ist genetisch determiniert. Durch die Differenzierung besteht die Möglichkeit der Erkennung des Herkunftsgewebes einer erhöhten Enzymaktivität, z.B. Pankreasamylase, Speicheldrüsenamylase, die Herzmuskel-spezifische CK-MB oder die erythrozytäre LDH-1.

Enzymmuster: Sie können auf Grund der Relation der Enzymaktivitäten zueinander organdiagnostische Auskunft geben. Basisenzyme eines jeden Enzymmusters sind die Aminotransferasen, richtungsweisendes Kriterium ist der Enzymquotient. Differentialdiagnostisch bedeutsame Gewebe, die über 90 % aller Enzymanstiege verursachen, sind Leber, Herzmuskel, Skelettmuskel und Erythrozyten. Die Abgrenzung des Schadens eines der drei Gewebe vom Leberschaden ist durch die Quotienten CK/AST und LDH/AST möglich (Tab. 1.1-5 – Abgrenzung einer Lebererkrankung von anderen Gewebeschäden).

Stadium des pathologischen Prozesses

Die eine Enzymfreisetzung in das Blut und eine Enzymelimination aus dem Blut bewirkenden Mechanismen zeigen jeweils typische Zeitverläufe, deren Zusammenwirken in charakteristischen Aktivitäts-Zeit-Kurven resultiert. Aus diesen Kurven kann ein diagnostisches Zeitfenster abgeleitet werden, in dem mit erhöhten Enzymaktivitäten bei Vorliegen der Erkrankung gerechnet werden und aus dem oft das Stadium der Erkrankung abgeschätzt werden kann.

Ist das Organ bekannt, so sind gewöhnlich bei akuten Prozessen die Enzymaktivitäten höher als bei chronischen. Bei akuten Organerkrankungen kann das Krankheitsstadium auch aus der Relation von Enzymen mit kurzer zu solchen mit langer Halbwertszeit ermittelt werden. Unterschiede in den Halbwertszeiten verzerren das Organ-spezifische Enzymprofil im Serum und liefern dadurch für den Krankheitsverlauf wichtige Informationen. So spricht z.B. bei akuter Hepatitis auf Grund der längeren Halbwertszeit der ALT gegenüber der AST ein abnehmender Quotient AST/ALT für das Abklingen der Hepatitis.

Schwere der Einzelzellschädigung

Sie wird an der Relation Struktur-gebundener zu zytoplasmatisch gelösten Enzymen erkannt (Tab. 1.1-6 – Enzymmuster bei akuter schwerer Organschädigung mit Zellnekrose). Bei leichteren Schäden werden Enzyme des Zytoplasmas freigesetzt, z.B. ALT, zytoplasmatische AST. Durch schwere Schädigung mit Zellnekrose gehen auch mitochondriale Enzyme wie AST und die GLDH ins Plasma über.

Bei Lebererkrankungen sind die Quotienten AST/ALT und (AST + ALT)/GLDH ein Maß der Einzelzellschädigung. Ein Wert von AST/ALT über 1 oder des Quotienten (AST + ALT)/GLDH unter 20 weisen jeweils auf eine akute schwere Leberzellschädigung hin. Das Enzymmuster im Serum gleicht bei akuter Zellschädigung dem des Herkunftsgewebes.

Ausdehnung des Zellschadens

Die Höhe der Enzymaktivität und das Integral unter der Aktivitäts-Zeit-Kurve, bestimmt durch 2–3-malige Messung in 24 Std. über mehrere Tage korrelieren mit der Menge des akut geschädigten Gewebes. Hohe Enzymanstiege sprechen für die Schädigung großer Organe, z.B. Leber, Skelettmuskulatur.

Diagnose der Erkrankung

Bei Patienten mit vieldeutiger akuter klinischer Symptomatik kann das Enzymmuster entscheidende Hinweise zur Diagnose der Erkrankung geben. Wird z.B. bei Schmerzen im Thorax und/oder Abdomen das Muster CK, AST, ALT, Lipase bestimmt, so schließt während des diagnostischen Zeitfensters von 3–12 h eine normal bleibende CK den Herzinfarkt, eine normale ALT die akute Lebererkrankung und eine normale Lipase die Pankreatitis mit hoher Wahrscheinlichkeit aus.

Differentialdiagnostik der Krankheit eines Organs

Beurteilt werden die Serumwerte von Enzymen, die nur in definierten Strukturen oder Geweben eines Organs lokalisiert sind, in Relation zu Enzymen, die in etwa gleicher Aktivität in allen Zellen des Organs vorkommen: Bei Lebererkrankungen, z.B. das Verhalten von GGT, AP oder GLDH in Bezug auf die Aminotransferasen. Durch Quotienten-Bildung können folgende akute Lebererkrankungen differenziert werden:

• GGT/AST: Unterscheidung der akuten Alkohol-toxischen Hepatitis (> 6) von der akuten Virushepatitis (< 1).
• AST/ALT: Differenzierung des frischen Verschlussikterus (< 1) von der chronisch aktiven Hepatitis (> 1).

1.1.3 Enzyme in der Differentialdiagnostik akuter Erkrankungen

In Akutsituationen gibt das Enzymmuster aus Aminotranferasen, CK, α-Amylase/Lipase, AP und GGT Auskunft über das Vorliegen wichtiger Organerkrankungen. Einige Beispiele sind nachfolgend aufgeführt.

1.1.3.1 Differentialdiagnostik bei akutem Thorax- und Abdominalschmerz

Enzymmuster bei akutem Schmerz in Thorax zur differentialdiagnostische Abklärung zeigt Tab. 1.1-7 – Enzymmuster bei akutem Schmerz im Thorax oder Abdomen.

1.1.3.2 Enzymmuster bei Lebererkrankungen

Die Enzymmuster bei akuten und chronischen Lebererkrankungen sind aufgeführt in Tab. 1.1-8 – Enzymmuster bei akuten Lebererkrankungen.

1.1.3.3 Enzymwerte bei Intensivpatienten

Multimorbide Kranke und solche mit Sepsis, Pneumonie, Peritonitis, akuter Pankreatitis, postoperativen oder posttraumatischen Zuständen, schwerwiegenden gastrointestinalen Komplikationen, kardialen Erkrankungen mit Pumpversagen des Herzens, anhaltenden Schockzuständen oder mit hämatologischen Erkrankungen, können trotz primärer Leber- und Pankreasgesundheit veränderte Enzymaktivitäten dieser Herkunftsorgane aufweisen. Ursache ist häufig eine mangelnde Perfusion dieser Organe (Tab. 1.1-9 – Median der Maximalwerte 100 kritisch Kranker ohne primäre Leberkrankheit, aber mit Bilirubinwerten > 3 mg/dl (51 μmol/l)).

Das Sterberisiko kritisch Kranker ist mit der Präsenz von erhöhten Leberwerten bei Aufnahme auf die Intensivstation korreliert. So haben Patienten, die bei Aufnahme eine Erhöhung von ALT, GGT oder AP bis zweifach des oberen Referenbereichwerts haben eine geringere Überlebenschance innerhalb von 30 Tagen (mittlere Odds ratios 2,7, 2,8, 3,9) als diejenigen ohne pathologische Werte. Episoden künstlicher Beatmung oder Hämofiltration führen nach drei Tagen zu einer pathologischen ALT (mittlere Odds ratio 2,7) /26/.

1.1.3.4 Enzymwerte bei operativen Eingriffen

Betroffen sind vorwiegend die Muskelenzyme, in zweiter Linie die Leberenzyme (Tab. 1.1-10 – Häufigkeit erhöhter Enzymwerte nach Abdominaloperation). Bei komplikationslosen Eingriffen wird die maximale Enzymaktivität nach 24–36 h erreicht. Die Höhe der Aktivität und die Dauer der Enzymerhöhung sind abhängig von Art und Ausmaß des Eingriffs.

Bei komplikationslosem Verlauf erfolgt die Normalisierung innerhalb 1 Woche. Bei abdominalen Eingriffen wurden in 76 % der Fälle Erhöhungen der CK und zu 50 % der AST gemessen. Bei der CK betrugen die Erhöhungen bis zum siebenfachen des oberen Referenzbereichswertes (Median 2,1 fach) bei der AST bis zum 3,5 fachen (Median 1,2 fach) /27/.

1.1.3.5 Enzyme bei zerebralen Krampfanfällen

Bei grand mal-Anfällen kommt es regelmäßig zur Erhöhung der CK. Die Aktivität beträgt bis zum 6 fachen des oberen Referenzbereichswertes beim idiopathischen grand mal-Anfall, deutlich höhere Werte werden beim grand mal Anfall nach Alkoholentzug beobachtet und um das 50–100 fache erhöhte Werte im Status epilepticus. Die Maximalwerte werden innerhalb von 1–3 Tagen erreicht, der Abfall in den Referenzbereich nach 4–10 Tagen. Nach Status epilepticus erfolgt der Aktivitätsverlauf von CK, LDH und AST dem Herzinfarkt-Muster, auch die ALT kann erhöht sein. Patienten mit idiopathischem grand mal Anfall haben kein einheitliches Enzymmuster /28/. Von den Isoenzymen der CK zeigen die CK-MB und die CK-BB keine pathologischen Werte.

1.1.3.6 Enzyme bei Krebserkrankungen

Erhöhte Enzymaktivitäten im Serum werden bei Tumorerkrankungen in Abhängigkeit vom Tumorstadium gemessen. Die Enzyme sind jedoch ungeeignet zum Screening für maligne Tumoren. Erhöht sein können Organ-spezifische Enzyme wie die GGT oder die sogenannten ubiquitären Enzyme /29/. Es handelt sich bei den Letzteren um die große Gruppe der glykolytischen Enzyme wie z.B. die LDH. Sie sind in den Metabolismus der Zelle involviert und ubiquitär in allen Organen. Bei Tumorerkrankungen auftretende Enzymerhöhungen können beruhen auf:

• Vermehrter Synthese durch den Tumor wie z.B. AP bei osteogenen Tumoren.
• Der Blockierung von Gangsystemen, z.B. Erhöhung der AP durch Regurgitation des Enzyms in das Blut, z.B. durch Verlegung der Gallenwege beim metastatischen Leberzellkarzinom.
• Induktion des Enzyms durch den Tumor, z.B. AP und GGT beim metastatischen Leberzellkarzinom.
• Änderung der Zellpermeabilität der Tumorzelle mit Leakage des Enzyms in die Zirkulation, z.B. der sauren Phosphatase beim Prostatakarzinom.

Das Verhalten von Enzymen bei Karzinompatienten ist dargestellt in Tab. 1.1-11 – Enzyme bei malignen Erkrankungen.

1.1.4 Einflussgrößen und Störfaktoren

Erhöhte oder erniedrigte Enzymaktivitäten können durch Einflussgrößen und Störfaktoren auf den jeweiligen Test bedingt sein /24/. Einflussgrößen führen in vivo, also schon vor der Blutentnahme, zu Veränderungen der Enzymaktivität im Serum, Störfaktoren ändern das Ergebnis in vitro (Tab. 1.1-12 – Einflussgrößen und Störfaktoren auf Enzyme im Serum).

1.1.4.1 Einflussgrößen

Wichtige Einflussgrößen, die zu Veränderungen der Enzymaktivität führen, sind diagnostische und therapeutische Maßnahmen, Nahrungsaufnahme, Alkohol, körperliche Belastung, Schwangerschaft, Körperlage und Technik der Stauung bei der Blutentnahme sowie posttranslationale Veränderungen des Enzyms, z.B. die Bildung von Makroenzymen.

Nahrungsaufnahme

Zwei Stunden nach einem reichlichen Mittagessen kann es gegenüber dem Ausgangswert zu einem Anstieg der ALT um 10 % und der AST um 20 % kommen, sowie zu einem stärkeren Anstieg der AP. Letzterer ist besonders ausgeprägt bei Personen der Blutgruppen 0 und B und Lewis positiv.

Blutentnahmebedingungen

Körperlage und Technik der Stauung sind von klinischer Bedeutung auf die Enzymwerte. Bei Blutentnahme in sitzender Körperhaltung nach vorherigem, mindestens 15-minütigen Sitzen (Praxisalltag), sind die Enzymwerte 5–10 % höher. Mehr als zweiminütiges Stauen hat den gleichen Effekt, so dass die Addition beider Einflussgrößen eine Aktivitätserhöhung um 10–20 % bewirken kann /32/. Eine sechs-minütige Blutstauung bewirkt den Anstieg von AP, ALT, CK, GGT und LDH um 8–10 % /33/.

Intraindividuelle Variation

Signifikante tageszeitliche Änderungen der Serumenzyme von klinischer Relevanz sind bisher nicht gefunden worden.

Für die intraindividuelle Varianz innerhalb von 6 Monaten wurden in einer Studie /34/ folgende VK-Werte ermittelt: CK 22,8 %, ALT 30 %, AST 12,2 %, LDH 10,3 %, GGT 12,9 %, AP 7,4 %.

Altersabhängigkeit

Folgende Altersabhängigkeiten sind für einzelne Enzyme beschrieben /35/:

• Die AP ist bei Kindern und Jugendlichen etwa 3 fach höher als bei Erwachsenen und nimmt bei Frauen postmenopausal leicht zu.
• Die ALT nimmt bei Männern im Alter ab, bei Frauen bleibt sie konstant.
• Die AST nimmt im Alter zu, besonders bei Frauen.
• Die CK fällt bei Männern im Alter deutlich ab.

Körperliche Belastung

Durch Muskelarbeit steigen bevorzugt die Aktivitäten von CK, AST und LDH an. Höhe, Dauer und Häufigkeit des Anstiegs sind abhängig vom Trainingszustand. Der Anstieg verläuft nach dem Muster CK > AST > LDH, die Normalisierung erfolgt gewöhnlich innerhalb von einer Woche /36/.

Bei Bodybuildern sind z.B. 5 fach erhöhte CK und 2 fach erhöhte AST-Werte beschrieben. Ein weiterer ALT-Anstieg tritt bei Anabolika Einnahme auf.

Während eines Ultra-Langstreckenlaufs von jeweils 50 km täglich über 20 Tage kommt es am 3. Tag bei Athleten zu einem mittleren Anstieg der CK auf das 20 fache, der CK-MB auf das 2 fache und der AST auf das 3 fache des oberen Referenzbereichswerts. Danach fallen bis zum Ende des Laufes die Werte der CK auf das 8 fache ab und CK-MB und AST kehren in den Referenzbereich zurück /37/.

Ernährung

Die Aminotransferasen können sowohl nach längerem Fasten als auch durch hohe Proteinzufuhr ansteigen. Die LDH kann nach fettreicher Kost zu- und nach fettarmer Kost abnehmen. Personen der Blutgruppen 0 und B und Lewis-Antigen positiv haben nach fettreichen Mahlzeiten einen deutlichen AP-Anstieg, bedingt durch die ausgeprägte Zunahme der intestinalen AP.

Schwangerschaft und Ovulationshemmer

Arbeitende Schwangere können einen Anstieg der CK, insbesondere der CK-BB haben. Orale Kontrazeptiva in den Dosierungen der Mikropille führen gewöhnlich nicht zu einem Enzymanstieg. Enzyminduktion wurde beschrieben für die AP und GGT, wenn die Mikropille Ethinylestradiol enthält /38/.

Alkohol

In Abhängigkeit von der konsumierten Menge und der Dauer führt Alkohol zur Erhöhung der GGT, und bei hinzukommender Leberschädigung auch von ALT, AST und GLDH. Der Anstieg kann erheblich sein, wenn der Alkoholgenuss bei oder nach körperlicher Anstrengung erfolgt. Die Enzymanstiege bei Alkoholismus verlaufen nach dem Muster GGT > AST, ALT > GLDH.

Medikamente

Medikamente können durch Enzyminduktion oder Ge­webeschädigung Erhöhungen bewirken (Tab. 1.1-13 – Pharmaka als Einflussgröße auf Enzymaktivitäten).

1.1.4.2 Störfaktoren

Wesentliche Störfaktoren, die eine Veränderung der Enzymaktivität verursachen können, sind Pharmaka, Hämolyse, Hyperbilirubinämie, Hyperlipidämie, Metaboliten der Probe und Antikoagulantien.

Metabolit-bedingte Störungen

Pyruvatkonzentrationen der Probe über 1.100 μmol/l hemmen den optischen Test durch Verbrauch von NADH₂ im Vorinkubationsschritt /39/. Falsch-normale Aktivitäten von AST, ALT und GLDH werden gemessen. Das Pyruvat tritt aus den Erythrozyten in das Serum über, wenn die Abtrennung der Erythrozyten erst nach vielen Stunden erfolgt.

Pharmaka

Der Einfluss von Pharmaka in vitro auf kinetische Enzymbestimmungen ist gering. Eine detaillierte Literaturzusammenfassung ist bei Lit. /40, 41, 42/ gegeben.

Hyperbilirubinämie

Stört gewöhnlich kinetische Enzymbestimmungen nicht. In einer Studie /43/, in der Proben eine Konzentration an Bilirubin von 29,2 mg/dl (500 μmol/l) hatten, wurden AP, ALT, AST, α-Amylase, CK, GGT und LDH an 16 Analyse-Systemen bestimmt. An drei Analyse-Systemen war die Messung der AST gestört, an zwei die der ALT und an einem die LDH.

Hämolyse

Stört in Abhängigkeit von der Konzentration kinetische Enzymbestimmungen. In einer Studie /43/, in der Proben eine Konzentration an freiem Hämoglobin von 2,4 g/l (240 μmol/l) hatten, wurden an 16 klinisch-chemischen Analyse-Systemen bestimmt: AP, α-Amylase, CK, GGT. Gestört wurde die Messung der AP an 8, der CK an 9 und der GGT an 3 Analysensystemen.

Hypertriglyzeridämie

Stört kinetische Enzymbestimmungen an mechanisierten Analysesystemen bis zu einer Konzentration von 610 mg/dl (700 μmol/l) gewöhnlich nicht /43/.

Antikoagulantien in diagnostischen Proben

Alle Enzymbestimmungen können im Serum und im mit Heparin antikoagulierten Plasma erfolgen. Im EDTA-Plasma ist auch die Bestimmung von ALT, AST, CK, GLDH und LDH möglich. Citrat-Plasma sollte zur Enzymbestimmung nicht verwendet werden, da nur ungenügende Untersuchungen über Störfaktoren vorliegen /44/.

Enzymstabilität bei Lagerung /45/

In den vom Blutkuchen getrennten Seren sind AP, α-Amylase, ALT, AST, CK, CHE, GGT und LDH für mindestens 4 Tage bei 9 °C stabil, bei 20 °C sind es bis zu 3 Tage für AP, α-Amylase, ALT, AST und CHE.

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1.2 Diagnostik bei erhöhten Leberenzymen

Lothar Thomas

Erhöhte Leberenzyme können durch eine Vielzahl von Ursachen und Faktoren bedingt sein. Anamnese, klinische Untersuchungen mit Oberbauchsonographie und labordiagnostische Befunde ermöglichen in der Regel die Diagnostik der vorliegenden Erkrankung.

Die Laborbefunde erlauben neben der Diagnosestellung eine Beurteilung der Hepatopathie in akut und chronisch, die Schätzung des Schweregrades, Hilfestellung bei der Ätiologieabklärung, eine prognostische Aussage sowie das Monitoring der Therapie.

1.2.1 Leber-assoziierte Basisdiagnostik

Wichtige Basisuntersuchungen, deren Konstellation in Zusammenhang mit der Anamnese in viele Fällen schon primär eine Richtung anzeigen, sind /1/:

• Die Aminotransferasen ALT und AST. Erhöhte Werte weisen etwa 8 % der Normalbevölkerung auf. Erhöhungen sprechen für eine Leberentzündung (z.B. Virushepatitis, autoimmune Hepatitis) oder weisen auf eine asymptomatische Lebererkrankung hin. Aufgrund der Zunahme von Fettlebererkrankungen hat die Häufigkeit erhöhter Aminotransferasen in den letzten Jahren zugenommen. Werte im Referenzbereich schließen eine Lebererkrankung nicht aus, insbesondere nicht bei Fettlebererkrankung oder chronischer Infektion mit Hepatitisviren. Die Aminotransferasen sind nicht nur ein Indikator für Lebererkrankungen, sondern auch ein Marker des allgemeinen Risikos von Morbidität und Mortalität.
• Die γ-Glutamyl-Transferase (GGT). Sie ist ein cholestatischer und metabolischer Parameter und erhöht bei alkoholischer oder nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung. Patienten mit erhöhter GGT haben auch das Risiko einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität.
• Die alkalische Phosphatase (AP), sie ist ein Marker der Cholestase, z.B. primäre biliäre Zirrhose, primär sklerosierende Cholangitis.
• Bei Erhöhung der Aminotransferasen und Verdacht auf eine Virushepatitis ist die Hepatitis-Serologie (HBsAg und anti-HBc) ein Bestandteil der Basisdiagnostik.
• Zur Abschätzung des Gewebeschadens bei akuten schweren Lebererkrankungen haben die Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) und der Bilirubinwert eine Bedeutung. Der GLDH-Wert gibt aber nur eine begrenzte Auskunft über das Ausmaß der Gewebeschädigung und zur Prognose.

1.2.2 Erfassung extrahepatischer Faktoren

Die Enzyme der Basisdiagnostik können auch bei hepatischen Begleitreaktion im Rahmen von extrahepatischen und systemischen Erkrankungen erhöht sein. Das kann z.B. der Fall sein bei Pankreatitis, exogen-toxischen, exogen-allergischen, autoimmunen, vaskulären und metabolischen Erkrankungen.

Laboruntersuchungen: Blutbild, Albumin, Serumprotein-Elektrophorese, Cholesterin, Triglyceride, HbA_1c, Ferritin /1/.

1.2.3 Ergänzende Differenzierung /1/

Ergeben Basisuntersuchungen den Hinweis auf eine Lebererkrankung, sind weiterführende Laboruntersuchungen zur Differenzierung erforderlich.

Laboruntersuchungen: HBsAg, anti-HCV, IgG, IgA, IgM, ANA, AMA, SMA, LKM-Ak, SLA, pANCA (siehe Tab. 25.2-1 – Immunfluoreszenzmuster an HEp2-Zellen; assoziierte Antigene und Krankheiten), Coeruloplasmin, Cu im 24 h-Urin, HFE-Mutation, α₁-Antitrypsin-Genotyp.

1.2.4 Chronische Lebererkrankungen

Chronische Lebererkrankungen verlaufen in der Regel asymptomatisch. Die Erhöhung der ALT und der GGT sind moderat und betragen das 2–5 fache des oberen Referenzbereichswerts. Differentialdiagnostisch beachtet werden muss, dass die ALT-Erhöhung nach Untersuchungen in den USA 8 % in der Normalbevölkerung beträgt und zu 70 % primär unklar ist. Wesentliche Ursache scheint die Fettleber in Form der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) bei Adipositas und dem metabolischen Syndrom und nicht die Nicht-alkoholische Fettleber (NAFL) zu sein /2/.

Wesentliche Merkmale der chronischen Lebererkrankungen sind Inflammation und Fibrose. Die Stadieneinteilung basiert auf einer Beurteilung der progredienten Ablagerung von fibrotischer extrazellulärer Matrix (ECM), auch als Fibrogenese bezeichnet. Die qualitative Zusammensetzung der ECM (verschiedene Kollagentypen, Proteoglykane, strukturelle Glykoproteine, Hyaluronsäure) und ihre räumliche Verteilung in der Leber unterliegen einer erheblichen Variation.

Zusätzlich wird das Stadium durch kompensatorische regenerative Prozesse mit Veränderung der anatomischen Struktur bestimmt.

Die Leberbiopsie ist der Goldstandard zur Einschätzung der Fibrose. Hinweise auf den fibrotischen Umbau geben auch Laboruntersuchungen (Anstieg des De Ritis-Quotienen, Thrombozytopenie, Hypergammaglobulinämie, Cytokeratin-18-Fragmente). Da die Aussagekraft der Einzelparameter gering ist, wurden Scores für das Fibrose-Staging entwickelt (Tab. 1.2-1 – Bewertung des diagnostischen Vermögens von Scores bei akutem Nierenversagen und akutem Leberversagen).

Fettleber

Unterschieden von der alkoholischen Fettleber werden:

• Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD).
• Nicht-alkoholische Fettleber (NAFL) eine benigne Form der NAFLD.
• Nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH). Die NASH ist charakterisiert durch eine mikrovaskuläre Steatose, die Vergrößerung der Hepatozyten mit Einlagerung von Fetttröpfchen und die lobuläre oder portale Inflammation mit oder ohne Fibrose.

Leberzirrhose

Die Leberzirrhose ist die über Jahre bis Jahrzehnte progredient verlaufende Endstrecke vieler chronischer Lebererkrankungen /3/. Es besteht ein knotiger Parenchymumbau mit fibröser Septierung eine Infiltration von Entzündungszellen und eine Veränderung des Gefäßbettes. Die Progression der Leberzirrhose wird von ihrer Ätiologie bestimmt. Wesentliche Ursachen sind die alkoholische und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung, die Hepatitis B, die Hepatitis C und die Kombination von Hepatitis C und Alkoholabusus. Mit zunehmenden Strukturänderungen des Organs kommt es zum Verlust der Funktion und zum portalen Hypertonus. Auf Grund einer vaskulären Dysfunktion werden verstärkt vasokonstriktorische Hormone ausgeschüttet. Drohende Komplikationen sind: Intestinale Blutung, Ascites, Enzephalopathie und das hepatozelluläre Karzinom /5/.

Hepatozelluläres Karzinom (HCC)

Die Mehrzahl der hepatozellulären Karzinome entstehen auf dem Boden einer Zirrhose. Das Karzinomrisiko ist von der vorliegenden Lebererkrankung abhängig und beträgt /3/:

• Bei chronischer Hepatitis B mit einer Viruslast > 10⁷ Kopien/ml 19,8 % in 13 J.

• Bei der Autoimmunhepatitis 2,9 % in 10 J.

Labordiagnostik

Befunde bei der alkoholischen Fettleber sind stärkere Erhöhungen der GGT als der ALT. Bei der NASH mit Enzymerhöhung sind die Verhältnisse umgekehrt. Die NAFL zeigt in der Regel keine Erhöhung der Leberenzyme. Befunde bei chronischer Lebererkrankung mit Übergang zur Leberzirrhose sind gering erhöhte Aminotransferasen, Hypoalbuminämie, Thromboplastinzeit-Verlängerung, Verminderung der Cholinesterase, Hyperbilirubinämie. Zeichen der fortgeschrittenen Lebererkrankung mit Übergang in die Zirrhose ist die Thrombozytopenie.

Die Cytokeratin-18-Fragmente (CK-18) sind ein im Serum bestimmbarer Fibrosemarker der NASH. So hatten in einer Studie /4/ Kontrollpersonen CK-18-Werte von im Mittel 145 U/l (25. bis 75. Perzentile 126–190) und Patienten mit NASH von 244 U/l (161–427). Das Risiko einer NASH, ausgedrückt als Odds-Ratio nahm mit jeder Erhöhung um 50 U/l um 30 % zu.

1.2.5 Scores: Leberversagen, Nicht-alkoholische Fettleber Erkrankung (NAFLD)

Das Leberversagen beruht auf einer irreversiblen chronischen Lebererkrankung oder dem akuten Leberversagen. Die Lebertransplantation ist die einzige kausale Therapie /6/.

Chronische Erkrankungen als Ursache des Leberversagens sind: Alkohol-toxische Leberzirrhose, virale und autoimmune Hepatitiden, cholestatische Lebererkrankungen, Malignome, Stoffwechselerkrankungen und genetische Erkrankungen (M. Wilson, Hämochromatose, α₁-Antitrypsinmangel, Harnstoffzyklus-Störungen, Speicherkrankheiten).

Das akute Leberversagen ist potentiell reversibel. Die wesentlichen Ursachen sind die akute Paracetamol-Intoxikation und die akute Hepatitis B-Infektion. Zur prognostische Einschätzung und Selektion der Patienten mit irreversiblen Leberversagen ist die Lebertransplantation die Behandlungsoption. Zur Indikation gibt es Scoring-Systeme (Tab. 1.2-1 – Bewertung des diagnostischen Vermögens von Scores beim akuten Nierenversagen und akutem Leberversagen).

Zur Regelung der Organvergabe wurde in der Region von Eurotransplant der Model for Endstage Liver Disease (MELD)-Score etabliert. Er basiert auf der Bestimmung von Bilirubin und Creatinin im Serum und der International Ratio (INR) durch Bestimmung im Citratblut.

MELD/PELD-Score /7/

Der Model for Endstage Liver Disease (MELD) Score für Erwachsene und der Pediatric Endstage Liver Disease (PELD) Score für Kinder sind ein Maß für die Dringlichkeit einer Lebertransplantation. Die Schätzung der Dreimonatsmortalität im Endstadium einer chronischen Lebererkrankung ist möglich. Das multivariable Modell (MELD 3.0) zeichnet sich aus durch (1) zusätzliche Variable wie weibliches Geschlecht und die Konzentration von Albumin, (2) Interaktion von Bilirubin und Natrium und zwischen Albumin und Creatinin und (3) eine obere Grenze für Creatinin bei 3.0 mg/dl. MELD 3.0 hat eine verbesserte Diskrimination.

Der Pädiatrische End-stage Liver Disease (PELD) Score für Kinder ist ein Kriterium der Dringlichkeit für eine orthoptische Lebertransplantation, denn auch mit dem PELD wie mit dem MELD wird die Wahrscheinlichkeit des Versterbens innerhalb der folgenden 3 Monate bestimmt.

Berechnung des MELD Score und des MELD 3.0 Score

MELD = 10 × (0,957 Log_e serum creatinine [mg/dL]) + 0,378 × Log_e (total Bilirubin [mg/dL]) + 1,12 × Log_e (INR) + 0,643

MELD 3.0 = 1,33 (wenn weibl.) + [4,56 × Log_e [Total-Bilirubin [mg/dL) + (0,82 × (137-Na)] – [0,24 × (137-Na) × Log_e (Total-Bilirubin)] Log_e + [9,09 + Log_e (INR)] + [11,14 × Log_e (Creatinin) + [1,85 × (3,5-Albumin) – [1,83 × (3,5-Albumin) × Log_e (Creatinin)] + 6

Berechnung des PELD Score

Score = [0,436 × Alter] – [0,687 Log_e Albumin (g/dL)] + [0,48 × Log_e Total-Bilirubin (mg/dL)] + [1,857 × Log_e INR] + [0,667 × Wachstumsverzögerung (< 2 SD)]

Log_e = Logarithmus naturalis, Bilirubin = mg/dL, Creatinin = mg/dL, Albumin= g/L, Natrium = mmol/L. Ist beim MELD score, Creatinin ≤ 1 mg/dL, wird der Wert von 1 eingesetzt.

Bewertung des MELD Score: Die Scores betragen 6 bis 40, je höher der Score, um so höher die Wahrscheinlichkeit ohne Transplantation in den nächsten 3 Monaten zu versterben.

Bewertung des MELD 3.0 Score: Die Scores betragen 13 bis 26, je höher der Score, um so höher die Wahrscheinlichkeit ohne Transplantation in den nächsten 3 Monaten zu versterben /56/.

Bewertung des MELD Score: Die Bewertung des Scores und die Prognose nach Transplantation zeigt Tab. 1.2-3 – Mortalitätsrate (%) innerhalb von 3 Monaten als eine Funktion des MELD Score. Zur Bewertung des PELD Score wird dieser in den MELD Score transformiert nach einer Gleichung /7/.

Prognose des Paracetamol-Leberschadens /8/

Tägliche Bestimmung von α-Fetoprotein (AFP) ab dem Zeitpunkt, an dem die ALT den Wert von 1.000 U/l überschritten hat, für 7 Tage. Überlebende zeigen einen AFP-Anstieg im Median am Tag 1, Nicht-Überlebende erst nach 4,1 Tagen. Überschreitet AFP am Tag 1 nicht 3,9 μg/l, so identifiziert dies Nicht-Überleben (diagnostische Sensitivität 100 %, bei einer Spezifität von 74 %, positiver prädiktiver Wert 45 %, negativer prädiktiver Wert 100 %).

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) fibrosis score

Die NAFLD und insbesondere die NASH sind klinisch relevante Krankheitsbilder, die einer strukturierten Diagnose, Kontrolle und einer effektiven Intervention bedürfen. Im Algorithmus der Leitlinie wird auf Basis des NAFLD Fibrosis Score und einer Leberelastographie die Entscheidung zur Leberbiopsie getroffen. Dies besonders unter dem Aspekt, dass die Leberenzyme nicht gut mit der Entzündung oder dem Verlauf der Erkrankung korrelieren und auch in der Verlaufskontrolle nur eingeschränkt zu verwerten sind. Der NAFLD Score umfasst Alter, BMI, die Werte von ALT, AST, Thrombozytenzahl, die Albuminkonzentration und das Vorliegen eines Diabetes/Prädiabetes (impaired fasting glucose). Online Kalkulatoren sind im Internet verfügbar /9, 10/.

Die Schwere eines Leberzellschadens kann vermittels des Child-Turcotte-Pugh Scores kalkuliert werden (Tab. 1.2-4 – Modifizierter Child-Turcotte-Pugh Score zur Beurteilung der Schweregrades einer Lebererkrankung).

1.2.6 Hepatopathien und Laborbefunde

Die Klinik und Labordiagnostik bei akuten und chronischen Hepatopathien ist aufgeführt in

• Tab. 1.2-5 – Laboruntersuchungen bei Hepatopathien
• Tab. 1.2-6 – Hepatitis B Status
• Tab. 1.2-7 – Beurteilung von Patienten mit chronischer Hepatitis B in Abhängigkeit von HBe.

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1.3 Alkalische Phosphatase (AP)

Lothar Thomas

Die alkalische Phosphatase ist ein Zellmembran-gebundenes Enzym, das in allen Geweben exprimiert wird. Die AP im Serum repräsentiert in der Methode der Isoelektrofokussierung die Aktivität von mehr als 17 Isoformen. Vier genetisch kodierte Varianten der AP sind identifiziert /1/:

• Die drei Gewebe-spezifischen Isoenzyme Dünndarm-AP, Plazenta-AP, Keimzell-AP.
• Die Gewebe-unspezifische AP.

Die Gene der Gewebe-spezifischen Isoenzyme kommen vorwiegend in den Geweben vor, von denen sie ihren Namen haben. Das Gewebe-unspezifische Gen wird von verschiedenen Geweben exprimiert. Die Produkte dieses Gens unterliegen der posttranslationalen Modifikation in der Glykosilierung, wodurch Isoformen wie die Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP entstehen. Insgesamt sind mindestens 15 Isoformen der AP bekannt. Das Gen der Plazenta-AP liegt in zahlreichen allelen Modifikationen vor.

In jedem Gewebe zeigt die AP eine gewisse Mikroheterogenität bezugnehmend der molekularen Ladung und Größe, die von dem Muster der Glykierung abhängt. Ebenfalls kann die AP als Makroenzym oder als Particulate AP, gebunden an Membran-Fragmente, vorliegen.

Mit gängigen Labormethoden sind beim Gesunden die Leber-AP, Knochen-AP und Dünndarm-AP im Serum nachweisbar. Mit der Anionenaustauscher High performance liquid chromatography sind im Serum des Gesunden sechs AP-Isoformen bestimmbar, Knochen/Dünndarm-AP, zwei Knochen-AP und drei Leber-AP /2/. Sie unterscheiden sich im Wesentlichen im Sialinsäuregehalt der Kohlenhydrat-Seitenketten.

Die Bestimmung der Gesamt-AP wird routinemäßig eingesetzt. Zur Erhöhung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität wird bei bestimmten Fragestellungen, auch wenn die Gesamt-AP normal ist, die Bestimmung von AP-Isoenzymen durchgeführt. Die häufigste Fragestellung ist die Differenzierung der Isoformen Leber-AP und Knochen-AP bei erhöhter Gesamt-AP

Alkalische Phosphatase bei malignen Tumoren

Die Gewebe-spezifischen Isoenzyme Plazenta-AP und Keimzell-AP können bei malignen Tumoren verstärkt exprimiert werden. Sie werden auch als Regan-Typ-AP bezeichnet. Ihre Expression in Krebszellen lässt vermuten, dass es sich um onkofetale Proteine handelt, die in die Tumorgenese involviert sind. Tumoren, die diese Isoenzyme exprimieren, werden differenziert in solche mit:

• Eutoper Expression; eine physiologisch vorkommende AP wird verstärkt synthetisiert.
• Ektoper Expression; eine AP wird synthetisiert, die physiologisch nicht in dem Gewebe vorkommt, aber z.B. in malignen Tumoren.

Die von den Zellen des Synzytiotrophoblasten gebildete Plazenta-AP kann ektopisch in Karzinomen exprimiert werden. Da sie primär bei einem Bronchialkarzinom-Patienten mit dem Namen Regan nachgewiesen wurde, wird sie auch als Regan-Typ AP bezeichnet. Bis auf wenige Ausnahmen gleicht die Regan-AP im biochemischen Verhalten der Plazenta-AP. Sie wird bei Seminomen, Karzinomen von Ovar, Uterus, Lunge, in malignen Tumoren des Gastrointestinaltraktes, von Hypophyse und Thymus nachgewiesen.

1.3.1 Indikation

Gesamt-AP

• Diagnose und Verlauf von Cholestasen bei hepatobiliären Erkrankungen wie Verschlussikterus, biliäre Zirrhose, Cholangitis, cholestatische Form der Virushepatitis, Medikamenten-bedingte und alkoholische Hepatitis, primäre Lebertumoren, Lebermetastasen.
• Diagnose und Verlaufsbeurteilung von Skeletterkrankungen wie M. Paget, Rachitis, Osteomalazie, Vitamin D-Mangel-bedingte Knochenerkrankungen, renal-bedingte Osteopathien, primäre Knochentumoren, Knochenmetastasen, multiples Myelom, Hyperparathyreoidismus, Akromegalie, Hyperthyreose, ektope Ossifikation, Sarkoidose, Knochentuberkulose.
• Familiäre Hypophosphatasämie, adyname Knochenerkrankung, Hypothyreose.

AP-Isoenzyme

Bei vielen klinischen Fragestellungen hat die Gesamt-AP genügend Aussagekraft. Bei einer Erhöhung kann die Bestimmung der Isoenzyme, insbesondere der Knochen-AP eine Feststellung des Ursprungsgewebes bzw. Ursprungsorgans ermöglichen.

Die Bestimmung der Knochen-AP ist indiziert /3/:

• Bei Verdacht auf eine Osteopathie, z.B. Verlaufsbeurteilung der Niereninsuffizienz oder von Tumorpatienten.
• Zur Verlaufs- und therapeutischen Beurteilung einer Osteopathie, denn die Knochen-AP reagiert sensitiver auf Veränderungen des Knochenstoffwechsels als die Gesamt-AP.
• Differenzierung von Knochen-AP und Leber-AP.

1.3.2 Bestimmungsmethode

1.3.2.1 Gesamt-AP (Orthophosphorsäure-monoester phosphohydrolase, EC 3.1.3.1)

Methode der International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) /4/

Prinzip: Die Bestimmung der katalytischen Aktivität der AP im Serum ist abhängig von den gewählten Reagenzien und ihrer Konzentration, insbesondere des Puffers. Bestimmt wird die Phosphomonoesterase-Aktivität der AP unter Verwendung von 4-Nitrophenylphosphat (NPP) und 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP). In Gegenwart von AMP wirkt die AP als Transferase für Phosphor und überträgt eine Phosphatgruppe von NPP auf AMP, das seinerseits die Dephosphorylierung des Substrats beschleunigt. Die Menge des pro Zeiteinheit gebildeten farbigen Produktes (NP), gemessen als Absorptionszunahme bei 405 nm, ist ein Maß der katalytischen Aktivität der AP (Tab. 1.3-1 – Prinzip der AP-Bestimmung) Die Reaktionsführung erfolgt durch Substratstart.

1.3.2.2 Isoenzyme und Isoformen der AP

In den letzten 30 Jahren wurde eine Vielzahl von Methoden zur Bestimmung der Isoenzyme und Isoformen der AP beschrieben. Mittels unterschiedlicher Verfahren können über 15 Isoenzyme und Isoformen differenziert werden /2/. Die in der klinischen Routinediagnostik wichtige Differenzierung einer erhöhten Gesamt-AP in die Leber-AP und Knochen-AP kann elektrophoretisch erfolgen. Die quantitative Bestimmung der Knochen-AP erfolgt durch Immunoassays oder Lektinpräzipitation. Das Plazenta-Isoenzym wird im Immunoassay quantitativ bestimmt.

Elektrophoretische Differenzierung

Trennung nach Neuraminidase Behandlung: Serum wird vor der elektrophoretischen Trennung mit Neuraminidase inkubiert. Dieses Enzym entfernt negativ geladene Sialinsäurereste schneller von der Oberfläche der Knochen-AP als von der Leber-AP.

Bei Auftrennung der AP-Isoformen im alkalischen Puffermilieu Richtung Anode auf dem Trägermedium Polyacrylamid oder Agarose wird die elektrophoretische Beweglichkeit der Knochen-AP in Relation zur Leber-AP verlangsamt. Dadurch sind Leber- und Knochen-AP, die durch Elektrophorese von unbehandeltem Serum nur ungenügend zu trennen sind, abzugrenzen. Die semiquantitative Auswertung erfolgt densitometrisch nach Darstellung der Isoform-Aktivitäten auf dem Trägermedium.

Lektin-Affinitäts-Elektrophorese /5/: im alkalischen Puffer wird Serum in Richtung Anode auf Weizenkeimlektin haltigen Trägermedium (Zelluloseacetatfolie, Agarosegel) aufgetrennt. Weizenkeimlektin bindet die Knochen-AP, so dass diese weniger mobil ist, nahe der Auftragsstelle liegen bleibt und von den anderen AP-Isoformen, insbesondere der Leber-AP abgetrennt wird. Die semiquantitative Auswertung erfolgt reflektometrisch nach Darstellung der Aktivitäten der Isoformen auf dem Trägermedium.

Quantitative Bestimmung der Knochen-AP

Lektin-Präzipitation /6/: Zuerst erfolgt die Bestimmung der Gesamt-AP. Dann wird mit einem Fällungsreagenz, einem Lektin aus Weizenkeimen, die Knochen-AP ausgefällt und nachfolgend im Überstand die Restaktivität gemessen. Die Aktivität der Knochen-AP wird durch Differenzbildung berechnet.

ELISA zur Bestimmung der Knochen-AP /7/: Die Serumprobe wird mit Puffer in einer mit monoklonalen Antikörpern gegen Knochen-AP beschichteten Vertiefung einer Mikrotiterplatte inkubiert. Nach Entfernen des nicht gebundenen Materials wird das Substrat p-Nitrophenylphosphat hinzugegeben und die Antikörper-gebundene Enzymaktivität photometrisch bestimmt.

Immunometrischer Test zur Bestimmung der Knochen-AP /8/: Es handelt sich um einen Festphasen-Assay im Zweischrittverfahren. Eine spezifische Determinante der Knochen-AP der Probe reagiert mit dem monoklonalen Antikörper auf einer Kugel (Festphase). Gleichzeitig reagiert eine zweite spezifische Determinante der Knochen-AP mit einem zweiten radioaktiv oder Enzym-markierten monoklonalen Antikörper unter Bildung eines Sandwich aus Festphase, Knochen-AP und markiertem Antikörper. Nach Waschen der Kugel wird Festphase-gebundene Radio- oder Enzymaktivität gemessen. Untere Nachweisgrenze 2 μg/l.

Quantitative Bestimmung der Plazenta-AP

ELISA zur Bestimmung der Aktivität /9/: Die Serumprobe wird mit Puffer für 3 h bei 37 °C in einer mit monoklonalem Antikörper gegen humane Plazenta-AP beschichteten Vertiefung einer Mikrotiterplatte inkubiert. Nach Entfernen der nicht Antikörper-gebundenen Probenbestandteile durch einen Waschschritt wird mit Substratlösung (p-Nitrophenylphosphat) inkubiert und nachfolgend die Enzymaktivität durch photometrische Messung des gebildeten p-Nitrophenolat bei 405 nm bestimmt. Untere Nachweisgrenze 30 mU/l.

1.3.3 Untersuchungsmaterial

Serum oder Heparinplasma, kein EDTA-, Citrat- oder Oxalatplasma: 1 ml

1.3.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.3-2 – Referenzbereich der AP.

1.3.5 Bewertung

1.3.5.1 Erhöhung der Gesamt-AP Aktivität

Beim gesunden Erwachsenen besteht die im Serum oder Plasma messbare Gesamt-AP zu etwa gleichen Anteilen aus der Leber-AP und Knochen-AP. Bei Kindern bis zum 15. Lj. hat die Knochen-Isoform einen Anteil von bis zu 80 % an der Gesamt-AP Aktivität. Etwa 25 % der Gesunden haben auch Dünndarm-AP, die im Nüchternzustand etwa 10 % der Gesamt-AP Aktivität ausmacht. Andere Isoenzyme oder Isoformen der AP haben einen Anteil von unter 5 % an der Gesamt-AP Aktivität /14/.

Erhöhungen der Gesamt-AP können physiologisch bedingt sein oder beruhen auf einer Erkrankung der Leber oder des Skelettsystems. Auch die Leukozyten und die Nieren geben AP in die Zirkulation ab. Das erfolgt aber nicht in Mengen, die zu einer Erhöhung der Gesamt-AP über die obere Referenzbereichsgrenze führen.

Physiologisch sind Anstiege oder Erhöhungen der Gesamt-AP sowie ihrer Isoenzyme und Isoformen:

• In der Schwangerschaft. Im 2. Trimenon nimmt die Gesamt-AP Aktivität signifikant zu und erreicht im letzten Trimenon ein Maximum mit dem 2–3 fachen des Wertes im ersten Trimenon. Die Aktivität der Gesamt-AP besteht in diesem Trimenon anteilig aus Plazenta-AP 51 %, Knochen-AP 37 %, Leber-AP 9 % und Dünndarm-AP 3 % /15/. Die Zunahme der Gesamt-AP Aktivität in der Schwangerschaft korreliert mit der Zunahme von Cholesterin und den Triglyceriden /16/. 4–6 Wochen post partum werden wieder die Ausgangswerte erreicht /16/.
• Bei Kindern in der Wachstumsphase (Knochen-AP). So sind die medianen Werte der Gesamt-AP und der Knochen-AP relativ konstant bis zum 10. Lj, steigen dann bis zum 14. Lj. an (Faktor 2–3), um danach wieder abzufallen /17/.
• Postprandial bei Personen der Blutgruppen 0 und B, Lewis positiv, die Sekretoren der H-Blutgruppensubstanz sind (Dünndarm-AP). Die Aktivität der Darm-AP nimmt nach der Nahrungsaufnahme, insbesondere nach fettreicher Mahlzeit zu, da das Enzym über den Ductus thoracicus lymphogen ins Blut gelangt. Erfolgt die Blutentnahme früher als 12 h nach Nahrungsaufnahme, kann die Dünndarm-AP erhöht sein /18/.
• Bei Frauen in der Spätmenopause. Personen mit normaler prämenopausaler Gesamt-AP und Knochen-AP können postmenopausal Anstiege von 30–60 % aufweisen, obwohl die Werte oft noch im Referenzbereich liegen /19/. Bei Werten der Gesamt-AP im oberen Drittel des Referenzbereichs sollte eine Knochendichtemessung durchgeführt werden, die Knochen-AP und Parathormon bestimmt werden. Auch sollte ein Marker, der auf den verstärkten Abbau von Knochensubstanz hinweist, bestimmt werden wie N-terminales Propeptid (PINP) oder Carboxy-terminal verknüpfte Telopeptide (β-crosslaps). Siehe auch Beitrag 6.7 – Erhöhung der Gesamt-AP Aktivität.

Pathologische Erhöhung der Gesamt-AP und/oder von Isoenzymen oder Isoformen der AP können bedingt sein durch:

• Leber- und Gallenwegs-Erkrankungen (Tab. 1.3-3 – Erkrankungen der Leber und Gallenwege, die mit erhöhter Gesamt-AP einhergehen können).
• Erkrankungen des Skeletts und des Vitamin-D-Stoffwechsels (Tab. 1.3-4 – Erkrankungen des Skeletts, die mit erhöhter Gesamt-AP einhergehen).
• Maligne Tumoren (Tab. 1.3-5 – AP als Marker bei malignen Tumoren und Knochenmetastasen).
• Systemische Erkrankungen ohne primäre Leber- oder Knochenerkrankung (Tab. 1.3-6 – Erhöhung der AP ohne erkennbare hepatobiliäre Erkrankung oder Knochenerkrankung).

Die Bestimmung von Isoenzymen und Isoformen der AP kann bei Erhöhung der Gesamt-AP oder bei noch im Referenzbereich liegenden Aktivitäten Auskunft geben über:

• Die Herkunft der AP; klinisch bedeutsam ist die Fragestellung, ob eine Erhöhung der Gesamt-AP Leber- oder Skelett-bedingt ist. Da eine gute Überstimmung zwischen den beiden kanalikulären Enzymen Leber-AP und GGT besteht, weist eine erhöhte GGT in der Regel auf die Leber als Ursprungsort hin. Das schließt jedoch nicht eine gleichzeitig bestehende Erhöhung der Knochen-AP aus, insbesondere bei Tumorpatienten. In diesen Fällen ist die semiquantitative elektrophoretische Isoenzym-Differenzierung ausreichend. Da die Tests zur quantitativen Bestimmung der Knochen-AP zu 5–16 % eine Kreuzreaktivität mit der Leber-AP haben, sind sie zur Diagnostik einer Knochen-AP Erhöhung ungeeignet, wenn bei einer 2–3 fach erhöhten Gesamt-AP die GGT ebenfalls um ein mehrfaches erhöht ist.
• Die Stoffwechselaktivität des Skeletts. Die Knochen-AP ist bei osteoblastischen Knochenprozessen wie dem metastasierten Prostatakarzinom moderat bis stark erhöht, bei osteoklastischen wie dem metastasierten Mamakarzinom oder dem multiplen Myelom leicht bis moderat und bei der Osteoporose nicht oder nur leicht erhöht. Zur Beurteilung dieser Vorgänge hat die quantitative Bestimmung der Knochen-AP eine höhere diagnostische Sensitivität und Spezifität als die Gesamt-AP.
• Das Wachstum malignen Gewebes. Die neoplastische AP, auch als Regan-Typ-AP bezeichnet, kann nachweisbar sein. Die Regan-Typ-AP, die ein elektrophoretisches Verhalten wie die Plazenta-AP zeigt und sich nur in wenigen biochemischen Eigenschaften von dieser unterscheidet, wird als Plazenta-AP nachgewiesen. Sie wird im Serum bestimmt bei Patienten mit Hoden-, Ovarial-, Lungen-, Blasen- und gastrointestinalen Tumoren /20/.

Erkrankungen der Leber und Gallenwege

Die häufigste Ursache erhöhter Gesamt-AP Werte sind Erkrankungen der Leber und Gallenwege. Die Gesamt-AP ist bei etwa 60 % der Leber- und Gallenwegs-Erkrankungen pathologisch. Differentialdiagnostische Bedeutungen hat sie im Muster mit der AST, ALT und GGT zur Erkennung einer Cholestase. In Relation zur Aktivität der Aminotransferasen ist die Gesamt-AP hoch bei Cholestase und normal oder nur gering erhöht bei fehlender cholestatischer Komponente. Die diagnostische Sensitivität der AP für cholestatische Lebererkrankungen beträgt 80–100 %, bei alkoholischen Leberschäden nur 25 % /21/. Die Höhe der Gesamt-AP ist deshalb ein gutes diagnostisches Kriterium bei Lebererkrankungen mit hoher GGT zur Unterscheidung des alkoholischen Schadens von der Cholestase. Kein oder ein relativ niedriger Anstieg der Gesamt-AP in Relation zur GGT spricht für den alkoholischen Schaden. Eine erhöhte Gesamt-AP wird auch bei metastatischen und infiltrativen Lebererkrankungen wie Leukämie, Lymphom und Sarkoidose gefunden.

Medikamenten-toxische Leberschädigungen können nahezu das gesamte Spektrum der Lebererkrankungen imitieren. Die akute Hepatitis ist jedoch mit etwa 90 % die häufigste Form. Vermittels der Bestimmung von ALT und Gesamt-AP wird die Medikamenten-toxische Hepatitis in drei Verlaufsformen eingeteilt /22/:

• Akuter hepatozellulärer Verlauf. Die ALT ist höher als das 2 fache des oberen Referenzbereichswerts bei einem Quotienten ALT/Gesamt-AP über 5. Es handelt sich meist um eine immun-allergische Hepatitis, die von vielen Medikamenten ausgelöst werden kann und gewöhnlich innerhalb von 1–3 Monaten ausheilt.
• Akuter cholestatischer Verlauf. Es besteht eine isolierte Erhöhung der Gesamt-AP mit Werten über 2 fach des oberen Referenzbereichswerts. Bei der reinen cholestatischen Form liegen Juckreiz und Ikterus vor, konjugiertes Bilirubin und die GGT sind erhöht, die Aminotransferasen normal. Meist sind Hormonpräparate die Ursache. Bei der akut cholestatisch-hepatitischen Form, die mit Fieber und Schüttelfrost einhergeht ist der Quotient ALT/Gesamt-AP unter 2.
• Mixed pattern acute hepatitis. Der Quotient ALT/Gesamt-AP beträgt 2–5. Die klinisch-pathologischen Manifestationen ähneln einer Kombination aus hepatozellulärer und cholestatischer Hepatitis. Die Prognose ist besser als die der hepatozellulären Verlaufsform.

Erkrankungen des Skeletts

Die Gesamt-AP ist ein häufig eingesetzter Marker bei Verdacht auf Erkrankungen des Skeletts. Nachteilig ist jedoch eine mangelnde diagnostische Sensitivität und Spezifität. Deshalb ist die Gesamt-AP nur bei signifikantem Skelettbefall, wie das bei M. Paget, Vitamin D-Mangel-Rachitis, metastatischer Knochenbildung oder lytischen Läsionen und dem primären Hyperparathyreoidismus der Fall ist, erhöht. Bei den osteopenischen und osteoporotischen Osteophathien zeigt die Gesamt-AP nur gelegentlich eine Erhöhung. Hier hat die Bestimmung der Knochen-AP, insbesondere in der Verlaufsbeurteilung, eine diagnostische Bedeutung /23/. Denn die Knochen-AP reflektiert, wie das Osteocalcin, die Knochenbildung, während N-terminales Propeptid (PINP) und Carboxy-terminal verknüpfte Telopeptide (β-Crosslaps) Produkte der Knochenresorption sind. Da jedoch Knochenabbau und Knochenbildung miteinander gekoppelt sind, verhalten sich die Marker beider Vorgänge oft gleich und liegen nicht selten in der gleichen Größenordnung.

Ausnahmen von dieser Regel bestehen bei der Behandlung mit Glukokortikoiden, bei der die Knochenbildung akut inhibiert und die Knochenresorption verstärkt ist. Bei der Anabolikabehandlung ist die Knochenbildung verstärkt, die Resorption bleibt unbeeinflusst /24, 25/.

Maligne Tumoren

Deutliche Erhöhungen der Gesamt-AP können bei Patienten mit malignen Tumoren messbar sein. Oft belegt die Bestimmung der Isoenzyme oder Isoformen der AP die metastatische Verbreitung des Tumors in bestimmte Gewebe. So weist beim Prostatakarzinom die Erhöhung der Knochen-AP auf eine Skelett-Metastasierung hin, beim Kolonkarzinom die Erhöhung der Leber-AP auf eine hepatogene und die Erhöhung beider Isoformen beim Bronchialkarzinom auf eine Metastasierung in beide Organe.

AP-Isoenzyme, die wesentliche Kriterien eines Tumormarkers bei Patienten mit Hodentumoren erfüllen, sind die Plazenta-AP und die Regan-Typ-AP. Beide Isoenzyme besitzen eine Homologie zu 98 %und werden oft synonym bezeichnet. Die Regan-Typ-AP wird im Serum bei Hoden-, Ovarial-, Bronchial-, Blasen- und gastrointestinalen Tumoren nachgewiesen /20/. Bei der Kasahara-AP, die mit keinem kommerziellen Testkit bestimmt werden kann, handelt sich um eine multiple AP, die biochemisch ein Heterodimer aus Plazenta-AP und Dünndarm-AP ist. Sie wird beim hepatozellulären Karzinom und dem Nierenzellkarzinom gefunden. Bei Tumorpatienten treten gelegentlich auch unbekannte Varianten von AP-Isoformen auf, die nicht weiter abklärbar sind. Auch kommt es zu Erhöhungen der Gesamt-AP auf Grund von mit Immunglobulinen komplexierten Isoenzymen der AP (siehe auch Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik) /26/.

Kardio-metabolische Erkrankungen

Im United States National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 2005–2006 korrelierte die Höhe der Gesamt-AP signifikant mit Alter, Hüftumfang, Body mass index, Blutdruck, körperlicher Tätigkeit, der ethnischen Abstammung und den Triglyceridwerten. Verglichen mit der niedrigsten Quartile der Gesamt-AP hatten diejenigen in der Höchsten vermehrt kardiovaskuläre Erkrankungen (Odds ratio 1,9) sowie Hypertonie, Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus (Odds ratio 1,7). Es wird angenommen, dass die AP, vergleichbar dem CRP, ein kardio-metabolischer Marker ist und höhere Aktivitäten bei Arteriosklerose und peripherer Gefäßerkrankung zeigt /27/.

1.3.5.2 Erniedrigung der AP-Aktivität

Erniedrigungen der AP im Serum sind selten und haben im klinischen Krankengut eine Häufigkeit von etwa 0,2 % (Tab. 1.3-7 – Erkrankungen, die mit einer Verminderung der AP eingehen).

Bedeutsam ist die hereditäre Hypophosphatasie, die auf Grund einer mangelnden Expression der Gewebe-unspezifische AP mit einer Erniedrigung der Gesamt-AP und Erkrankungen des Skeletts einhergehen kann /28/.

1.3.6 Hinweise und Störungen

Komplexierende Substanzen wie Citrat, EDTA, Oxalat binden Kationen wie Zink und Magnesium, die wichtige Kofaktoren für die AP-Aktivität sind. In derart antikoagulierten Plasmaproben werden falsch-niedrige AP-Aktivitäten gemessen /73/. Das ist auch der Fall in Proben, die nach der Verabreichung von Bluttransfusionen entnommen werden, da infundiertes Citrat die Verminderung der Enzymaktivität bewirkt.

Eine 12 h-Nahrungskarenz vor der Blutentnahme ist erforderlich, da 2–4 h nach Nahrungsaufnahme durch einen Einstrom von Dünndarm-AP in die Zirkulation eine Erhöhung der Gesamt-AP von im Mittel 30 U/l auftreten kann. So betrug bei Diabetikern die Dünndarm-AP nüchtern 11–79 U/l und stieg postprandial auf 41–106 U/l an /74/. Die Aktivität der Dünndarm-AP ist nach fettreichen Mahlzeiten erhöht.

Hämolyse

Hämoglobin hemmt die Aktivität um etwa 3 % /73/.

Halbwertszeiten

• Gesamt-AP: 3–7 Tage.
• Leber-AP: 3 Tage.
• Knochen-AP: 40 h.
• Dünndarm-AP: Unter 1 h.
• Plazenta-AP: 4–7 Tage.

Medikamente

Arzneimittel können die Aktivität der AP im Sinne einer Erhöhung oder Verminderung beeinflussen /75/.

Erhöhend wirken: Allopurinol, Amsacrin, Carbamazepin, Cotrimoxazol, Cyclophosphamid, Disopyramid, Erythromycin, Goldsalze, Isoniazid, Ketoconazol, Mercaptopurin, Methotrexat, Methoxyfluran, α-Methyldopa, Methyltestosteron, Oxacillin, Oxyphenisatin, Papaverin, Penicillamin, Perhexilin, Phenobarbital, Phenylbutazon, Phenytoin, Primidon, Propylthiouracil, Ranitidin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol, Sulfasalazin, Valproat, Verapamil.

Vermindernd wirken: Clofibrat, orale Kontrazeptiva.

Stabilität im Serum

Bei 20 °C nach 3 Tagen um 3 % vermindert, bei 4 °C keine Aktivitätsabnahme innerhalb 1 Woche /76/.

Qualitätskontrolle

Die AP kann nach dem Auflösen lyophilisierter Kontrollseren über eine Zeitspanne von mehreren Stunden zunehmen in Abhängigkeit vom lyophilisierten AP-Isoenzym. Die von den Herstellern angegebenen Rekonstitutionszeiten müssen eingehalten werden.

Bestimmungsmethode AP-Isoenzyme

ELISA zur Aktivitätsbestimmung: Kreuzreaktivität 3–8 % bei pathologischem Wert der Gesamt-AP /8, 55/.

Immunometrischer Assay: Die Kreuzreaktivität der Knochen-AP mit der Leber-AP beträgt bis zu 16 %. Wenn keine Skelett- sondern eine hepatobiliäre Erkrankung vorliegt, sollte nur die Leber-AP erhöht sein. Unter dieser Bedingung liefert der immunometrische Assay noch kein pathologisches Ergebnis der Knochen-AP bis zu einer Erhöhung der Gesamt-AP um das 2,6 fache /77/.

Elektrophoretische Trennung in Weizenkeimlektin-haltigem Trägermedium: Diese Methode zeigt die gleiche Präzision und Richtigkeit für die Knochen- und Leber-AP wie die Fällungsmethode. Bei hoher Knochen-AP tritt ein Schmieren von der Bande der Knochen-AP zur Anode hin auf.

Altersabhängigkeit

Die Gesamt-AP ist bis zum 10. Lj annähernd konstant, nimmt dann kontinuierlich zu und erreicht im Lj. 14– 16 den höchsten medianen Wert, bei Mädchen bis auf das 4 fache und bei Jungen bis auf das 5 fache des oberen Wertes des Referenzbereichs Erwachsener /17/. Ab dem Lj. 20–25 gleichen sich die Werte beider Geschlechter an und sind beim Mann konstant bis zum Lebensende /73/.

Bei Frauen kommt es postmenopausal zu einem Anstieg der Gesamt-AP um 30–60 % durch Zunahme der Knochen-AP, normalerweise wird die obere Referenzbereichsgrenze nicht überschritten /78/.

1.3.7 Pathophysiologie

Das Gen AP kodiert die Gesamt-AP. Diese besteht aus den Isoenzymen Leber-AP, Nieren-AP und der Gewebe-unspezifischen AP.

Leber-AP und Nieren-AP sind die Gewebe spezifischen Isoenzyme (Tissue-specific Isoenzymes; TSAP).

Das Gewebe-nicht-spezifische Isoenzym (Tissue-non-specific isoenzyme; TNSAP) wird aufgrund unterschiedlicher Glykosilierung in die Isoformen Knochen-AP, Darm-AP, Plazenta-AP und Keimzell-AP differenziert. Kodiert wird dies durch die TNSAP Gene.

Die TNSAP ist ein Membran-gebundenes Enzym, das in allen Geweben lokalisiert ist. Sie ist an die äußere Oberfläche der Zellmembranen gebunden und an diese vermittels eines carboxyterminalen Glykanphosphatidylinositol-Ankers geknüpft. Die Membran-gebundene Form ist ein Tetramer, die von den Phospholipasen C und D abgelöst wird und in den Blutkreislauf übertritt. Dort liegt die AP als Dimer vor mit zwei aktiven Zentren, von denen jedes zwei Zink- und ein Magnesiumatom enthält.

Das TNSAP-Gen wird in vielen Geweben exprimiert und die von diesen Geweben gebildeten AP sind Isoformen, die sich auf Grund posttranslationaler Modifikation unterscheiden /14/. Die Isoformen haben eine identische primäre Proteinstruktur, unterscheiden sich aber im Ausmaß ihrer Sialisierung. Das führt zur Änderung in der elektrophoretischen Beweglichkeit, der Stabilität gegenüber Hitze und gegenüber der hemmenden Wirkung bestimmter Chemikalien. So kann das Plazenta-Isoenzym von den Leber-, Knochen- und Nieren-Isoformen auf Grund einer Aktivitätshemmung durch L-Phenylalanin und der Hitzestabilität bei 65 °C für 10 min differenziert werden.

Die TNSAP besteht aus einer Gruppe von Isoenzymen, die von vier Genloci kodiert werden. Die Gene der TNSAP (Knochen-AP, Dünndarm-AP, Plazenta-AP und Keimzell-AP) sind auf dem langen Arm von Chromosom 2 gelegen.

Die spezifische Aktivität der AP, gemessen in U/g Gewebe, beträgt in der Plazenta 3214, im Dünndarm 2524, in der Niere 619, im Knochen 571 und 100 in der Leber.

Für die Bestimmung der AP werden künstliche Substrate in hoher Konzentration angewendet. Die natürlichen Substrate der AP sind jedoch Pyrophosphat, Phosphoäthanolamin und Pyridoxalphosphat. Die Konzentration von anorganischem Phosphat ist ein natürlicher Regulator der AP-Aktivität im Plasma. Bei normaler Phosphat-Konzentration ist die Aktivität der AP gegenüber Pyridoxalphosphat zu 50 % gehemmt, nimmt mit steigender Phosphat-Konzentration ab und mit fallender zu /79/.

Die wesentliche Funktion der TNSAP ist die Spaltung von Phosphorverbindungen wie anorganisches Pyrophosphat, Pyridoxal-5-phosphat und Phosphoäthanolamin. Mutationen mit funktionellen Defekten der TNSAP führen zur extrazellulären Anhäufung dieser Phosphatprodukte und verursachen Mineralisationsdefekte des Knochens und des Zahns. Die Anhäufung von Pyrophosphat hemmt die Synthese von Hydroxylapatit-Kristallen und das Wachstum. Das reduzierte Wachstum (verminderte Größe) ist ein wesentliches klinisches Merkmal der Hypophosphatasie.

Die TNSAP dephosphoryliert auch Pyridoxal-5-phosphat, die phosphorylierte Form von Pyridoxin (Vitamin B6). Das kann somit die Blut-Hirn-Schranke passieren und von den Neuronen aufgenommen werden. Intrazellulär wird Pyridoxal zu Pyridoxal-5-Phosphat phosphoryliert und ist ein Kofaktor der Synthese von Gamma-Aminobuttersäure. Bei der Hypophosphatasie und dem damit verbundenen Unvermögens Pyridoxal-5-Phosphat zu spalten und somit Viatamin B6 zu bilden kann es zu zentral bedingten Krämpfen kommen /28/.

Leber-AP

Die Leber-AP wird in allen Ebenen des Gallenwegsystems von den Gallenkanälchen in der Leber bis zur Mukosa der Gallenblase und den großen Gallengängen gebildet. Jede Behinderung des Gallenflusses, sei es auf der Ebene der Gallenkanälchen oder der Papilla Vateri, bewirkt in den Gallenwegen eine Induktion der Leber-AP. Der Mediator dieser Enzyminduktion ist unbekannt. Gewöhnlich verhalten sich AP und Bilirubin im Serum gleich, z.B. wenn eine Obstruktion des Gallengangs vorliegt, wie das bei einem Gallensteinverschluss oder Pankreaskopftumor der Fall ist. Wenn aber nur der rechte hepatische Gallengang verschlossen ist, verhalten sich Bilirubin und AP nicht gleichsinnig. Die AP ist erhöht, aber Bilirubin normal. Der Grund ist das Vorliegen intrahepatischer Anastomosen der Gallenwege, so dass Bilirubin über den linken Lebergallengang ausgeschieden werden kann. Eine isolierte Erhöhung der AP bei normalen Aminotransferasen kommt auch bei infiltrativen Lebererkrankungen wie Tumoren und Granulomen vor, auch muss an eine Makro-AP gedacht werden. Siehe Beitrag 1.1.2 – Diagnostische Aussage von Enzymen. Wird durch Metastasen, Tumore oder Granulome in der Leberpforte ein Gallengang komprimiert und der Gallenfluss behindert, tritt eine Erhöhung der AP auf.

Knochen-AP

Die Knochen-AP ist auf der Zellmembran des Osteoblasten lokalisiert. Eine erhöhte Osteoblastenaktivität verursacht den Anstieg des Enzyms. Die Knochen-AP ist direkt in die Mineralisation des Knochens involviert, was an Hand der Erkrankung der hereditären Hypophosphatasie gezeigt werden konnte. So hatten genetisch veränderte knock-out-Mäuse, denen das TNSALP-Gen fehlte, eine progressive Osteopathie, aber keinen sekundären Hyperparathreoidismus. Die genaue Funktion der Knochen-AP im Mineralisationsprozess ist nicht klar umrissen. Es wird angenommen, dass sie die lokale Konzentration von anorganischem Phosphat erhöht, lokale Inhibitoren der Mineralkristallbildung inhibiert oder als Calcium-bindendes Protein wirkt.

Patienten mit Prostata-, Mama- und Bronchialkarzinom entwickeln häufig im Verlaufe der Erkrankung Skelettmetastasen. Dabei wird Knochen von Osteoklasten resorbiert und von Osteoblasten neu gebildet. Eine Erhöhung der Knochen-AP ist dabei nur zu erwarten, wenn die Aktivität der Osteoblasten gegenüber den Osteoklasten nicht vermindert ist. Bei Tumorerkrankungen mit osteoblastischen Metastasen, wie dem Prostatakarzinom, ist deshalb eine AP-Erhöhung häufig, bei Erkrankungen mit osteolytischen Metastasen demgegenüber abhängig von der kompensatorischen Osteoblastenaktivität. Bei Vorliegen von Knochenmetastasen werden Bisphosphonate zur Hemmung der Knochenresorption und Reduzierung des Knochenschmerzes eingesetzt. Etwa einen Monat nach Therapiebeginn resultiert ein Anstieg der Knochen-AP, der auf einer verstärkten Rekrutierung von Osteoblasten beruhen soll. Nach 2–3 Monaten kommt es wieder zu einem Abfall, der das Zeichen einer wieder eingetretenen Kopplung von Knochenresorption und Knochenbildung sein soll.

Es ist generell akzeptiert, dass die Osteoporose einen verstärkten postmenopausalen Knochenverlust darstellt und auf einen vermehrten Knochenumbau zurückzuführen ist. Bei diesen Frauen ist die Knochenmasse negativ mit den Markern der Knochenbildung und Knochenresorption korreliert. Jedoch ist der Vorhersagewert des einzelnen Knochenmarkers gering. Die Kombination von Knochen-AP, Osteocalcin, N-terminalen Propeptid (PINP), Carboxy-terminal verknüpften Telopeptiden und die Calcium-Ausscheidung sollen einen Vorhersagewert von 60–70 % haben.

Dünndarm-AP

Die Dünndarm-AP wird von den Enterozyten exprimiert und ist im Blut gut messbar bei Sekretoren der Blutgruppensubstanz H (Blutgruppe 0 und B). Bei ihnen beträgt der Anteil der Dünndarm-AP an der Gesamt-AP etwa 10–20 %. Die Aktivität nimmt nach der Nahrungsaufnahme zu, insbesondere bei fettreichen Mahlzeiten.

Bei Patienten mit Leberzirrhose und anderen schweren Hepatopathien kann die Dünndarm-AP erhöht sein. Ursache ist eine absolute Verminderung der Asialoglykoprotein-Rezeptoren. Diese binden die Dünndarm-AP an die Oberfläche der Hepatozytenmembran, danach erfolgt deren Abbau. Auch können bei autoimmun bedingten Hepatitiden Antikörper gegen den Asialoglykoproteinrezeptor auftreten und diesen inhibieren. Bei Rechtsherzinsuffizienz kann es zu Stauungen im Dünndarmbereich kommen, wodurch eine vermehrte Synthese der Dünndarm-AP induziert wird.

Plazenta-AP

Die Plazenta-AP ist ein fetales Isoenzym der AP und hitzestabil. Es besteht eine Homologie mit der Regan-Typ-AP. Die Plazenta-AP wird ab der 12. Fetalwoche vom plazentaren Synzytiotrophoblasten gebildet und liegt im Serum als Tetramer mit einem Molekulargewicht von 300 kD vor. Signifikante Mengen der Regan-Typ-AP werden in Seminomen und Ovarialtumoren gefunden. Das Enzym ist jedoch nicht spezifisch für diese Tumoren, sondern wird auch in der Plasmamembran von Typ 1-Pneumozyten gefunden und auf der Basalmembran zwischen diesen Zellen. Bei Rauchern ist die Regan-Typ-AP, die normalerweise bei gesunden Personen nicht messbar ist, in einem hohen Prozentsatz nachweisbar. Es besteht eine lineare Beziehung zwischen Nikotin-Aufnahme und der Höhe der Regan-Typ-AP. Nach Abgewöhnen des Rauchens fällt die Konzentration nach 1–2 Monaten ab.

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1.4 α-Amylase

Klaus Lorentz

Humane α-Amylasen (1,4-α-D-Glucan­glu­ca­no­hydro­lasen, EC 3.2.1.1) sind monomere Proteine, deren Aminosäuresequenzen beim Pankreasenzym (P-Amylase) und Speicheldrüsenenzym (S-Amylase) zu 97 % homolog sind. Im Serum und Urin gesunder Personen weisen die Isoenzyme aus Pankreas und Speicheldrüsen bei Gesunden etwa gleiche katalytische Aktivitäten auf. Bei Verdacht auf akute Pankreatitis steht neben der α-Amylase auch die Bestimmung der Lipase zur Verfügung, der von vielen Klinikern der Vorzug gegeben wird (siehe Beitrag 1.1.2 – Diagnostische Aussage von Enzymen).

1.4.1 Indikation

• Nachweis und Ausschluss der akuten Pankreatitis (bei akutem Oberbauchschmerz).
• Nachweis der chronischen Pankreatitis (im Rezidiv).
• Ausschluss einer Pankreasbeteiligung bei abdominellen Erkrankungen und chirurgischen Eingriffen.
• Verlaufskontrolle nach endoskopisch-retrograder Choledochopankreatographie.
• Parotitis (epidemisch, marantisch, postoperativ, Alkohol-induziert).

1.4.2 Bestimmungsmethode

Prinzip: Die Enzymaktivität wird kontinuierlich durch Abbau definierter Oligosaccharide, die einen aromatischen Rest an der reduzierenden Gruppe des ersten Glucosemoleküls (G1) tragen, gemessen. Der aromatische Rest wird beim Angriff von α-Amylase auf 2-Chlor-4-nitrophenyl-α-D-maltotriosid direkt freigesetzt und gemessen. Bei der IFCC-Methode mit einem Substrat höherer Kettenlänge (EPS) wird der aromatische Rest 4-Nitrophenyl-G (7 – x) durch die α-Glucosidase abgespalten und als gelber Chromophor gemessen. Substitution am Kohlenstoffatom 6 der Glucose (G7) des nicht-reduzierenden Endes schützt die Oligosaccharide gegen einen Angriff der Hilfsenzyme.

Methode der International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) /1/

Abkürzungen: EPS, 4,6-ethylidene(G1)-4-nitrophenyl(G7)-α-(1–4)-maltoheptaoside; G, α-(1–4)-D-glucopyranosyl

1.4.3 Untersuchungsmaterial

• Serum, Heparinplasma, Ergussflüssigkeit: 1 ml
• Harn (12 h-Sammelharn oder Spontanharn): 1 ml

1.4.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.4-1 – Referenzbereich der α-Amylase.

1.4.5 Bewertung

Diagnostisch unstrittig ist nur eine Zunahme der Enzymkonzentration im Serum zur Erkennung einer Erkrankung des Pankreas. Sie ist bei akuten und rezidivierenden Entzündungen am sichersten nachzuweisen im optimalen diagnostischen Intervall von 5–10 h nach dem Einsetzen von Schmerzen im Oberbauch. Neben dem Stadium der Erkrankung bestimmt die Obergrenze des Referenzintervalls (OGR), die Qualität der diagnostischen Aussage. Die Pankreasamylase gilt gegenüber der α-Amylase (total) als überlegen /6/, doch ist der Zeitpunkt der Untersuchung wichtiger als die Wahl des Enzyms. Regelhaft zeigen α-Amylase und Lipase ein paralleles Verhalten mit verzögertem Abfall der Lipase zur Norm. Die Höhe der Aktivitäten im Serum reflektiert keineswegs die Schwere der Erkrankung, da auch α-Amylase- und Lipaseaktivitäten unter 3 × oberer Referenzbereichswert (ORF) bei ernsten Verläufen gemessen werden /7/.

Werte im Referenzbereich, besonders bei α-Amylase, treten gelegentlich auch bei akuter, vorzugsweise Alkohol-induzierter Pankreatitis auf /7/. Umgekehrt beobachtet man bei 8 % der hospitalisierten Patienten eine Erhöhung der α-Amylase ohne Vorliegen einer Pankreaserkrankung, so dass die Bestimmung nicht indiziert ist wenn kein Verdacht auf eine Pankreaserkrankung besteht /8/.

Erhöhte Werte weisen auf folgende Krankheiten hin:

• Akute Pankreatitis: Am Erkrankungstag bleibt die α-Amylase mit 80 % diagnostischer Sensitivität unter der von Lipase und Pankreasamylase (Tab. 1.4-2 – Ursachen pankreatogener Hyperamylasämien), der Abstand vergrößert sich bis zum 5. Tag, dann fällt die diagnostische Sensitivität unter 70 % /9/.
• Rezidiv einer chronischen Pankreatitis: Zeitprofil und Verhältnis beider Enzyme in einem akuten Schub entsprechen denen bei akuter Entzündung. Sie erreichen aber nur gelegentlich deren Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität über 90 %. Niedrige α-Amylase/Lipase-Quotienten werden als typisch für fortgeschrittene Stadien angesehen /10/.
• Pankreatitis nach endoskopisch-retrograder Choledochopankreatographie (ERCP). Die Lipaseaktivität steigt nach dem Eingriff höher an als die von α-Amylase, erreicht wie diese einen Gipfel nach 6 h, bleibt aber länger als 3 Tage erhöht /11/. Bei einer akuten Pankreatitis dauern die Höchstwerte bis zu 24 h an /12/, ihr Ausbleiben kann nach 2 h bei unter 2,4 × ORF für α-Amylase und unter 4,2 × ORF für Lipase mit einem negativen Vorhersagewert von 0,98 erwartet werden /13/.

Chronische asymptomatische Hyperamylasämien beruhen in etwa der Hälfte der Fälle auf pankreatischen oder extra pankreatischen Erkrankungen, zu jeweils etwa 5 % wird eine Makroamylasämie oder familiäre Hyperamylasämie diagnostiziert, in 40 % der Fälle wird keine Ursache gefunden /14/. Die Existenz der ubiquitären Isoform X-Amylase resultiert aus intestinaler Herkunft und P- und S-Amylase können aus Neoplasien und Lebergeweben stammen /15/. So kann man α-Amylase- und Lipaseerhöhungen bei Leberkrankheiten erwarten /16/, aber auch in Folge Kreislaufinsuffizienz mit Leberstauung /17/, die generell eine Hyperamylasämie hervorruft. Daneben ist auch an eine aufsteigende Parotitis bei postoperativer Stomatitis zu denken.

α-Amylase- und Lipaseerhöhungen um 10–15 % sind bei Fructose Malabsorption /18/ und antiepileptischer Behandlung /19/ beschrieben. Pankreaskarzinome verursachen bei Verschluss des Ductus pancreaticus eine Hyperenzymämie. Bei Bulimie und Anorexie erreichen Amylasämien gelegentlich bis zu 2 × ORF /20/, meist durch Parotitis als Folge einer Stomatitis. Weitere Ursachen extra pankreatischer Hyperamylasämien sind aufgezeigt in Tab. 1.4-3 – Ursachen extrapankreatischer Hyperamylasämien.

Niedrige Werte bei Adipösen haben eine geringe Bedeutung. Hypoamylasämie als Symptom einer Pankreasinsuffizienz, auch als fehlende Antwort auf einen Sekretionsreiz (negativer Evokationstest), wird, abgesehen von terminalen Stadien, vermisst.

α-Amylase im Urin

Die Untersuchung ist angezeigt bei Hyperamylasämie, wenn der Verdacht auf eine Makroamylasämie oder eine Niereninsuffizienz besteht. Siehe auch Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

α-Amylase in anderen Flüssigkeiten

Die postoperative Untersuchung in Drainagesekreten dient zum Nachweis einer Pankreasfistel. Hohe Konzentrationen in Pleuraergüssen (bei basaler Pleuritis und Verletzung des D. thoracicus) deuten auf eine Pankreatitis. Bei Leukämien, Bronchialkarzinom und Lungenmetastasen soll S-Amylase erhöht sein /21/.

1.4.6 Hinweise und Störungen

Makroamylasämie

Makroamylasen sind uneinheitliche Komplexe (Molekulargewicht über 400 kDa), in denen α-Amylase an der Fab-Region von Immunglobulinen (zumeist IgA, unter 30 % IgG, unter 5 % andere Ig) gebunden wird. Gelegentlich findet man außerdem Albumin und α₁-Antitrypsin. Sie entgehen wegen ihrer Größe der glomerulären Filtration und verursachen durch Verbleib im Serum eine höchstens 4 fache Erhöhung der Aktivität. Mehrheitlich ist S-Amylase beteiligt, doch lässt sie sich, wegen der durch Ig abgedeckten Epitope des Enzyms, oft nicht erkennen. Merkmale sind chronische Hyperamylasämie ohne klinisches Korrelat, normale oder niedrige Amylase im Urin sowie eine unauffällige Lipaseaktivität. Diese harmlose Anomalie findet man in 0,1 % der Bevölkerung. Man sollte aber bei einer Makroamylasämie nach monoklonalen Gammopathien suchen.

Häufiger sind Makroformen nach Infusion von Hydroxyethylstärke (HAES), die mit Amylase hochmolekulare Komplexe bildet. Die Zufuhr von 500 ml 6 %iger HAES bewirkt für 3–5 Tage eine erhöhte α-Amylase, da das Enzym erst nach dem Abbau von HAES glomerulär filtriert wird. Diese Hyperamylasämie kann als postoperative Pankreatitis missdeutet werden. Die Lipase ist normal.

Siehe Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

Bestimmungsmethode

Alle Verfahren messen bis 10 fach des oberen Referenzbereichswerts proportional zur Konzentration, und ihre Substrate sind in Lösung gut haltbar. Glucose über 10 g/l mindert das gemessene Signal kaum, Pyruvat und Lactat interferieren nicht.

Tests, die 4-Nitrophenol- oder 2-Chlor-4-nitrophenol als Chromophor freisetzen, tolerieren höhere Konzentrationen von Bilirubin, Triglyceriden und Hämoglobin, doch wird bei frischer Hämolyse (durch Abnahme der Hämoglobinabsorption) eine zu geringe Enzymaktivität vorgetäuscht /22/. Lipoproteine können niedrige Werte in lipämischen Seren hervorrufen.

Amylase im Harn

Während Ausscheidung und Clearance der α-Amylase gewisse diagnostische Aussagen bei Verdacht auf eine Makroamylasämie und Niereninsuffizienz erlauben, besitzt die Bestimmung im Urin und der Clearance-Quotient zur Erkennung der akuten Pankreatitis keine Bedeutung.

Antikoagulantien

EDTA und Oxalat dürfen wegen der Bindung von Ca²⁺ nicht verwendet werden, Heparin stört nicht. Einige Tests enthalten Magnesium im Reagenz, um Amylase in EDTA-Plasmen zu reaktivieren.

Referenzbereich

Die α-Amylase weist ein typisches Altersprofil auf mit hohen individuellen Schwankungen. Schwangerschaft hat keinen Einfluss. Neugeborene besitzen nur Speichelenzym mit 25–50 % der endgültigen Konzentration, die nach 12 Monaten erreicht wird. Pankreasamylase erscheint erst nach 1–2 Lebensmonaten und steigt kontinuierlich bis zum 10. Lj. an, dann gilt der Referenzbereich für Erwachsene.

Stabilität

Serum 1 Woche bei 4 °C oder 25 °C oder mindestens 1 Jahr bei –28 °C (auch zum Nachweis einer Makroamylasämie). Im Urin bei 4 °C zumindest einen Tag unverändert aktiv, bei steriler Aufbewahrung sogar bis zu einem Monat, nicht einfrieren.

1.4.7 Pathophysiologie

Humane α-Amylasen [1,4-α-D-Glucanglucanohydro­lasen, EC 3.2.1.1] repräsentieren drei nahezu identische monomere Proteine, die nach Abspaltung eines Signalpeptids von 15 Aminosäuren aus dem endoplasmatischen Retikulum als aktive Enzyme mit einheitlich 496 Aminosäuren in das Zytoplasma übertreten /23/.

Ihre Genorte in der chromosomalen Bande 1p21 kodieren für drei Isozyme mit Molekulargewichten um 54 kD: AMY2A für das Pankreas-, AMY2B für das ubiquitäre und AMY1 für das Speichelenzym. Es ist zu 97 % bei 15 abweichenden Aminosäuren mit der Pankreasamylase homolog, das ubiquitäre Isozym sogar zu 98 % durch Austausch von nur 5 Aminosäuren. Speichelamylase kann deshalb durch den gleichzeitigen Einsatz von zwei monoklonalen Antikörpern mit unter 3 % Restaktivität gehemmt werden, das ubiquitäre Isoenzym jedoch nicht. Von beiden existieren glykosylierte Formen mit MG von 57–62 kD, deren Glykanreste ohne Aktivitätsverlust in vivo enzymatisch abgespalten werden.

Amylasen sind aus drei Domänen aufgebaut. Domäne A enthält das aktive Zentrum mit einem aktivierenden Cl^–, das durch Anionen ähnlicher Größe ersetzt werden kann. Ein protektives Ca²⁺ in Domäne B richtet sich gegen das katalytische Zentrum aus und stabilisiert das Enzymmolekül, das daher durch Calcium-komplexierende Antikoagulantien und Schwermetalle inaktiviert wird. Domäne C trägt bei glykosylierten Formen den Glykanrest und variiert stark mit der Spezies. Alle Isoenzyme bauen polymere Kohlenhydrate durch zufällige Hydrolyse 1,4-α-glucosidischer Bindungen bis zum Disaccharid ab. Oligosaccharide werden an bevorzugten Bindungen gespalten. Dabei können Glucose und Maltose auf das Substrat übertragen werden.

α-Amylase wird im sekretorischen Epithel von Mundspeicheldrüsen und Pankreas, in geringer Konzentration auch in Leber- und Karzinomgewebe synthetisiert /15/. Wie bei Lipase ist im Acinusepithel ein Proenzym nachweisbar, das jedoch nicht extrazellulär erscheint. Bei Gesunden werden > 99 % des Enzyms in den Gastrointestinaltrakt abgegeben, während Abflussstörungen und Entzündungen des Organs zu einem erhöhten Übertritt in den Kreislauf führen. Eine erhebliche Zerstörung des sekretorischen Parenchyms beeinflusst kaum die Aktivität im Serum.

Im übrigen verhält sich das Enzym wie Lipase, doch ist seine Halbwertszeit mit 9,3–17,7 h länger. Als Ursache dieser Differenz ist eine 50 %ige tubuläre Rückresorption der glomerulär vollständig filtrierten α-Amylase anzunehmen. Die Rückresorption wird durch tubuläre Schädigungen (Verbrennung, Ketoazidose, akute Pankreatitis) und Proteinurie eingeschränkt /24/, so dass die Amylase-Clearance (normal 2,8–4,6 ml/min) zunimmt. Hierdurch steigt auch der Clearance Quotient [(Amylase Clearance/Creatinin Clearance) × 100] von 1,8–3,2 % bei Gesunden auf > 10 % an. Glomeruläre Schäden vergrößern den Quotienten durch einen stärkeren Rückgang der Creatinin Filtration gering bis 9 %. Die Pankreasfraktion nimmt relativ zu, die Ausscheidung von α-Amylase stark ab.

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1.5 Angiotensin-Converting Enzyme (ACE)

Lothar Thomas

Angiotensin-I-Converting Enzyme, auch als Peptidyl-Dipeptidase A; EC 3.4.15.1 bezeichnet, wurde ursprünglich als Dipeptidylcarboxypeptidase beschrieben /1/. ACE ist vorwiegend auf der luminalen Oberfläche vaskulärer Endothelzellen lokalisiert, entstammt aber auch den Zellen des Monozyten- und Makrophagen-Systems. Physiologisch ist ACE der Gewebe involviert (Abb. 1.5-1 – Biochemische Wirkungen von ACE):

• Als Schlüsselenzym im Renin-Angiotensin-System: ACE wandelt Angiotensin I in den potenten Vasosuppressor Angiotensin II um, durch Abspaltung des carboxyterminalen Dipeptids.
• In die Inaktivierung des Vasodilatators Bradykinin, in dem es sequentiell zwei carboxyterminale Dipeptide entfernt.

Serum ACE (SACE) ist nicht in diese Reaktionen involviert und seine pathologische Bedeutung ist ungeklärt. Erhöhte SACE-Aktivitäten sind bei einer Reihe von Krankheiten beschrieben, insbesondere der Sarkoidose (Besnier-Boeck-Schaumann-Erkrankung).

1.5.1 Indikation

• Verdacht auf Sarkoidose.
• Beurteilung der Granulomlast bei der Sarkoidose und deren Therapieverlauf.

1.5.2 Bestimmungsmethode

Viele synthetische Substrate sind zur ACE-Bestimmung entwickelt worden. Sie haben die gleichen Eigenschaften wie Angiotensin I und Bradykinin, nämlich eine freie Carboxylgruppe am C-terminalen Ende und eine Aminosäure, die nicht Prolin ist, in vorletzter Position.

Es handelt sich um Arylpolypeptide, gewöhnlich Tripeptide mit einem blockierten N-terminalen Ende, vorwiegend Hippuryl-glycyl-glycin (Hippuryl als Benzoylglycyl), Hippuryl-histidyl-leucin (HHL) und Furylacryloyl-Phenylalanyl-glycyl-glycin (FAPGG). Die Substrate werden zur photometrischen, fluorometrischen, radiometrischen und chromatographischen Bestimmung von SACE eingesetzt /1/.

Methode nach Lieberman /2/

Prinzip: Die Rate der Freisetzung von Hippursäure aus HHL wird nach Extraktion mit Äthyläther spektralphotometrisch bei 228 nm gemessen.

Methode nach Neels et al. /3/

Prinzip: Die Rate der Freisetzung von Glycyl-glycin aus Hippuryl-glycyl-glycin (Hippuryl- als Benzoylglycyl) wird in einer chromogenen Reaktion bestimmt. Photometrische Messung bei 420 nm.

Methode nach Ryan et al. /4/

Prinzip: ³H-Hippuryl-glycyl-glycin wird als Substrat eingesetzt und die Rate der Freisetzung von ³H-Hippursäure gemessen.

Methode nach Friedland und Silverstein /5/

Prinzip: Als Substrat wird HHL eingesetzt. Spektralfluorometrisch wird die Rate der Freisetzung von Histidyl-leucin nach Bildung eines Fluoreszenzadductes mit Orthophenylendiamin bestimmt.

Methode nach Holmquist et al. /6/

Prinzip: ACE katalysiert die Hydrolyse von FAPGG zu Furylacryloylphenylalanin und Glycyl-glycin. Durch die Hydrolyse kommt es zu einer Blauverschiebung der Absorption des Messansatzes. Die Abnahme der Absorption wird bei 340 nm gemessen. Sie ist direkt proportional der ACE-Aktivität der Probe.

1.5.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Heparinplasma (kein EDTA-Plasma): 1 ml

1.5.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.5-1 – Referenzbereich von ACE in Abhängigkeit von der Bestimmungsmethode.

1.5.5 Bewertung

Bei der Aktivität von Serum ACE (SACE) Gesunder handelt es sich wahrscheinlich um freigesetztes Enzym, das als Ektoenzym in Makrophagen der dem Lumen zugewandten Seite der Gefäßwand verankert ist /1/. Erhöhte SACE-Aktivitäten entstammen Granulomen. Diese sind das immunpathogene Merkmal vieler chronisch interstitieller Lungenerkrankungen wie Sarkoidose, interstitielle Pneumonitis, Berylliose, Histiozytose X und Erkrankungen mit strukturierten Massen aus aktivierten Makrophagen, Epitheloidzellen und Riesenzellen /8/. Auch gibt es Krankheiten, bei denen in etwa 25 % der Fälle SACE erhöht ist wie M. Gaucher, Hyperthyreose, Diabetes mellitus mit Retinopathie, Leberzirrhose, Silikose, Asbestose, Lymphangiomyomatose, chronisches Fatique-Syndrom /9/.

Die erniedrigte SACE soll ein Marker der endothelialen Dysfunktion des vaskulären Bettes sein, z.B. bei der Lungenschädigung toxischer Ursache, tiefen Venenthrombose, Hypothyreose oder nach Chemo- und Radiotherapie maligner Tumoren /1/. Die Wertigkeit einer niedrigen SACE ist nicht bekannt.

1.5.5.1 Sarkoidose

Klinik /8, 10/

Die Sarkoidose ist eine granulomatöse multi-systemische Erkrankung unbekannter Ätiologie. Sie betrifft vorwiegend die Lungen und die intrathorakalen Lymphknoten unter Bildung nicht verkäsender Granulome. In den betroffenen Organen liegen epitheloidzellige, granulomatöse, nicht-verkäsende Entzündungen vor.

Es erkranken vorwiegend junge Erwachsene, Altersgipfel 30–40 Jahre, mit Befall folgender Organe:

• Lunge über 95 % der Fälle; bihiläre Lymphadenopathie, interstitielles Lungeninfiltrat.
• Leber, Milz zu 25–70 %.
• Hautbeteiligung 10–60 %, Augenbeteiligung 10–25 %.
• Periphere Lymphknoten und Skelettmuskulatur 30 %.
• Speicheldrüsen, Zentralnervensystem, Herzmuskel 5 %.

Unterschieden werden folgende Verlaufsformen:

• Akute Form. Sie entwickelt sich abrupt in wenigen Wochen und macht 20–40 % aller Sarkoidosefälle aus. Es kommt zu respiratorischen Symptomen, retrosternaler Brustschmerzen, Fieber, Arthralgie, Erythema nodosum, Hilusadenopathie sowie Uveitis (Löfgren-Syndrom) und einem schweren Krankheitsgefühl. Auch oligosymptomatische Formen kommen vor.
• Chronische Form. Sie ist symptomfrei, etwa ein Drittel der Patienten haben Husten, Dyspnoe und selten Hämoptysen. In Diskrepanz zu den Befunden erscheinen diese Patienten auffällig gesund. Extra pulmonale Manifestationen sind häufig das Leitsymptom der Erkrankung, pulmonale Symptome können fehlen.

Prävalenz: Deutschland 40–50/100.000 Einwohner, Spanien, Italien unter 10/100.000, hohe Prävalenz bei Schwarzen und Puertorikanern.

Serum ACE (SACE)

Die Rate der fasch positiven Ergebnisse der SACE liegt, abhängig von der Literaturangabe, bei 50 %, trotzdem wird die SACE-Bestimmung als Suchreaktion bei Verdacht auf Sarkoidose eingesetzt /27/.

Diagnose und Management

Kein spezifischer und genügend akkurater Biomarker wurde bisher identifiziert zur Diagnostik und dem Management der Sarkoidose. Bei den diagnostischen Serummarkern spielt das Serum Angiotensin Converting Enzyme (SACE) eine zweifelhafte Rolle, denn es ist nicht empfindlich genug um den Beginn einer Sarkoidose anzuzeigen und die frühzeitige Behandlung zu beginnen. Deshalb wird bei Verdacht auf eine Sarkoidose die Bildgebung der Lunge in Kombination mit der Bestimmung von SACE empfohlen. Eine wesentliche Komplikation der hepatischen Sarkoidose ist die portale Hypertension /27/.

Prognose

Der natürliche Verlauf der Sarkoidose ist nicht vorhersehbar. So können Patienten mit fortgeschrittenen pulmonalen Infiltraten und Splenomegalie eine spontane Remission haben, während andere mit asymptomatischer hilärer Adenopathie ein schweres Krankheitsbild entwickeln können. Patienten mit bihilärer Lymphadenopathie (Typ I) haben zu 70 % eine spontane Remission, diejenigen mit Lungeninfiltraten und bihilärer Lymphadenopathie (Typ II) und Lungeninfiltraten ohne bihiläre Lymphadenopathie (Typ III) zu jeweils 50 %. Die Mortalität beträgt 40 % bei denjenigen mit Lungenfibrose (Typ IV). Generell ist die Prognose schlechter, je schwerer die klinische Symptomatik zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ist und je mehr Organe in die Erkrankung mit einbezogen sind /8/.

Neurosarkoidose /11, 12/

Neurologische Symptome auf Grund einer Mitbeteiligung des Zentralnervensystems (ZNS) haben etwa 5 % der Patienten mit systemischer Sarkoidose, 10–30 % zeigen initiale neurologische Symptome bei der ersten Vorstellung, die Inzidenz der isolierten Sarkoidose des ZNS soll unter 0,2 bezogen auf 100.000 Kaukasier sein. Die Neurosarkoidose kann die Meningen, das Hirnparenchym, das Rückenmark und die peripheren Nerven betreffen. Die Abgrenzung der intrakranialen Sarkoidose von anderen neurologischen Störungen kann schwierig sein, insbesondere, wenn die Symptome extrakranialer Manifestation fehlen.

Verhalten von SACE bei Sarkoidose

Der ACE-Wert im Serum ist wertvoll zur:

• Bestätigung der Vermutung einer Sarkoidose.
• Abschätzung der Granulomlast des Organismus.
• Beurteilung des Krankheitsverlaufs.
• Beurteilung des Verlaufs unter Kortikosteroiden.

Diagnostik

Der positive prädiktive Wert der SACE Bestimmung beträgt bei akuter pulmonaler Sarkoidose 75–90 %, der negative 70–80 % /13/. Die diagnostische Sensitivität einer erhöhten SACE-Aktivität in Kombination mit einem radiographischen Typ II- oder Typ III-Befund im ⁶⁷Ga-Scan soll 100 % betragen. Ein normaler SACE-Wert schließt in Kombination mit einem negativen ⁶⁷Ga-Scan eine pulmonale Sarkoidose aus. Die chronische Sarkoidose geht häufig mit normalen SACE-Werten einher und erhöhte Aktivitäten treten auch bei anderen granulomatösen Erkrankungen auf.

Ein normaler SACE-Wert allein schließt die akute Sarkoidose nicht immer aus, denn der Referenzbereich von SACE ist vom genetischen Polymorphismus abhängig und die Referenzwerte wurden ohne Beachtung des Polymorphismus erstellt /14/. So kann eine akute Sarkoidose mit Erythema nodosum mit Werten im Referenzbereich einhergehen /13/. Bei einer Sarkoidose der Leber, die sich als sklerosierende Cholangitis, extrahepatische Cholestase oder als Budd-Chiari-Syndrom manifestiert, ist SACE in etwa 15 % der Fälle erhöht, die Gesamt-AP fast immer 2–5 fach /15/.

Abschätzung der Granulomlast /13/

Die Höhe des ACE-Wertes reflektiert die Granulomlast des Gesamtorganismus, unabhängig welches Organ betroffen ist. Das gilt besonders für die systemische Sarkoidose. Isolierte Sarkoidosen wie z.B. die Sarkoidose des ZNS oder die kardiale Sarkoidose bewirken keine ACE-Erhöhung. Das kann auch der Fall sein bei wenig vaskularisierten, mitunter großen mediastinalen Lymphomen.

Klinischer Verlauf /13/

Eine initial niedrige SACE-Aktivität weist auf eine gute Prognose hin, die 2–3 fache Erhöhung ist prognostisch ungünstiger. Mit Progression der Erkrankung steigt die SACE-Aktivität an und erreicht die höchsten Werte bei chronisch aktiver Erkrankung mit hoher Granulomlast.

Kortikosteroid Therapie /16/

Für die Entscheidung zu dieser Therapie ist der SACE-Wert zwar generell nicht das Kriterium, es können aber Aktivitäten, die den oberen Referenzbereichswert stärker überschreiten, als Zeichen der Behandlungsbedürftigkeit gewertet und mit einer guten Ansprechbarkeit gerechnet werden. Je höher der Ausgangswert, desto länger muss eine Kortikosteroid Therapie erfolgen, damit es zu einer SACE Normalisierung und Besserung der klinischen Beschwerden kommt. Gewöhnlich resultiert aus einer wirksamen Dosierung schon nach 1–2 Wochen ein SACE Abfall, er geht der radiologischen Besserung bei Lungensarkoidose voraus. Ausbleiben eines Abfalls spricht für ungenügende Dosierung oder mangelnde Compliance.

Nach Beendigung der Therapie und Normalisierung des SACE-Wertes kann es zum Wiederanstieg der SACE kommen. Es handelt sich um das früheste Zeichen eines Rezidivs, ohne dass schon klinische Anzeichen vorliegen müssen. Eine erneute Therapie ist erst bei klinisch-röntgenologischen Veränderungen indiziert.

Bei einigen Patienten mit Heilung kann es zu einem SACE-Wiederanstieg kommen, ohne dass klinisch ein Rezidiv auftritt. Die Enzymaktivitäten sind aber gewöhnlich niedriger als der Wert vor Therapiebeginn.

Spontanremissionen der Sarkoidose gehen mit einem allmählichen Abfall der SACE einher und fallen nicht so abrupt ab wie unter Kortikosteroid Therapie.

ACE bei Neurosarkoidose

Erhöhte Aktivitäten des SACE und des ACE im Liquor cerebrospinalis sind nicht spezifisch für eine Neurosarkoidose und auch bei anderen neurologischen Erkrankungen wie Infektionen des ZNS, Hirntumoren und dem Guillain-Barré-Syndrom messbar /11/. Erhöhte ACE-Werte im Liquor cerebrospinalis werden zu 55 % bei Neurosarkoidose, zu 5 % bei Sarkoidose ohne ZNS-Beteiligung und zu 13 % bei anderen neurologischen Erkrankungen gefunden /17/. Andere Autoren sehen nur eine Bedeutung des ACE-Wertes im Liquor cerebrospinalis für die Beurteilung der Neurosarkoidose unter Therapie mit Kortikosteroiden /18/.

Weitere Laborbefunde bei Sarkoidose /8/

• Die Konzentration des löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptors II (sTNF-R II) ist im Serum erhöht. Seine Konzentration ist ein Indikator der inflammatorischen Aktivität der Sarkoidose /19/.
• Der sIL-2R ist ein Marker der Lymphozytenaktivierung und unabhängig von der alveolären Immunzellaktivierung. Erhöhte sIL-2R-Werte zeigen den Aktivierungszustand der T-Zellen an und sind ein guter Verlaufsparameter der Sarkoidose. Bei Patienten ohne klinische Indikation für eine Therapie, aber mit Anstieg der sIL-2R-Werte im Verlauf, wird eine Progression der Sarkoidose angezeigt mit nachfolgender Indikation zur Kortikosteroid Therapie. Die Höhe des sIL-2R-Werts korreliert mit der Schwere der Sarkoidose /8, 19/.
• Die Immunglobuline sind erhöht, insbesondere IgG und IgA.
• Zirkulierende Immunkomplexe sind nachweisbar.
• Häufig besteht eine Lymphozytopenie.
• In einem Teil der Fälle ist ionisiertes Calcium im Blut und dessen Ausscheidung im Urin erhöht, da von den Epitheloidzellen 1,25(OH)₂D gebildet wird, wodurch die intestinale Calcium-Absorption zunimmt (siehe auch Beitrag 6.6 – Vitamin D).
• HLA-Merkmale: Bei chronischer Sarkoidose wird vermehrt HLA-B13; bei sarkoidöser Arthritis und Erythema nodosum HLA-B8, A1, Cw 7, DR 3 nachgewiesen.
• Bronchoalveoläre Lavage (BAL): Lymphozytenanteil von normalerweise unter 20 %, kann auf über 50 % erhöht sein; Erhöhung von CD4⁺T-Zellen und ein Anstieg des Quotienten CD4⁺/CD8⁺ von normalerweise 1–3 auf über 5, teilweise über 12, insbesondere bei akuter Sarkoidose und Löfgren-Syndrom (siehe auch Tab. 48-5 – Pathognomonische Befunde bei nicht-infektiösen Erkrankungen). Der Anteil der Lymphozyten in der BAL und der Quotient CD4⁺/CD8⁺ korrelieren im gewissen Ausmaß mit dem Spontanverlauf der Sarkoidose. Patienten mit akuter Erkrankung und guter Prognose haben einen hohen Lymphozytenanteil und eine deutlich erhöhte CD4⁺/CD8⁺-Ratio. Diejenigen mit chronischer Erkrankung und dem Risiko der Verschlechterung haben nur moderat erhöhte Werte /8/.

1.5.5.2 Differentialdiagnostik der pulmonalen Sarkoidose

Pathologische Eigenschaften alternativer Erkrankungen sind aufgeführt in Tab. 1.5-2 – Alternative Erkrankungen in der Diagnostik der pulmonalen Sarcoidose.

1.5.6 Hinweise und Störungen

Probennahme

Als Probenmaterial sollte Serum oder Heparinplasma verwendet werden. Metallchelatoren wie EDTA sind als Antikoagulanz ungeeignet, da sie die SACE-Aktivität vermindern. ACE ist eine Metallopeptidase mit einem Zinkatom im aktiven Zentrum, durch Bindung des Zinkatoms durch den Chelatbildner wird die Enzymaktivität stark vermindert.

ACE-Hemmer wie z.B. Captopril, Enalapril müssen 4 Wochen vorher abgesetzt sein, da zu niedrige Werte auf Grund der Hemmung von ACE gemessen werden /23/.

Bestimmungsmethode

Etwa 25 % der Patientenseren, insbesondere aber diejenigen von Sarkoidose-Patienten, enthalten einen internen ACE-Hemmer, der die Aktivität von SACE stark erniedrigt. Der hemmende Effekt wird aufgehoben, wenn das Serum 1 : 10 verdünnt wird /23/.

Tests, die Hippuryl-glycyl-glycin als Substrat anwenden, sind besser geeignet als diejenigen mit HHL, da sie weniger anfällig sind für eine Hydrolyse durch Carboxypeptidasen /13/. Vorteile haben diejenigen Tests, die FAPGG als Substrat verwenden, da die Hydrolyserate um den Faktor 3 größer ist. Dadurch ist auch der Referenzbereich höher. Fernerhin ist eine kinetische Messung bei 340–345 nm möglich, was die Messung an mechanisierten Analysensystemen ermöglicht /7/. Beide Substrate, HHL und FAPGG, sind in ihrer Wirkung von Cl^– abhängig. Im Bestimmungsansatz muss deshalb eine NaCl-Konzentration von 250–350 mmol/l vorliegen /1/.

Referenzbereich

Die intraindividuelle Variation von SACE ist gering, die interindividuelle jedoch hoch. So ist der Faktor 6 zwischen dem unteren und oberen Grenzwert bei Erwachsenen. Kleinkinder und Jungen in der Pubertät haben höhere SACE-Aktivitäten als Erwachsene.

Unter Anwendung des Substrates FAPPG wurden für Kinder folgende Referenzbereiche ermittelt /24/:

Angabe von x ± s und in U/l.

Medikamente /23/

Captopril hemmt die ACE-Aktivität bei einem Teil Patienten mit einer Halbwertszeit von 1–4 Tagen, bei einem anderen Teil mit 10–17 Tagen. Der Effekt von Captopril auf die SACE-Aktivität ist variabel:

• Er nimmt mit der Lagerungszeit ab: 10-tägiges Einfrieren bei –70 °C erhöht jedoch die Aktivität um 15–50 %.
• Er ist abhängig von der individuellen Rate der Metabolisierung des Patienten.
• Unter Dialysetherapie geht die inhibitorische Wirkung verloren.
• Er ist von der Serumverdünnung im Reaktionsansatz unabhängig.

Enalapril hemmt nahezu komplett die SACE-Aktivität, die Wirkung ist nicht reversibel durch Lagerung, Serumverdünnung oder Dialyse. Bei sehr niedrigen SACE-Werten sollte deshalb die Einnahme von Enalapril in Betracht gezogen werden.

Stabilität

SACE ist für mindestens 1 Woche bei +4 °C stabil und bei –20 °C für 3 Monate /7/.

1.5.7 Pathophysiologie

ACE ist ein ubiquitäres Enzym, das von Zellen des vaskulären Endothels, von Makrophagen, proximalen Tubuluszellen der Niere, Leydig Zellen und Zellen des Chorioidplexus exprimiert wird. Es ist deshalb in vielen Organen vorhanden, besonders reich sind Lungen und Nieren. Es handelt sich um ein Ektoenzym, das an die Außenseite der Zellmembran vermittels eines hydrophoben Peptidrestes gebunden ist. Die SACE wird durch enzymatische Abspaltung freigesetzt, besonders aus dem vaskulären Lungenendothel /1/.

ACE ist eine Zink-Metalloprotease mit einem MG von 150–170 kD. Der Unterschied im MG beruht auf einer verschiedenen Glykosilierung in den einzelnen Geweben, so beträgt der Kohlenhydratanteil des ACE der Lunge 30 % und enthält Fucose, Mannose, N-acetylglucosamin, Glucose und Sialinsäure /25/. ACE spaltet die letzten beiden Aminosäuren von Peptidsubstraten und jedes Peptid dient als Substrat, vorausgesetzt, dass die vorletzte Aminosäure nicht Prolin ist.

ACE ist auf Grund folgender Reaktionen ein Schlüsselenzym des Renin-Angiotensin Systems (RAS) und des Kallikrein Systems:

• Im RAS (Abb. 1.5-2 – Wirkung von ACE auf das Renin-Angiotensin-System und das Kinin-Kallikrein-System) spaltet ACE das C-terminale His-Leu-Dipeptid vom Angiotensin I ab und bildet das vasoaktive Oktapeptid Angiotensin II. In einem weiteren möglichen Schritt kann vom Angiotensin II die Asparaginsäure in Position 1 abgespalten werden unter Bildung von Angiotensin III. Letzteres ist ein schwächerer Vasokonstriktor als Angiotensin II /1/.
• Im Kallikrein System spaltet ACE das C-terminale Dipeptid Phe-Arg vom Bradykinin ab. Dadurch wird der Vasodilatator inaktiviert.

Auf Grund dieser Reaktionen hat ACE folgende effektorische Wirkungen:

• Aktivierung einer Vasokonstriktion vermittelt durch Angiotensin II.
• Inaktivierung von vasodilatatorischer Wirkung durch Spaltung von Bradykinin.
• Stimulierung der adrenalen Bildung von Aldosteron durch Angiotensin III mit der Folge einer Na⁺- und Wasser-Retention und K⁺-Elimination.

Die duale Rolle des ACE in der Aufrechterhaltung des Blutdrucks sowie in der Homöostase des Elektrolyt- und Wasserhaushaltes haben es zu einem idealen Angriffspunkt zur medikamentösen Behandlung (ACE-Hemmer) des Bluthochdrucks und der Stauungsinsuffizienz des Herzens gemacht. Siehe Abb. 1.5-2 – Wirkung von ACE auf das Renin-Angiotensin System und das Kinin-Kallikrein System.

Verschiedene Polymorphismen des ACE-Gens und mögliche Krankheitsassoziationen sind bekannt /26/. Sie betreffen sowohl die ACE-Aktivität der Gewebe als auch die SACE. Es werden die Genotypen II, ID und DD unterschieden. Personen vom Genotyp DD haben etwa die doppelte SACE-Aktivität wie diejenigen des Typs II. Es bestehen jedoch keine Unterschiede in der Kinetik des ACE, in den Angiotensin II-Werten oder der Konzentration von Aldosteron, noch signifikante Differenzen im Blutdruck.

Die Sarkoidose ist eine granulomatöse Erkrankung unbekannter Genese und charakterisiert durch eine Anhäufung von aktivierten T-Zellen und Makrophagen in dem befallenen Organ, meist handelt es sich um die Lunge. Diese setzen Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α und weitere pro-inflammatorische Zytokine als Mediatoren einer Entzündung und zellulären Immunreaktion frei, mit der Folge einer Ausbildung von nicht verkäsenden Epitheloidzellgranulomen. In den entzündeten Regionen besteht außerdem eine Anreicherung von CD4⁺T-Zellen. Der inflammatorische Prozess ist in allen betroffenen Organen gleich, auch dem ZNS. Die Persistenz der Entzündung induziert fibrotische Veränderungen mit irreversibler Organschädigung.

Die Granulome bei der Sarkoidose bestehen aus Lymphozyten, Makrophagen, Epitheloidzellen, Mastzellen, eosinophilen Granulozyten und Fibroblasten. Es herrscht ein hoher Influx von Immunzellen und eine starke Ver-mehrung und Apoptose von Zellen im Granulom. Bei der Umwandlung von Makrophagen in Epitheloidzellen wird ACE freigesetzt. Auch durch T-Lymphozyten stimulierte Alveolarmakrophagen geben ACE in die Zirkulation ab. Die Aktivität des SACE ist deshalb ein Indikator der Granulomlast des Organismus, während die Konzentration von sIL-2R und von Neopterin und sTNF-R II ein Gradmesser für die Aktivierung der Immunzellen bei Sarkoidose sind /8, 13/.

Literatur

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27. D’Alessandro M. Editorial: sarcoidosis and autoimmunity: From bench to bedside. Frontiers in Medicine 2023. doi: 10.3389/fmed2023.1147529.

1.6 Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST)

Lothar Thomas

Die Aminotransferasen, auch als Transaminasen bezeichnet, sind eine Gruppe von Enzymen, die eine reversible Umwandlung von α-Ketosäuren in Aminosäuren durch Übertragung einer Aminogruppe katalysieren. Die ALT ist im Zytosol der Zellen lokalisiert, wird hauptsächlich in der Leber und den Nieren gefunden und zum geringen Anteil auch im Herz- und Skelettmuskel. Die Hauptmenge der ALT befindet sich in der Leber und ein Aktivitätsanstieg im Serum ist ein spezifischer Marker für Lebererkrankung. Die AST ist im Zytosol und den Mitochondrien gelegen. Sie ist ein ubiquitäres Enzym und wird vorwiegend in der Leber, den Nieren, dem Herz- und Skelettmuskel gefunden. Erhöhungen der AST treten bei Lebererkrankungen, Herzinfarkt und Schäden der Skelettmuskeln auf.

1.6.1 Indikation

ALT

Als Kenngröße einer Leberzellschädigung und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung:

• Abklärung eines Ikterus und Subikterus.
• Lebererkrankung durch hepatotrope Viren.
• Miterkrankung der Leber bei systemischen Viruserkrankungen, bakteriellen und parasitären Infektionen.
• Zur Diagnostik chronischer Lebererkrankungen.
• Bei autoimmuner Leberkrankung.
• Zur Erkennung von Leberschäden durch Alkohol, Arzneimittel, Hepatotoxine, Rauschmittel, toxische Chemikalien am Arbeitsplatz und in der Umwelt, sowie durch Überernährung (Nicht-alkoholische Steatosis der Leber) und durch parenterale Ernährung.
• Bei Verdacht auf Raumforderung in der Leber.
• Bei Lebererkrankung in der Schwangerschaft.
• Verdacht auf hereditäre Stoffwechselstörung (Hämochromatose, M. Wilson, α₁-Antitrypsin-Mangel, zystische Fibrose).
• Indikation einer anti-viralen Therapie bei chronischer Hepatitis und therapeutische Beurteilung.

AST

In Ergänzung zur ALT bei Lebererkrankung:

• Zur differentialdiagnostischen Abklärung.
• In der Ätiologieabklärung und zur Beurteilung der Schwere und des Stadiums der Erkrankung.
• Zur prognostischen Beurteilung des Muskelschadens beim Herzinfarkt.

1.6.2 Bestimmungsmethode

AST (EC 2.6.1.1)
IFCC Primary Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Activity Concentration of Aspartate Aminotransferase at 37 °C /1/

Prinzip: Die AST katalysiert die Übertragung der 2-Aminogruppe von Aspartat auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und Oxalacetat. Letzteres wird im optischen Test mit der Malatdehydrogenase (MDH)-Reaktion bestimmt. Die Hersteller vertreiben Reagenz mit oder ohne 0,1 mmol/l Pyridoxalphosphat. Reagenzien ohne Pyridoxlalphosphat ergeben differente Werte im Vergleich zum Ansatz mit Pyridoxalphosphat. Messgröße ist NADH₂, die Geschwindigkeit der NADH₂-Abnahme wird gemessen. Sie verhält sich proportional zur AST-Aktivität. Siehe Abb. 1.6-1 – Prinzip der Bestimmung von AST und ALT nach IFCC.

ALT (EC 2.6.1.2)
IFCC Primary Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Activity Concentration of Alanine Aminotransferase at 37 °C /2/

Prinzip: Die ALT katalysiert die Übertragung der 2-Aminogruppe von Alanin auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und Pyruvat. Letzteres wird im optischen Test mit der LDH Reaktion bestimmt. Die Hersteller vertreiben Reagenz mit oder ohne 0,1 mmol/l Pyridoxalphosphat. Reagenzien ohne Pyridoxlalphosphat ergeben unterschiedliche Werte im Vergleich zum Ansatz mit Pyridoxalphosphat. Messgröße ist NADH₂, die Geschwindigkeit der NADH₂-Abnahme verhält sich proportional zur ALT-Aktivität. Siehe Abb. 1.6-1 – Prinzip der Bestimmung von AST und ALT nach IFCC.

1.6.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma (Heparin, EDTA, Citrat, Oxalat): 1 ml

1.6.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.6-1 – Referenzbereiche von AST und ALT.

1.6.5 Bewertung

Die Erhöhung der Aminotransferasen spricht für das Vorliegen einer Lebererkrankung, normale Werte schließen diese aber nicht aus, insbesondere bei chronischer Hepatitis, z.B. der Steatohepatitis . Die Prävalenz der Aminotransferasen-Erhöhung in den USA beträgt 7,9 % und steht in Zusammenhang mit den Fettlebererkrankungen. Die Aminotransferasen sind auch ein Prädiktor des allgemeinen Morbiditäts- und Mortalitätsrisikos. So besteht nach der Framingham Offspring Heart Study /6/ eine Beziehung zwischen der Höhe der ALT und der Ausbildung eines metabolischen Syndroms oder Diabetes mellitus innerhalb der folgenden 20 J. Mit jeder Erhöhung des logarithmischen ALT-Wertes bei der Basisuntersuchung um eine Standardabweichung resultierte ein signifikanter Anstieg von metabolischen Syndroms und Diabetes mellitus.

In Kinderkliniken /7/ beruhen etwa 12 % der isolierten Aminotransferasen-Erhöhungen auf einer genetischen Erkrankung. Insbesondere Fälle von muskulärer Dystrophie, die sich als Lebererkrankung darstellen, die falsche Diagnose einer Hepatopathie bei Kindern mit zystischer Fibrose, Coeliakie, Glykogenose und anderen angeborenen Stoffwechselerkrankungen sind zu nennen.

In der Diagnostik des Herzinfarktes hat die AST keine Bedeutung mehr und zur Diagnostik von Skelettmuskel-Erkrankungen ist sie deutlich unempfindlicher als die CK. Das Verhalten der AST bei Herzinfarkt und Muskelerkrankungen wird deshalb nur aus differentialdiagnostischen Gründen abgehandelt.

1.6.5.1 Lebererkrankungen

Die ALT ist die Kenngröße für eine inflammatorische Schädigung des Leberparenchyms. Sie ist der Basisparameter in der labordiagnostischen Stufendiagnostik von Lebererkrankungen und wird angefordert:

• Als Screening-Untersuchung auf Lebererkrankung, wenn keine hinweisenden Symptome oder klinische Beschwerden bestehen.
• Gezielt, wenn klinische Symptome wie Oberbauchschmerz, Ikterus, Lebervergrößerung oder Koma auf eine Lebererkrankung hinweisen. Oft werden dann aus differentialdiagnostischen Erwägungen zusätzlich die AST, GGT, GLDH, LDH und AP angefordert. Zur Differentialdiagnostik siehe auch Beitrag 1.2.1 – Leber-assoziierte Basisdiagnostik.

• Bei bekannter Lebererkrankung zur Charakterisierung der Schwere des Stadiums, zur Abklärung der Ätiologie und zur prognostischen Beurteilung. In Kombination mit der ALT geben die AST, GGT, AP, CHE und die GLDH aussagekräftige Muster.

Die prozentuale Häufigkeit der ALT-Erhöhung bei Lebererkrankungen zeigt Tab. 1.6-2 – ALT-Aktivitäten im Serum und ihre prozentuale Häufigkeit bei Erkrankungen der Leber und Gallenwege.

Das Verhalten der Aminotransferasen bei Lebererkrankungen ist aufgezeigt in Tab. 1.6-3 – Verhalten der Aminotransferasen bei Hepatopathien.

Screening auf Lebererkrankungen

Als Suchmuster auf Lebererkrankungen werden die Aminotransferasen, GGT, AP und CHE empfohlen. Dabei dient die Erhöhung der Aminotransferasen als Marker eines Parenchymschadens, die Erhöhung der GGT als Indikator eines metabolisch-toxischen Schadens, die AP als Marker der Cholestase und die Verminderung der CHE als Hinweis auf eine Reduktion der funktionstüchtigen Leberzellmasse. Bis zu 90 % der Patienten mit Leberschaden werden mit diesem Enzymmuster erkannt. Der Diagnostik entgehen funktionelle Hyperbilirubinämien, Fälle mit nicht-alkoholischer Fettleber, von chronischer Hepatitis C und Restzustände anderer Hepatitiden ohne inflammatorische Aktivität des Leberparenchyms. In einer Studie /8/ an 1.154 Patienten mit Leber- und Gallenwegs-Erkrankungen zeigten 15 % keine Erhöhung der ALT. Es handelte sich vorwiegend um Patienten mit Lebermetastasen, extrahepatischen Gallengangsverschluss, Leberzirrhose und Medikamenten-bedingtem Leberschaden. Die Zirrhose-Patienten zeigten eine Verminderung der CHE, die anderen überwiegend eine Erhöhung der GGT. Da es keinen Hinweis gibt, dass die ALT bei einer Leberschädigung vermehrt in den Hepatozyten gebildet wird, ist primär jeder Wert oberhalb des Referenzbereichs ein Hinweis auf einen Leberschaden. Eine unerwartete Erhöhung von ALT oder AST sollte durch die Bestimmung in einer neuen Probe kontrolliert werden. Denn die intraindividuelle Variation der Aminotransferasen von Tag zu Tag liegt bei 10–30 %, auch können nach starker körperlicher Anstrengung erhöhte Aktivitäten gemessen werden.

Untersuchungsablauf bei symptomatischen Patienten

Akuter Abdominalschmerz: Das Enzymmuster soll so ausgerichtet sein, dass neben einem akuten Leberschaden, bedingt durch eine akute Hepatitis, akuten Gallenwegsverschluss, akute Cholecystitis und Durchblutungsstörung, auch andere Erkrankungen wie Pankreatitis, Ileus, Tubargravidität oder Herzinfarkt erkannt werden. Neben ALT, AST, GGT sollten deshalb GLDH, Lipase oder α-Amylase, kardiales Troponin und hCG sowie das Blutbild und das C-reaktive Protein die ergänzenden Parameter des Untersuchungsmusters sein. Ist die ALT im Referenzbereich, scheidet eine akute Lebererkrankung oder Lebermitbeteiligung aus. Dies gilt ebenfalls für den frischen Verschlussikterus, der auch ausscheidet, wenn die ALT über 20 fach des oberen Referenzbereichswerts ist. Bei der akuten Alkoholhepatitis, die neben dem Reye-Syndrom einige der wenigen akuten Lebererkrankungen ist, bei der initial die AST stärker erhöht ist als die ALT, betragen die Aktivitäten der Aminotransferasen das 10–20 fache des oberen Referenzbereichswerts.

Die Erhöhung der Aminotransferasen über 20 fach des oberen Referenzbereichswerts, ergibt differential diagnostisch die Fragestellung akute Virushepatitis, akute Durchblutungsstörung oder akuter toxischer Leberschaden. Bei der Durchblutungsstörung ist die GLDH etwa gleich erhöht wie die Aminotransferasen, beim toxischen Schaden etwa nur halb so hoch und bei der Virushepatitis nicht höher als 10 % der Aktivität der Aminotransferasen. Eine Abgrenzung der akuten Intoxikation von der akuten Durchblutungsstörung ermöglicht die Bestimmung der CHE. Diese ist bei der Intoxikation um mehr als 50 % unter die untere Referenzbereichsgrenze abgefallen, bei der Durchblutungsstörung ist das jedoch nicht der Fall /7/.

Ikterus und Subikterus: Bei ikterischen Patienten oder Vorliegen einer Hyperbilirubinämie muss die Frage hepatischer oder hämolytische Ikterus abgeklärt werden. Neben der Bestimmung des gesamten und des direkt reagierenden Bilirubins ist der Quotient LDH/AST bedeutsam; ein Wert > 5 weist auf die hämolytische Genese des Ikterus hin. Siehe auch Tab. 5.2-2 – Hyperbilirubinämie.

Koma: Bei Vorliegen eines komatösen Zustandes ist es wichtig das Leberkoma zu erkennen. Liegt ein hepatogenes Koma vor, muss eine Differenzierung des fulminanten Leberversagens von der hepatischen Enzephalopathie erfolgen. Während bei der Letzteren die Werte der Aminotransferasen denen bei der Leberzirrhose gleichen, also leicht bis mäßig erhöht sind, zeigen sie beim fulminanten Leberversagen durch z.B. Paracetamol oder bei Knollenblätterpilz-Vergiftung sowie beim Halothan-Typ ein charakteristisches Nekrosemuster. Die ALT und AST sind mehr als 20 fach erhöht, die AST stärker als die ALT und die GLDH hat Werte in der gleichen Größenordnung. Die CHE ist bei portosystemischer Enzephalopathie meist schon erniedrigt bei Aufnahme des Patienten, während sie beim fulminanten Leberversagen, auf Grund ihrer langen Halbwertszeit erst nach den Gerinnungsfaktoren, gemeinsam mit dem Albumin, abfällt.

Abgrenzung und Differenzierung der Cholestase: Schon das Muster beim Screening gibt den Hinweis auf eine Cholestase. Eine hohe GGT und AP bei nur gering bis mäßig erhöhter ALT weisen auf die Cholestase, eine im Vergleich zur GGT und AP deutlich höhere ALT spricht für die Hepatitis. Eine Unterscheidung, ob die Cholestase die großen Gallengänge betrifft, also extrahepatischer Genese ist oder eine intrahepatische Obstruktion der kleinen Gallengänge bzw. eine toxische Begleitcholestase vorliegt, kann labordiagnostisch erst erfolgen, wenn durch bildgebende Verfahren eine extrahepatische Cholestase ausgeschlossen wurde.

Beurteilung der Schwere einer Lebererkrankung

Die Aktivität der Aminotransferasen im Serum korreliert sowohl mit der Anzahl der geschädigten Hepatozyten, als auch mit der Schwere des Einzelzellschadens und damit der Akuität der Lebererkrankung. So kommt es zu einer Erhöhung der ALT über den oberen Referenzbereichswert, wenn etwa 1 von 750 Hepatozyten geschädigt wird. Auskunft zur Schwere der Einzelzellschädigung gibt die Höhe der AST in Relation zur ALT in Form des De-Ritis-Quotienten AST/ALT. Die AST-Aktivität der Leberzelle ist zu etwa 70 % in den Mitochondrien und zu 30 % im Zytoplasma lokalisiert. Quotienten unter 1,0 zeigen an, dass der Leberschaden eher leichteren Grades ist, es handelt sich besonders um akute, reversible, entzündliche Lebererkrankungen wie die akute Virushepatitis B. Quotienten > 1,0 kennzeichnen den Leberschaden als schwer und zum Nekrosetyp gehörig /10/.

Akuter Leberzellschaden: Akute Lebererkrankungen können auf einer Virushepatitis, alkoholischen Hepatitis, Gallengangverschluss, toxischen Schädigung oder einer akuten Durchblutungsstörung beruhen. Erhöhungen der ALT oder AST über 10 fach des oberen Referenzbereichswerts sind fast immer ein Hinweis auf diese Erkrankungen.

Chronischer Leberzellschaden /10/: Chronische Erkrankungen der Leber sind als eine kontinuierliche hepatozelluläre Nekrose und Entzündung der Leber, meist mit einer Fibrose einhergehend, definiert. Chronische Lebererkrankungen können in eine Leberzirrhose übergehen und die Vorbedingung zur Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms sein. Sie sind häufig die Folge einer Infektion mit hepatotropen Viren, machen minimale Symptome und bergen längerfristig die Gefahr einer erhöhten Morbidität und Mortalität. Eine Persistenz der ALT für über 6 Monate nach einer akuten Hepatitis oder eine mehrmalig gemessene ALT-Erhöhung innerhalb von 6 Monaten ohne plausible Erklärung weisen auf die chronische Lebererkrankung hin.

Bei den chronischen Lebererkrankungen besteht eine Beziehung zwischen Progredienz und Aktivität der Aminotransferasen. Entwickelt sich rasch eine Zirrhose, sind die Aktivitäten hoch. Normalerweise ist die ALT bei den chronischen Lebererkrankungen höher als die AST oder die AST ist sogar normal. Mit fortschreitender Verminderung des Leberparenchyms nimmt die ALT stärker ab als die AST und der De-Ritis-Quotient erreicht Werte über 1. Eine Ausnahme ist die chronische Alkoholhepatitis, mit einem De-Ritis-Quotienten schon zu Beginn von über 1, häufig sogar über 2. Bei Patienten mit negativen Virusmarkern sind Medikamente und chronischer Alkoholkonsum die wesentlichen Ursachen chronischer Lebererkrankungen. Nicht vergessen werden sollten andere mit einer Erhöhung der ALT einhergehende Lebererkrankungen wie z.B. autoimmune Hepatitis, cholestatische Lebererkrankung, α₁-Antitrypsin-Mangel und M. Wilson.

Leberzirrhose /10/: Die Leberzirrhose ist durch eine Fibrose und den Umbau der normalen Leberstruktur in abnorme Knoten charakterisiert. Sie ist die Folge einer chronischen Lebererkrankung mit progressivem Untergang von Leberparenchym. Die sich bildenden regenerativen Knoten sind kein vollwertiger Ersatz für das untergegangene Parenchym. Es resultiert eine Einschränkung der Leberfunktion auf Grund einer verminderten Stoffwechselleistung und reduzierten Ausstattung der Hepatozyten mit Enzymen. Die fortschreitende Reduzierung von intaktem Leberparenchym spiegelt sich in geringer Erhöhung von ALT und AST sowie dem Anstieg des De-Ritis-Quotienten wider. Zur Erkennung der Leberzirrhose beträgt die diagnostische Sensitivität eines Quotienten > 1 etwa 32–83 % bei einer diagnostischen Spezifität von etwa 75–100 % /11, 12/.

Die zunehmende Einschränkung der Leberfunktion wird durch die Veränderung von Markern angezeigt. Wichtige Hinweise einer Progression sind die Verlängerung der Thromboplastinzeit und die Abnahme von CHE, Albumin und der Thrombozytenzahl. In der Beurteilung des Verlaufs der Leberzirrhose sollten diese Parameter alle 3–6 Monate bestimmt werden.

Beurteilung des Stadiums der Lebererkrankung

Das Stadium einer akuten Lebererkrankung kann an den zeitlichen Veränderungen der Aminotransferasen und ihrem Verhalten zur Bilirubin Konzentration abgeschätzt werden. Auf Grund der etwa dreimal längeren Halbwertszeit der ALT (47 h) gegenüber der AST (17 h) erlaubt der im Verlauf der Heilung abfallende AST/ALT-Quotient eine Abschätzung des Krankheitsstadiums. So beträgt dieser 0,6–0,8 bei akuter Hepatitis B, wenn die ALT und AST Gipfelwerte erreichen, fällt dann langsam ab und liegt in der vierten Erkrankungswoche bei 0,2–0,4. In der Abgrenzung der abklingenden ikterischen Hepatitis von der Frühform einer leichten akuten Hepatitis mit niedrigem AST/ALT-Quotienten kann die LDH hilfreich sein. Sie ist bei der abklingenden Form auf Grund einer Halbwertszeit von nur 10 h schon wieder normal, während sie bei der akuten leichten Form einen Wert hat, der zwischen dem von AST und ALT liegt /6/.

Aminotransferasen in Relation zum Bilirubin /10/: ALT und AST zeigen bei der akuten Virushepatitis B Gipfelwerte mit dem Auftreten des Ikterus in der ersten Krankheitswoche. Die Maximalwerte des Bilirubins werden erst bis zu 1 Woche später erreicht. Mit Auftreten des Ikterus fallen die Aminotransferasen kontinuierlich, täglich um etwa 10 % ab. Die ALT bleibt 27 ± 16 Tage, die AST 22 ± 16 Tage erhöht. Bei der akuten toxischen Hepatitis und der akuten Durchblutungsstörung werden die Gipfelwerte der Aminotransferasen schon innerhalb von 24 h nach Klinikaufnahme erreicht, wobei die AST höher als die ALT ist. Innerhalb der nächsten 24 h fallen die Aminotransferasen wieder ab. Die AST kann um bis zu 50 % abnehmen und fällt auf Grund der kürzeren Halbwertszeit stärker ab als die ALT. Schon 7 Tage nach der akuten Schädigung kann die AST wieder im Referenzbereich sein.

Abklärung der Ätiologie von Lebererkrankungen /9, 11/

Die Abklärung der Ätiologie von Lebererkrankungen ist ein Teil der Differentialdiagnose und die Voraussetzung für eine kausale Therapie. Die Aminotransferasen haben dabei nur eine geringe Aussagekraft. Das gilt besonders für Lebererkrankungen mit geringen Schädigung bedingten oder annähernd gleichen Enzym Veränderungen wie das z.B. bei den akuten und chronischen Virushepatitiden und der Leberzirrhose der Fall ist. Auch können chronisch aktive Hepatitiden durch hepatotrope Viren Enzym Veränderungen in der gleiche Größenordnung verursachen wie akute Hepatitiden durch nicht hepatotrope Viren. Ein weiteres Problem sind Medikamenten-toxische Leberschäden, die als hepatitische oder cholestatische Verlaufsform, als Fettleber oder variable Kombinationen auftreten.

Untersuchungen zur Abklärung der Ätiologie und mit pathogener Beweisqualität sind (siehe auch Beitrag 1.2.4 – Chronische Lebererkrankungen):

• Die serologisch und molekularbiologisch nachweisbaren Marker zur Abgrenzung der verschiedene Typen der Virushepatitis.
• Der Nachweis von Autoantikörpern bei den autoimmunen Lebererkrankungen.
• Eine das primäre Leberzellkarzinom nachweisende Konzentration an α-Fetoprotein.
• Eine auf chronischen Alkoholabusus weisende Erhöhung des Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT).

Eine gewisse Abklärung der Ätiologie ist bei der chronischen Hepatitis und der Leberzirrhose vermittels der Enzymdiagnostik in Kombination mit der Serumprotein-Elektrophorese bzw. der Immunglobulinbestimmung möglich. So können autoimmune Lebererkrankungen und Zirrhosen mit einer Hyperproteinämie und/oder hohen γ-Globulinfraktion in der Serumprotein-Elektrophorese einhergehen, oder auf Grund einer Vermehrung von IgA eine Verschmelzung der β- und γ-Globulinfraktion bei Alkohol-toxischer Ätiologie haben. Die posthepatitische Zirrhose zeigt eine relative Vermehrung von IgG und die primäre biliäre von IgM gegenüber den anderen Immunglobulinklassen.

Prognostische Beurteilung der Hepatitis

Die prognostische Beurteilung konzentriert sich auf folgende Fragestellungen /8/:

• Heilt die akute Hepatitis aus oder geht sie in eine chronische Verlaufsform über?
• Entwickelt sich die nekrotisierende Form und kommt es zum Leberversagen?
• Ist ein therapeutischer Erfolg erkennbar?

Ausheilung der Hepatitis: Die akute Virushepatitis A und B sind gewöhnlich selbstlimitierend, nahezu alle Fälle von Hepatitis A und 95 % von Hepatitis B heilen aus. Etwa 85 % der akuten Hepatitis C-Infektionen gehen in eine chronische Verlaufsform über. Während der akuten Phase einer Hepatitis erlauben die Aminotransferasen im Einzelfall keine Aussage, ob die Hepatitis ausheilt oder in eine chronische Verlaufsform übergeht. Da die ALT und die GGT die zuletzt normalisierenden Enzyme sind, wird ein Monitoring mit Messungen alle 2 Wochen empfohlen. Normalisieren die Enzymwerte nicht innerhalb von 6 Monaten oder kommt es zu rezidivierenden Anstiegen, muss mit einer chronischen Verlaufsform gerechnet werden. Das ist auch immer der Fall, wenn bei der Hepatitis B keine Antikörper gegen HBsAg und HBeAg gebildet werden oder eine Viruspersistenz festgestellt wird.

Übergang in eine schwere Verlaufsform: Untersuchungen der Enzyme sollten Patienten mit erhöhtem Risiko für Leberversagen erkennen. Dies erfolgt bei den nekrotisierenden Verlaufsformen, und zwar zu 0,1 % bei Hepatitis A und C, zu etwa 1 % bei Hepatitis B, bis zu 20 % bei der Hepatitis D und bis zu 4 % bei der Hepatitis E (Schwangere bis 20 %). Da sich die Höhe der Aminotransferasen mehr nach der Ätiologie des akuten Leberschadens als dem Schweregrad orientiert, ist die absolute Höhe ihrer Aktivität prognostisch nicht verwertbar. Eine schlechte Prognose kündigt sich jedoch bei Ausbildung eines Nekrosemusters an, das im Abfall aller Enzyme des Hepatozyten besteht oder nur in einem Abfall der ALT bei gleichzeitigem Anstieg von AST, GLDH und LDH.

Antivirale Hepatitis-Behandlung /13, 14/: Bei der virustatischen Behandlung der chronischen Hepatitis B und C wird die ALT zur Beurteilung des Therapieerfolgs bestimmt. Denn die ALT ist ein Marker zur Beurteilung der entzündlichen Aktivität der Leber, obwohl sie nur beschränkt Aussagen zum Ausmaß der Entzündung zulässt und wenig zur Schwere der Fibrosierung aussagt. Siehe weiterführend Tab. 1.2-5 – Laboruntersuchungen bei Hepatopathien.

1.6.5.2 Muskelerkrankungen

Bei der Vermutung eines frischen Myokardinfarkts beträgt die diagnostische Sensitivität der AST 96 % bei einer diagnostischen Spezifität von 86 % 12 h nach dem akuten Ereignis /15/. Die ALT ist nur im Verlauf bedeutsam, und zwar, wenn eine Rechtsherzinsuffizienz beim Infarkt vermutet wird. Zur Diagnostik von Erkrankungen des Skelettmuskels ist die AST gegenüber der CK weniger sensitiv und spezifisch. Die Erhöhungen von AST und CK weisen auf einen Muskelschaden hin. Das Verhalten der Aminotransferasen bei Herzerkrankungen ist in Tab. 1.6-4 gezeigt und bei Skelettmuskelerkrankungen in Tab. 1.6-5.

1.6.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Die IFCC-Methode ist für 37 °C optimiert und enthält Pyridoxalphosphat im Reagenz. Vor Start der spezifischen Reaktion durch Zugabe von α-Ketoglutarat werden die ALT bzw. AST durch Sättigung mit Pyridoxalphosphat in einer Vorinkubation aktiviert. Zusätzlich wird in der Probe vorhandenes Pyruvat in Lactat in der Gegenwart von NADH umgewandelt /1, 2/. Der Vorteil des Pyridoxalphosphat-Zusatzes ist eine Stabilisierung der enzymatischen Aktivität der Aminotransferasen. In Proben mit ungenügend endogenem Pyridoxalphosphat, z.B. bei Patienten mit Herzinfarkt, Lebererkrankungen oder bei Intensivpatienten, können ohne Pyridoxalphosphat-Zusatz falsch-niedrige Aktivitäten gemessen werden.

Eine Verarmung von NADH würde im AST-Ansatz erfolgen, wenn in der Vorinkubation das Pyruvat nicht entfernt würde /16/.

Die Höhe der ALT und auch der obere Referenzbereichswert sind vom Analysesystem abhängig. So betrugen bei einem Ringversuch die interlaboratoriellen Schwankungen 69–83 U/l (Schwankung 14 U/l), aber nur 4–8 U/l, wenn in den verschiedenen Laboratorien mit dem Analysesystem des gleichen Herstellers gemessen wurde /17/.

Untersuchungsmaterial

Empfohlen wird Serum; Heparinplasma kann eine Trübung des Ansatzes verursachen /1/.

Referenzbereich

Die für die IFCC-Methode angegebenen Bereiche beziehen sich auf Erwachsene im Alter von 20–60 Jahren /1, 2/. Amerikaner afrikanischen Ursprungs haben 15 % höhere Werte als Kaukasier. Das American College of Gastroenterology empfiehlt für die ALT als oberen Referenzbereichswert für Männer 33 U/L und 25 U/L für Frauen. Für Kinder empfiehlt die North American Society of Pediatric Gastroenterology folgende obere Referenzbereichswerte: 26 U/L für Jungens und 22 U/L für Mädchen. Die Empfehlungen finden keine ungeteilte Zustimmung /18/.

Makro-AST

Siehe Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

Hämolyse

Führt bei ALT-Werten im Referenzbereich ab einer Hb-Konzentration von 2,5 g/l zu einer Erhöhung von etwa 10 %. Die AST steigt ab einem Hb-Wert von 1,5 g/l mit zunehmender Hämolyse an. Die Aktivität der ALT in den Erythrozyten ist 7 fach, die der AST 15 fach höher als im Serum /19/. Hämolytische Anämien machen eine leichte Erhöhung der AST bei starker Erhöhung der LDH, bei in-vivo Hämolyse ist das Kalium normal, bei in-vitro Hämolyse erhöht.

Halbwertszeit /20/

AST 17 ± 5 Stunden mitochondriale AST 87, ALT 47 ± 10 Stunden.

Variation

Die Variation der Aminotransferasen im Serum innerhalb eines Tages beträgt 45 %, mit den höchsten Werten am Abend und den tiefsten in der Nacht. Die Variation von Tag zu Tag ist 5–10 % /20/.

Körpergewicht

Personen mit hohem Body Mass Index haben um 40 % höhere Aminotransferasen als Normalgewichtige /20/.

Hämodialyse-Patienten

Diese Patienten können niedrige AST- und ALT-Werte auf Grund von Pyridoxalphosphat-Mangel haben /16/.

Stabilität im Serum

ALT und AST sind bei 9 °C 1 Woche stabil, die AST nimmt bei 20 °C leicht kontinuierlich ab /21/.

1.6.7 Pathophysiologie /6, 7, 8, 9/

Die Veränderung der Aktivität von Enzymen im Serum von normalerweise Struktur gebundenen Enzymen der Leber ist ein Indikator zur Diagnostik von Störungen der Architektur und Funktion des Organs. Die Leber besteht zu 79,9 % aus Parenchymzellen, zu 16,6 % aus Uferzellen und zu 3,6 % aus anderen Zellen. Unter Uferzellen werden die Endothel- und Kupfferzellen verstanden.

Die Gesamtzellzahl von 1 mg Lebergewebe beträgt 202.000, davon sind 171.000 Parenchymzellen und 31.000 Uferzellen. Die 300 Milliarden Parenchymzellen der Leber haben über die Sinusoide einen engen Kontakt mit dem zirkulierenden Blut. Die Uferzellen sind in den Sinusoiden den Parenchymzellen vorgelagert und wirken als Filtermechanismus. So säubern die Kupffer’schen Sternzellen, es handelt sich um Makrophagen des retikulo-endothelialen Systems, das Blut von Zelltrümmern, Mikroorganismen und kolloidalen Substanzen durch Phagozytose.

Die Parenchymzellen sind keine einheitliche Zellpopulation. Entsprechend ihrer Lage im Leberläppchen sind sie dem unterschiedlichen Angebot an Sauerstoff und Substraten angepasst. Dieses nimmt auf dem Weg von der Portal- zur Zentralvene ab, was eine unterschiedliche Ausstattung mit Zellorganellen und Enzymen zur Folge hat. Das wird diagnostisch genutzt, denn Zellschädigungen führen zum Austritt löslicher Enzyme und aus dem im Serum gemessenen Enzymmuster kann geschlossen werden, welche Region im Leberläppchen besonders geschädigt wurde. So kommt es bei einer peripheren Schädigung zu einem stärkeren Austritt der ALT aus der Zelle als bei einer zentralen, da die ALT-Aktivität in der Peripherie des Leberläppchens höher ist als zentral.

Der Name Aminotransferase beschreibt die Funktion der Enzyme AST und ALT, nämlich die Übertragung der NH₂-Gruppe von Aminosäuren auf Ketosäuren, bevorzugt α-Ketoglutarat. Auf diese Weise werden beim Katabolismus der Aminosäuren die Aminogruppen der verschiedenen Aminosäuren in einer einzigen Aminosäure, bevorzugt Glutamat, gesammelt. In einer nachfolgenden Reihe von Reaktionen, z.B. der oxidativen Desaminierung, wird der Stickstoff dem Glutamat entzogen und in Exkretions fähige Stickstoff enthaltende Verbindungen überführt. Siehe Abb. 5.1-2 – Stoffwechselwege des Glutamats.

Leber, Herz- und Skelettmuskel haben im Vergleich zu den anderen Organen eine relativ hohe spezifische Aktivität an AST. Sie sind deshalb nahezu immer die Herkunftsorgane einer gesteigerten AST-Aktivität.

Die ALT hat in der Leber eine etwa 10 fach höhere spezifische Aktivität als im Herz- und Skelettmuskel und kann somit als Leber spezifisches Enzym betrachtet werden. Sie ist geeignet als Suchenzym zur Erkennung von Lebererkrankungen.

AST und ALT sind in der Leber in Parenchym- und Nicht-Parenchymzellen lokalisiert. Die ALT ist nur im Zytoplasma gelöst, hat ein MG von etwa 110 kD und ihre Aktivität ist in der Leberzelle 2.800 fach höher als im Serum. Die AST ist ein dimeres Molekül, das MG der gelösten Form ist 93 kD, das der mitochondrialen 91 kD. Diese ist zu 30 % im Zytoplasma gelöst und zu 70 % an mitochondriale Strukturen gebunden. Die AST-Aktivität ist in der Leber 7.000 fach höher als im Serum. Aus Leberzellen freigesetzte Enzyme gelangen leicht und schnell in die Zirkulation, da die Sinusoide keine Basalmembran besitzen.

Das bei Lebererkrankungen im Plasma erscheinende Enzymmuster und die Höhe der Enzymaktivitäten sind abhängig von der Art der Schädigung.

Bei der akuten Virushepatitis sind nahezu alle Zellen eines Leberläppchens befallen. Es liegt eine leichte Entzündung der Leberzellen mit Störung der Permeabilität der Zellmembran vor und zytoplasmatische ALT und AST gelangen in das Plasma. Da weniger AST als ALT freigesetzt wird ist der Quotient AST/ALT gewöhnlich unter 1,0. Zur Pathogenese der Virushepatitis B wird angenommen, dass das Virus selbst die Parenchymzellen nur wenig schädigt. Zirkulierende virale Antigene sollen nach Erkennung durch T-Lymphozyten die Proliferation sessiler T-Lymphozyten bewirken, die sich gegen Leberzellen richten. Die T-Lymphozyten erkennen virogene Proteine in der Plasmamembran der Leberzelle und verursachen deren Schädigung. Die Ionendurchlässigkeit der Plasmamembran wird somit erhöht und es kommt zu einer kolloidosmotischen Schwellung oder gar Zelllyse.

Bei der akuten Virushepatitis korreliert die Höhe der in das Plasma übertretenden Aminotransferasen mit der Menge des befallenen Parenchyms. Sind die Schädigungen der Leberzellen reversibel, resultiert eine Restitutio ad integrum. Stärkere Schädigung verursacht einen vermehrten Übertritt der Aminotransferasen, insbesondere der mitochondrialen AST in das Plasma. Ein AST/ALT-Quotient über 1,0 ist Indikator eines solchen Geschehens und zeigt den Untergang von Leberzellen an.

Chronische Entzündungen der Leber verlaufen herdförmig. Die von den periportalen Feldern ausgehenden Nekrosen von Einzelzellen führen bei der chronisch aktiven Hepatitis nur zu einem mäßigen bis mittleren Aminotransferasen-Anstieg und Erhöhung der LDH. Der AST/ALT-Quotient ist über 1. Es besteht keine direkte Korrelation zwischen der Höhe der Aminotransferasen und der Entzündungsaktivität.

Das Abwehrsystem der Uferzellen kann bei chronischen Lebererkrankungen, insbesondere der Leberzirrhose, insuffizient werden. Es kommt dann zu einem Übertritt von Antigenen in die Zirkulation. Das tritt besonders auf, wenn bei eingeschränkter Leberdurchblutung ein spontaner oder chirurgischer Shunt das Blut an der Leber vorbeiführt. Die Immunreaktion auf von der Leber nicht abgefangene Antigene verursacht eine polyklonale Vermehrung der Gammaglobuline in der Serumprotein-Elektrophorese.

Bei der alkoholischen Hepatitis ist die AST höher als die ALT. Während alle anderen Hepatitiden eine zelluläre Verminderung der zytosolischen und mitochondrialen AST verursachen, kommt es bei der alkoholischen Form nur zu einem zytosolischen Verlust.

Der Verschlussikterus und akute hypoxische Hepatopathien auf Grund einer Durchblutungsstörung sowie toxische Substanzen bewirken den Untergang zentroazinärer Parenchymzellen. Es resultiert ein überproportionaler Anstieg der GLDH in Relation zur ALT.

Bei akuten, toxischen Leberschäden mit massiver Zellnekrose entspricht das Muster der Enzyme im Serum dem der Parenchymzellen: LDH > AST > ALT > GLDH.

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1.7 Cholinesterasen (ChE)

Lothar Thomas

Cholinesterasen hydrolysieren Acetylcholin. Zwei verwandte Enzyme werden unterschieden /1/:

• Acetylcholin-acetylhydrolase (EC 3.1.1.7), auch als Acetylcholinesterase (AChE) bezeichnet. Sie kommt in Erythrozyten, der grauen Substanz des Zentralnervensystems, den sympathischen Ganglien der motorischen Endplatte der Muskelzelle, in Lunge und Milz, aber nicht im Plasma vor. Nur Cholinester werden hydrolysiert, nicht aber Arylester und Alkylester. Die AChE spaltet an Nervenendigungen freigesetztes Acetylcholin und vermittelt so den Nervenimpuls über die Synapse zum Endorgan. Die AChE wird mit einem anderen Substrat bestimmt als die nachfolgend beschriebene Acylcholin-acylhydrolase.
• Acylcholin-acylhydrolase (EC 3.1.1.8), auch als Cholinesterase (ChE) bezeichnet. Sie kommt im Plasma, der Leber, Darmschleimhaut, Pankreas, Milz und der weißen Substanz des Zentralnervensystems vor. Die ChE spaltet neben Cholinestern auch Benzoylcholin und Butyrylthiocholin sowie Arylester und Alkylester. Die Funktion des im Serum vorkommenden Enzyms ist unbekannt. AChE und ChE werden durch die Alkaloide Prostigmin und Physostigmin kompetitiv gehemmt. Nachfolgend wird nur die ChE, also die im Plasma messbare Enzymaktivität abgehandelt.

1.7.1 Indikation

• Verdacht auf eingeschränkte Funktionsleistung der Leber.
• Vor Gabe von Muskelrelaxantien vom Succinylcholin-Typ, wenn der Hinweis auf eine Cholinesterasevariante besteht.
• Bei verlängerter Apnoe nach operativen Eingriffen.
• Vergiftung mit Pestiziden.
• Kontrolle Pestizid-exponierter Arbeiter.
• Intensiv-pflichtige Patienten mit pathologischen Globaltests der Blutgerinnung oder nicht erklärbarer Hypoalbuminämie.

1.7.2 Bestimmungsmethode

Bestimmung der Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) /2/

Prinzip: Acetylthiocholin wird durch AChE in die Reaktionsprodukte Essigsäure und Thiocholin hydrolysiert. Die katalytische Aktivität der AChE wird bestimmt durch Messung der Absorptionszunahme des gelben Farbstoffes 5-Thio-2-nitrobenzoat, der entsteht, wenn Thiocholin mit gepufferter 5.5‘dithio-bis-2-nitrobenzoesäure (DTNB, 10 mmol/l; NaHCO₃ 17,85 mmol/l = gepuffertes Ellman’s Reagenz) reagiert.

Benzoylcholin-Methode /3/

Prinzip: Benzoylcholin wird durch AChE in die Produkte Benzoesäure und Cholin hydrolysiert. Die Abnahme der Absorption von Benzoylcholin wird bei 240 nm gemessen.

Bestimmung der Acylcholin acylhydrolase (EC 3.1.1.8) bei 37 °C /4/

Prinzip: Substrate wie Butyrylthiocholin, Acetylthiocholin oder Propionylthiocholin werden vergleichbar hydrolysiert (Tab. 1.7-1 – Prinzip der CHE-Bestimmung und Berechnung der Dibucainzahl). Das gebildete Thiocholin wird in einer chromogenen Reaktion erfasst. Siehe Tab. 1.7-2 – Chromogene Reaktionen zur Messung des gebildeten Thiocholins.

1.7.2.1 Phänotypisierung genetischer Varianten

Die Synthese der ChE im Plasma wird von einem Genlocus auf dem langen Arm des 3. Chromosoms kontrolliert.

Bekannt sind die Allele U, A, S, F, H, J, K, die für die Synthese von potenziell 28 Phänotypen verantwortlich sind /1, 5/.

Bei einigen Personen kommt mehr als eine Mutation im gleichen Gen vor, so dass ein Phänotyp nicht immer mit einem Genotyp identisch ist. So kann z.B. der UA-Phänotyp den zwei Genotypen UA und UAK entsprechen.

Bis zu 45 verschiedene diploide Genotypen sind möglich, aber nur 11 verschiedene Phänotypen /6/. Ein Teil der ChE-Varianten bewirkt eine Erniedrigung der ChE im Plasma, hydrolysiert nicht Succinylcholin und bewirkt eine verlängerte Apnoe nach operativen Eingriffen, bei denen Muskelrelaxantien vom Succinylcholin-Typ verabreicht werden. Siehe Tab. 1.7-8 – Biochemische Eigenschaften der Cholinesterase-Varianten.

Die klassische Methode zur biochemischen Genotypisierung der ChE im Plasma sind Untersuchungen zur Hemmung der ChE mit Dibucain und Fluorid.

Dibucain-Hemmung

Prinzip: In Anwesenheit des Lokalanästhetikums Dibucain wird die Aktivität normaler ChE stärker gehemmt als atypische ChE-Varianten.

Bezugnehmend auf das Ausmaß der Hemmung werden Personen folgenden drei Gruppen zugeordnet /7/:

• Hemmung über 70 %; die Person ist homozygot in beiden Genen für eine normale ChE.
• Hemmung 40–70 %; die Person ist heterozygot und besitzt ein Gen für die normale ChE und eines für eine atypische ChE.
• Hemmung unter 30 %; die Person ist homozygot in beiden Genen für eine atypische Variante.

Bestimmt wird die ChE in An- und Abwesenheit von 1 × 10^–5 mol/l Dibucain mit der Benzoylcholin-Methode /7/, seltener unter Anwendung von Acetylthiocholinestern als Substrat /8/.

Berechnet wird die Dibucainzahl anhand der in Tab. 1.7-1 – Prinzip der ChE-Bestimmung (oben) und Berechnung der Dibucainzahl aufgeführten Formel.

Fluorid-Hemmung

Wird angewendet zur Bestimmung der Fluorid-resistenten ChE-Varianten (Tab. 1.7-8 – Biochemische Eigenschaften der Cholinesterase-Varianten). Die Bestimmung erfolgt entsprechend der Dibucainzahl, die Fluoridkonzentration im Bestimmungsansatz ist 5 × 10^–5 mol/l /9/.

Ro 2-0683-Hemmung

Ro 2-0683 ist ein spezifischerer Inhibitor der ChE als Dibucain. Die normale ChE (E₁^U) wird zu nahezu 100 % gehemmt, die atypische Variante (E₁^a) nahezu nicht /5/.

1.7.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Heparinplasma: 1 ml

1.7.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.7-3 – Referenzbereich der ChE.

1.7.5 Bewertung

Verminderungen der ChE sind häufig bei Lebererkrankungen, Medikamenten-bedingt und bei Vergiftung mit Insektiziden, seltener sind sie hereditär bedingt.

1.7.5.1 ChE bei Lebererkrankungen

Die ChE wird in vom Parenchym derLeber synthetisiert und in das Plasma exportiert. Die Aktivität im Serum ist von der adäquaten Funktion des Enzyms und der Anzahl der Parenchymzellen der Leber abhängig. Deshalb ist die ChE eine Messgröße der globalen Leberfunktion. Nur schwere Leberschäden, die mit einer Reduzierung der Proteinsynthese der Parenchymzellen einhergehen oder die auf einer starken Verminderung der Masse an Parenchymzellen beruhen, führen zu einem Absinken der ChE unter den unteren Referenzbereichswert /12/.

Generell trägt die isolierte Bestimmung der ChE wenig zur Diagnostik von Lebererkrankungen bei. So beträgt bei einer Prävalenz von 8 % der Patienten mit Lebererkrankungen im Krankengut der positive Vorhersagewert eines pathologischen Befundes nur 21 % und der negative Vorhersagewert des normalen Befundes, der diese ausschließt, 97 % /13/. Trotz des niedrigen positiven Vorhersagewerts hat die ChE eine diagnostische Bedeutung (Tab. 1.7-4 – Lebererkrankungen, die mit einer verminderten ChE einhergehen können):

• Screening auf Lebererkrankung im Muster mit der GGT und ALT. Obwohl die diagnostische Sensitivität der ChE zur Erkennung von Lebererkrankungen geringer ist als die von GGT und ALT ist sie in der Kombination wichtig für das Screening. Denn bei fortgeschrittener chronischer Lebererkrankung können GGT und ALT im Referenzbereich sein und nur die verminderte ChE auf eine Lebererkrankung hinweisen /12/.
• Indikator für eine Mitreaktion der Leber bei systemischen Erkrankungen. Als Ursache der nicht auf einer primären Lebererkrankung beruhenden Erniedrigung der ChE kommen schwere Krankheitsbilder mit kataboler Stoffwechsellage in Frage, z.B. maligne Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, intensivmedizinische Behandlung, Proteinmangelernährung /14/.
• Als prognostischer Parameter, insbesondere in der Beurteilung des Verlaufs bei Leberzirrhose, beim fulminanten Leberversagen oder nach Lebertransplantation. Abfallende oder deutlich erniedrigte Werte weisen auf eine schlechte Prognose hin /12/.

Die Synthese von Albumin und ChE in der Leber erfolgt gekoppelt. Veränderungen der ChE, die nicht Leber-bedingt sind, zeigen deshalb kein gleichartiges Verhalten zum Albumin. Aus dem Verhalten von Albumin und ChE im Serum kann diagnostische Information gewonnen werden. Siehe Tab. 1.7-5 – Differentialdiagnostische Bedeutung der kombinierten Bestimmung von ChE und Albumin.

Patienten mit alkoholischer Verfettung der Leber haben in über 50 % der Fälle eine ChE im oberen Referenzbereich oder eine leichte Erhöhung /15/. Weitere Erkrankungen sind aufgeführt in Tab. 1.7-6 – Weitere Erkrankungen, die mit verminderter ChE einhergehen können.

1.7.5.2 ChE Verminderung durch Medikamente

Die ChE wird durch die Alkaloide Prostigmin und Physostigmin reversibel gehemmt. Beide Alkaloide konkurrieren mit dem Cholinrest des Acetylcholins um dessen Bindungsstelle am Enzym. Andere Medikamente und Substanzen hemmen die ChE irreversibel. Eine Liste von Medikamenten zeigt Tab. 1.7-7 – Hemmung der ChE durch Medikamente.

1.7.5.3 ChE bei Vergiftung mit Insektiziden

Organophosphate und Carbamate werden weltweit in der Landwirtschaft als Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von Insekten eingesetzt und deshalb auch als Pestizide bezeichnet. Die Vergiftung durch diese Substanzen ist ein Problem, insbesondere Landarbeiter und Kinder sind betroffen. Weltweit wird jährlich mit drei Millionen Vergiftungen und etwa 200 Tausend Todesfällen gerechnet /22/. Pestizide sind auch für den Menschen von hoher Toxizität und können zur beabsichtigten und unbeabsichtigten Vergiftung führen /23/.

Organophosphate: Es handelt sich um organische Phosphorsäureester, auch als Alkylphosphate bezeichnet, wie z.B. Ethylparathion, Methylparathion, Demeton-S-methylsulfoxid, Carbophention, Mevinphos, Chlorpyrifos, Dimethoat, Naled, EPBP, Phosalone. Die hemmende Wirkung der Organophosphate ist irreversibel und kann in vitro und in vivo unterschiedlich sein. So entsteht Malaoxon, die hochtoxische Form des Malathion erst nach Aufnahme in den Organismus durch Oxidation /24/.

Carbamate: Formetanat-HCl, Methomyl, Carbaryl. Die hemmende Wirkung der Carbamate ist reversibel. Sie bilden mit der Acetylcholinesterase ein Acetylcholinesterase-Carbamat Intermediat, das rasch der Hydrolyse unterliegt, somit steht das aktive Enzym relativ schnell wieder zur Verfügung.

Wirkungsmechanismus der Organophosphate und Carbamate: Organophosphate und Carbamate hemmen die Acetylcholinesterase in den Nervengeweben und Erythrozyten und die Butyrylcholinesterase im Plasma. Als Resultat der Hemmung kumuliert das Substrat Acetylcholin. Es werden Konzentrationen im Plasma von 20–30 μg/l gemessen. Die klinischen Symptome der Vergiftung mit Organophosphaten beruht auf einer Stimulation der Muscarin- und Nikotin-sensitiven Acetylcholin-Rezeptoren der Muskulatur und der Synapsen des Zentralnervensystems. Die Hemmung der ChE im Serum ist aus toxikologischer Sicht unbedeutend, das Absinken ihrer Aktivität bei einer Vergiftungen mit Organophosphat erlaubt aber Analogieschlüsse auf die verbliebene Aktivität der Acetylcholinesterase.

Die gängige Therapie der cholinergen Vergiftung besteht in der Gabe von:

• Atropin, der kompetitive Acetylcholin-Antagonist, beseitigt die Muskarinwirkung am Muskel.
• Nukleophilen Antidots wie Pralidoxim oder Obidoxim zur Regeneration der Acetylcholinesterase. Die Nikotin-sensitiven Wirkungen dieser Substanzen an den Ganglienzellen werden aufgehoben. Die Wirkung beruht auf einer Entfernung der Phosphatgruppe von der phosphorylierten AChE wodurch das Enzym wieder aktiviert wird.

Akute Intoxikation

Die Aufnahme der Pestizide erfolgt gastrointestinal, respiratorisch, okulär und über die Haut, am schnellsten aber durch Inhalation. Die Pestizide verteilen sich rasch im Organismus und kumulieren in Fettgewebe, Leber und Nieren. Die klinischen Symptome treten innerhalb von 12 h auf, wenn das Organophosphat nicht Fett löslich ist (Fenthion) oder keiner metabolischen Aktivierung unterliegt (Parathion). Bei Fett löslichen Phosphorsäureestern tritt die klinische Symptomatik später auf und die Elimination dauert Tage. Klinische Symptome der Organophosphat- und Carbamat-Vergiftung sind Miosis, Hypersalivation, Übelkeit, Erbrechen, verstärktes Muskelzittern und Schwitzen. Bei Kindern sind die sechs häufigsten Symptome Durchfall, Erbrechen, Miosis, Hypersekretion des Bronchialepithels, Schwitzen und Hypothermie /25/. Die klinischen Symptome treten auf, wenn nach Inkorporation des Insektizids die ChE auf ≤ 60 % des unteren Referenzbereichswerts absinkt.

Auf Grund des prozentualen Abfalls der ChE-Aktivität werden Organophosphat Intoxikationen eingeteilt in /26/:

• Leichte Form (ChE 60–40 %) klinisch im Vordergrund steht die oben genannte Symptomatik.
• Mittelschwere Form (ChE 40–20 %), zusätzlich zur oben genannten Symptomatik besteht ein Gefühl der Enge in der Brust und Muskelschmerzen.
• Schwere Form (ChE unter 20 %), klinisch im Vordergrund steht das Atemnotsyndrom.

Nach vollständiger Hemmung erreicht die ChE bei unbehandelten Fällen nach 30–40 Tagen wieder Werte im Referenzbereich. Das zeigte eine Studie /25/ an Kindern die bei Krankenhauseinweisung ChE-Werte von 10–30 % des unteren Referenzbereichswerts hatten.

Die akute Carbamat-Vergiftung ist weniger schwer als die mit Organophosphaten. Sie ist häufig selbstlimitierend, da durch spontane Lyse des Acetylcholinesterase-Carbamat Intermediates eine aktive AChE schnell wieder zur Verfügung steht.

Chronische Pestizidbelastung: Diese kann asymptomatisch sein oder es treten unspezifische Symptome wie Diarrhoe, Gewichtsverlust, Muskelschwäche und psychische Symptome auf.

Überwachung exponierter Personen

Die Kontrolle von Landarbeitern, die Pestizide versprühen, kann durch Bestimmung der ChE im Serum oder den Erythrozyten nach folgender Empfehlung durchgeführt werden /27/: Vor Beginn der Tätigkeit werden zwei Basalwerte im Abstand von 3, aber nicht länger als 14 Tagen bestimmt, wenn die Sprühtätigkeit mehr als 6 Tage pro Monat ausgeübt wird. Danach drei Bestimmungen in monatlichen Abständen. Ein relatives Risiko einer Pestizid Vergiftung besteht, wenn die ChE in den Bereich auf 60–80 % des individuellen Basalwerts vor Beginn der Sprühsaison abfällt. Personen, die auf Werte unter 60 % absinken, dürfen die Tätigkeit nicht mehr ausüben.

1.7.5.4 ChE-Verminderung durch atypische Varianten

Die Biosynthese der Cholinesterase wird durch 4 allele Gene am Locus E1 kontrolliert sowie durch seltene genetische Varianten. Siehe Tab. 1.7-8 – Biochemische Eigenschaften der Cholinesterase-Varianten.

Es kontrollieren /5/:

• Der normale (usual) Genotyp E₁^UE₁^U die Synthese einer normalen Cholinesterase im Serum, die mit Dibucain zu fast 80 % und mit Ro 2-0683 zu nahezu 100 % hemmbar ist.
• Der atypische Genotyp E₁^aE₁^a eine Variante der ChE, die eine erniedrigte ChE im Serum bewirkt, die zu weniger als 30 % durch Dibucain und fast nicht von Ro 2-0683 gehemmt wird.
• Der Fluorid-sensible Genotyp E₁^FE₁^F eine Variante, die nur wenig von Dibucain, aber stark durch Fluorid gehemmt wird.
• Der Silent Genotyp E₁^SE₁^S eine Variante der ChE, der die nötige Struktur fehlt Cholinester Bindungen zu hydrolysieren und die keine Enzymaktivität besitzt.

Die vier allelen Gene können neben den genannten wichtigen Genotypen weitere bilden, die dargestellt sind in Tab. 1.7-7 – Hemmung der Cholinesterase durch Medikamente.

Es gibt weiterhin noch das J-, K- und H-Gen. Diese drei Gene kodieren eine normale katalytische Aktivität der ChE, aber auf Grund einer gestörten Synthese oder Instabilität der ChE sind weniger Moleküle im Plasma. So ist die K-Variante mit einer Verminderung der ChE um 33 %, die J-Variante mit einer 66 % Reduktion und H-Variante mit einer 90 % Verminderung assoziiert.

Verminderte Aktivitäten der ChE haben eine klinische Bedeutung bei Patienten, die bei chirurgischen Eingriffen mit dem neuromuskulären Blocker Succinylcholin behandelt werden. Bei Gabe von 1–1,5 mg Succinylcholin/kg Körpergewicht und normaler ChE im Serum wird diese Dosis innerhalb von 15 min durch die AChE hydrolysiert. Ist diese stark vermindert oder liegt eine atypische ChE vor, besteht eine erhebliche relative Überdosierung von Succinylcholin und die Rückkehr zur normalen neuromuskulären Funktion ist verlängert. In einer Studie /28/, die 1.247 Patienten mit abnormaler Antwort auf Succinylcholin umfasste, konnte in 61,1 % der Fälle eine Erklärung gefunden werden. Von diesen Fällen waren 28,5 % genotypisch normal, 46,5 % hatten einen abnormalen Genotyp und bei 24,9 % konnte der Genotyp nicht bestimmt werden.

Die Zeiten bis zum Einsetzen der neuromuskulären Funktion dauerten:

• 15–30 min bei Patienten die heterozygot für ein abnormales Gen waren.
• 35–45 min bei Patienten mit Heterozygotie für zwei abnormale Gene.
• 90–180 min bei Patienten mit dem Genotyp E₁^aE₁^a.
• 20 min bei dem Genotyp E₁^aE₁^k.
• 90 min bei dem Genotyp E₁^aE₁^h (1 Patient).

Die Anwesenheit eines einzelnen genetisch varianten Allels führt nicht selbstverständlich zu einem verlängerten neuromuskulären Ausfall nach Gabe von Succinylcholin.

Das ist der Fall, wenn in heterozygoter Kombination /6/:

• Ein Gen vorliegt, das für eine niedrige Aktivität der ChE kodiert (Genotypen E₁^UE₁^h, E₁^UE₁^J, E₁^UE₁^k, E₁^UE₁^S).
• Medikamente eingenommen werden, die zu einer Verminderung der Aktivität von ChE führen oder wenn eine Lebererkrankung, z.B. Zirrhose, besteht.

Anstatt des Dibucain-, Fluorid- oder Ro 2-0683-Tests zur Feststellung einer Varianten ChE wird empfohlen, eine molekulargenetische DNA-Analyse zur exakten Identifikation der Mutation, die der atypischen ChE zu Grunde liegt, durchzuführen /29/.

1.7.5.5 Erhöhung der ChE-Aktivität

Erhöhungen der Aktivität der ChE sind diagnostisch nicht bedeutsam. Erkrankungen, die mit einer erhöhten Aktivität der ChE assoziiert sein können. Siehe Tab. 1.7-9 – Erkrankungen, die mit einer Erhöhung der ChE einhergehen können.

1.7.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Zur Beurteilung der Leberfunktion wird bei Bestimmung der ChE am häufigsten das Substrat Butyrylthiocholin verwendet. Zur Bestimmung der Dibucain- und Fluoridzahl wird der Benzoylcholin-Methode der Vorzug gegeben. Auch die Bestimmung der Konzentration von ChE mit immunologischen Methoden ist möglich.

Referenzbereich

In der Neugeborenperiode und den darauf folgenden Wochen hat die ChE nur etwa 50 % des Serumwerts Erwachsener. Sie steigt dann langsam an und erreicht im 6. Lj. Erwachsenenwerte, stabilisiert sich zur Pubertät und bleibt während des weiteren Lebens konstant. Beschriebene Altersabhängigkeiten bewegen sich in Änderungen, die klinisch nicht bedeutsam sind. Der interindividuelle Wert im Serum ist abhängig von Körpergewicht, Körpergröße und Geschlecht.

Der Serumwert postmenopausaler Frauen soll etwa 15 % höher sein als prämenopausal.

In der Schwangerschaft kommt es im ersten Trimenon zu einem Abfall der ChE um 20–30 %, der über die gesamte Schwangerschaft erhalten bleibt und wenige Wochen nach Entbindung wieder normalisiert.

Die Einnahme oraler Kontrazeptiva, die Ethinylestradiol enthalten, kann zur Senkung der ChE um 20 % führen.

Halbwertszeit

Sie beträgt 10 (3,4–12) Tage in der Zirkulation /30/. Veränderungen der Leberfunktion werden erst mit einer erheblichen Verzögerung angezeigt, deshalb ist die ChE kein Akutparameter.

Interferenzen

Hämolyse: Täuscht eine erhöhte ChE vor, wenn das Substrat Acetylthiocholin verwendet wird, da die AChE aus Erythrozyten mit gemessen wird. Bei Bestimmung der ChE unter Anwendung der vorgeschlagenen Standardmethode mit Butyrylthiocholin stört auf Grund des geringen Probenvolumens eine Hämolyse nicht /10/.

Lipämie: Stört nicht (geringes Probenvolumen) /10/.

Hyperbilirubinämie: Konzentrationen bis 10 mg/dl (170 μmol/l) stören nicht, bei höheren Konzentrationen muss die Probe verdünnt werden /10/.

Stabilität

Die ChE ist sehr stabil. Bei Raumtemperatur (20 °C) oder tiefgefroren im Serum bis 1 Jahr stabil /31/.

1.7.7 Pathophysiologie

Die ChE im Plasma ist ein tetrameres Glykoprotein, das aus vier identischen Untereinheiten besteht. Jede Untereinheit hat 574 Aminosäuren, 9 Zuckerketten und ein aktives Zentrum. Die vier Untereinheiten werden von Disulfidbrücken und hydrophoben, nicht kovalenten Kräften zusammengehalten /6/.

Vertebraten besitzen zwei Gene, die jeweils für die Synthese der Enzyme AChE und CHE verantwortlich sind. Sie differieren in ihrer Substratspezifität, letzteres Enzym hydrolysiert Acetylcholin und Butyrylthiolcholin, ersteres nur Acetylcholin. Die Ursache liegt in der Größe der Acyltasche im aktiven Zentrum der beiden Enzyme. Die beiden sperrigen Phenylalanin-Seitenketten des Butyrylthiocholins passen nicht in die Acyltasche der AChE.

Die AChE besitzt zwei wesentliche Merkmale, die sie befähigen, Acetylcholin rasch nach Freisetzung von den cholinergen Synapsen zu hydrolysieren:

• Eine hohe katalytische Turnoverrate.
• Zwei Haupttypen an Untereinheiten, AChE_H und AChE_T, die einen Einbau des Enzyms in die synaptischen Strukturen ermöglichen. Beide Haupttypen haben die gleiche katalytische Aktivität. Die Bildung der verschiedenen AChE-Formen erfolgt Gewebe spezifisch und ist davon abhängig, ob es sich um einen langsam oder schnell reagierenden Muskel handelt /32/.

Medikamente wie Ecothiopat, das zur Behandlung des Glaukoms eingesetzt wird und zytotoxische Medikamente wie Cyclophosphamid hemmen die AChE irreversibel durch Bindung an eine OH-Gruppe des Serins im aktiven Zentrum des Enzyms. Der Effekt dieser Substanzen hält während der ganzen Lebenszeit des Enzyms an, was mehrere Wochen sind, und wird erst aufgehoben durch die Synthese von neuem Enzym in der Leber.

Eine reversible Hemmung verursachen Medikamente, die über eine ionische oder Wasserstoffbrückenbildung an das aktive Zentrum binden. Es handelt sich hierbei um Substanzen, die ein quartärnäres Stickstoffatom besitzen wie z.B. Hexafluoronium.

Organophosphate und Carbamate sind eine weitere Gruppe von Inhibitoren der ChE. Sie werden auch als Anti-Cholinesterasen bezeichnet. Diese Substanzen finden als Pestizide Anwendung. Bei den Organophosphaten wirken nur solche als potente Inhibitoren der ChE, die eine P = O Bindung haben. Sie werden als direkte Inhibitoren bezeichnet. Organophosphate mit einer P = S Bindung, z.B. Malathion /23/, müssen erst metabolisch in P = O umgewandelt werden. Deshalb werden sie als indirekte Inhibitoren bezeichnet. Bei Vergiftung mit direkten Inhibitoren treten die klinischen Symptome rasch auf, bei Vergiftung mit den indirekten treten sie verzögert auf und dauern länger. Bei den klinischen Symptomen werden folgende Wirkungen der ChE Inhibitoren unterschieden /21/:

• Muscarin ähnliche, z.B. Übelkeit, Erbrechen, Schwitzen, Hypersalivation, Bronchokonstriktion.
• Nikotin-ähnliche wie z.B. Muskelfaszillation, Tachykardie.
• Zentralnervöse wie Kopfschmerzen, Benommenheit.

Gestört wird von den Inhibitoren der ChE die physiologische Funktion der AChE. Diese besteht in der Beendigung der Wirkung von Acetylcholin in der Übertragung von Nervenimpulsen von cholinergen Nerven auf die postsynaptische Seite des Erfolgsorgans. ChE Inhibitoren bewirken die pathologische Erhöhung von Acetylcholin an der motorischen Endplatte und an parasympathischen und präganglionären sympathischen Nervenenden. Es kommt deshalb auch im sympathischen Nervensystem zur übermäßigen Erregung durch die Freisetzung von Adrenalin und Noradrenalin. Da die ChE des Serums sich gegenüber Inhibitoren der ChE vergleichbar der AChE der cholinergen Nervenenden verhält, spiegelt die Hemmung der Aktivität des Enzyms im Serum das Ausmaß der Hemmung an den Synapsen wider.

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1.8 Creatinkinase (CK)

Lothar Thomas

Die CK ist ein dimeres Molekül und wird durch Gene synthetisiert, deren Genprodukte CK-M, CK-B und CK-Mi sind. Die CK-Mi ist nur in den Mitochondrien lokalisiert. Die Aktivität der CK im Serum besteht aus den Anteilen der zytoplasmatischen Isoenzyme CK-MM, CK-MB, CK-BB. Bei Gesunden besteht die Aktivität der CK überwiegend aus CK-MM, die CK-MB und CK-BB sind nur in Spuren vorhanden oder nicht nachweisbar. Ist die Aktivität der CK oder die eines Isoenzyms erhöht, ermöglicht das Isoenzym Muster Rückschlüsse auf die zu Grunde liegende Organschädigung.

1.8.1 Indikation

Als Zweitmarker, wenn Troponin nicht verfügbar ist, bei Patienten /1/:

• Mit Infarkt typischen klinischen und EKG-Zeichen (indizierte Untersuchungen: CK-MB Konzentration).
• Verlaufsbeurteilung des Myokardinfarkts.
• Myokarditis.
• Verdacht auf Skelettmuskelerkrankung, neurogene Myopathie oder Medikamenten bedingte Myopathie.
• Therapiekontrolle einzelner Tumorpatienten.

1.8.2 Bestimmungsmethode

IFCC Primary Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Creatine Kinase (CK) at 37 °C /2/

Prinzip: Die CK (EC 2.7.3.2) katalysiert die reversible Übertragung der Phosphatgruppe von Creatinphosphat auf Mg-ADP. Das entstehende Mg-ATP wird im kombinierten optischen Test mit Hexokinase (HK) (EC 2.7.1.1) als Hilfsenzym und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) (EC 1.1.1.49) als Indikatorenzym bestimmt. Messgröße ist die Zunahme von NADPH₂, die der Aktivität der CK proportional ist (Tab. 1.8-1 – Prinzip der CK-Bestimmung).

Bestimmung der CK-MB-Konzentration /3/

Die CK-MB wird mit einer Kombination von CK-B- und CK-M-spezifischen oder mit CK-MB spezifischen Antikörpern in Immunoassays bestimmt.

Prinzip: Bei den Assays werden nahezu ausschließlich CK-MB spezifische monoklonale Antikörper, teilweise in Kombination mit einem CK-M- oder CK-B spezifischen Antikörper, eingesetzt.

Die Immunoassays sind als Enzym-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Elektrochemilumineszenz Assays konfiguriert. Ergebnisse werden innerhalb 15–30 min erhalten.

1.8.3 Untersuchungsmaterial

• Serum oder Heparinplasma: 1 ml
• Antikoaguliertes Vollblut: 0,02–0,05 ml

1.8.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.8-2 – Referenzbereiche der CK.

1.8.5 Bewertung

CK bei Muskelschaden

Die CK im Serum des Gesunden entspricht überwiegend der Aktivität des Muskel spezifischen Isoenzyms CK-MM und dient daher als Leitenzym für die Erkennung von Schäden der Muskulatur. Trotzdem schließen innerhalb des Referenzbereichs liegende Aktivitäten eine Muskelerkrankung nicht aus und erhöhte Aktivitäten können physiologische Ursachen haben. Untersuchungen des Verlaufs und bei unklaren Bildern die Bestimmung der CK-Isoenzyme erleichtern die Interpretation, ob der Herz- oder der Skelettmuskel betroffen ist. Bei angeborenen Muskelerkrankungen beträgt die Aktivität der CK gewöhnlich über 1.000 U/l, bei der neuropathischen Myopathie liegen die Werte darunter.

CK beim Myokardinfarkt

Nach einer akuten Schädigung der Muskulatur, z.B. Eintritt eines Infarkts, steigt die CK im Blut an und erreicht im Mittel bei 50 % der Patienten nach 4–5 h pathologische Werte /9/. Im diagnostischen Zeitfenster von der Stunde 8–24 nach dem Myokardinfarkt sind die Werte regelmäßig erhöht, bevor sie dann mit großen interindividuellen Schwankungen in den Referenzbereich abfallen. Die maximale CK überschreitet beim Myokardinfarkt selten 7.500 U/l. Höhere Werte der CK machen eine gleichzeitige Erkrankung des Skelettmuskels wahrscheinlich. Ein Zweittrauma oder ein Re-Infarkt werden durch den Wiederanstieg von CK und CK-MB erkannt.

CK-MB-Konzentration beim Myokardinfarkt

Beim Myokardinfarkt zeigt die CK-MB ähnliche Verläufe wie die CK. Sie erreicht bei 50 % der Patienten nach 3–4 h pathologische Werte /9, 10/, fällt aber etwas früher wieder ab. Ein Myokardinfarkt ist enzymatisch auszuschließen, wenn während des diagnostischen Zeitfensters die CK-MB nicht ansteigt. Die Halbwertszeiten der Isoenzyme der CK zeigt Tab. 1.8-3 – Halbwertszeiten und Zeitpunkt der maximalen Aktivität in Stunden nach Infarkt.

Eine frühzeitige Rekanalisation (Erfolg spontan oder therapeutisch) wird durch einen schnellen Anstieg und frühen Gipfel der CK-MB, der innerhalb von 16 h erfolgt, erkannt (Tab. 1.8-2 – Referenzbereiche der CK). Werden Proben analysiert, die außerhalb des schmalen diagnostischen Zeitfensters entnommen wurden, so kann die CK-MB entweder noch oder schon wieder im Referenzbereich sein.

Ein Nachteil der Konzentrationsbestimmung der CK-MB in der Diagnostik des Myokardinfarktes ist, dass die CK-MB vereinzelt auch aus nicht kardialer Muskulatur stammen kann.

CK bei Myopathien

Myopathien sind Erkrankungen des Skelettmuskels. Sie können angeboren oder erworben sein und schon bei der Geburt oder erst im späteren Alter auftreten. Die klinischen Symptome sind Überempfindlichkeit, Muskelschmerz, Muskelschwäche, die CK ist normal oder erhöht /11/.

Unterschieden werden:

• Myalgie; es handelt sich um Muskelschmerzen und Muskelschwäche ohne messbare zelluläre Schädigung von Muskelgewebe. Es besteht keine Erhöhung der CK.
• Myositis; es liegen Beschwerden wie bei der Myopathie oder stärker vor, Muskelzellen sind geschädigt, und die CK ist 3–10 fach erhöht.
• Rhabdomyolyse; es besteht eine starke Muskel schädigende Wirkung, die CK ist mehr als 10 fach über den oberen Referenzbereichswert erhöht, oft liegt eine Einschränkung der Nierenfunktion vor (Creatinin erhöht), der Urin ist braun und Myoglobin nachweisbar.

Das Verhalten von CK und den Isoenzymen ist aufgeführt bei:

• Herzmuskelschäden in Tab. 1.8-4 – Aktivitäten von CK und CK-MB bei Herzmuskelschädigung.
• Akuter Schädigung der Skelettmuskulatur in der Tab. 1.8-5 – Aktivitäten von CK und CK-MB bei akuter Skelettmuskelschädigung.
• Chronischer Skelettmuskel Schädigung in Tab. 1.8-6 – CK-Aktivität bei chronischer Skelettmuskel Schädigung.
• Schädigung anderer Gewebe in Tab. 1.8-7 – CK-Aktivität bei Schädigungen anderer Gewebe.

1.8.6 Hinweise und Störungen

Bestimmung der CK-Aktivität

Der Zusatz von N-Acetylcystein zum Reaktionsgemisch reaktiviert die CK und schützt sie vor Oxidation. Dazu wird eine gewisse Zeit benötigt (Lag-phase Zeit). Das Reaktionsgemisch enthält auch AMP und Diadenosinpentaphosphat, wodurch die Interferenz durch Adenylatkinase (EC 2.7.4.3) aus Erythrozyten, Muskel, Leber und Thrombozyten unterdrückt wird. EDTA stabilisiert die CK und verhindert eine mögliche Inhibition durch Ca²⁺ der Probe. Kritische Größen der Bestimmung sind die Reaktivierungszeit, das Probenvolumenverhältnis und die Lag-phase Zeit /2, 5/. Eine Aktivierungszeit von 180 Sekunden reicht aus, um frische Proben exakt zu messen. Bei älteren Proben und manchen Qualitätskontrollmaterialien kann eine Aktivierungszeit von 300 Sekunden notwendig werden. Ein Substratstart der Reaktion wird empfohlen, ein Start mit Serum ist möglich /2, 5/.

CK-MB-Konzentration

Interferenzen: Neben typischen Störungen des Immunoassays, z.B. durch humane Anti-Maus-Antikörper oder hohe Biotin Dosen können Störungen durch CK-B bindende Autoantikörper auftreten /12/. Die Bestimmung wird nicht durch die Präsenz von Makro-CK gestört.

Referenzbereich

Die Ermittlung des Referenzbereichs für Erwachsene /2, 4, 5/ wurde an Klinikpatienten vorgenommen, was die niedrigeren Werte im Vergleich zu einem ambulanten Kollektiv erklärt. Die Referenzbereiche für Kinder wurden mit einem an die IFCC-Methode adaptierten Verfahren ermittelt /7/. Die stärksten Abweichungen dieser Methode betreffen die Thiolverbindungen des Reagenz. Deshalb sind die Werte für jüngere Kinder (höherer CK-B-Anteil) nicht uneingeschränkt auf die IFCC-Methode übertragbar.

Makro-CK

Die Prävalenz der Makro-CK an Erhöhungen der CK-Aktivität beträgt etwa 2 % /13/. Meist liegt eine Makro-CK Typ 1 vor, ein Komplex aus Immunglobulin und CK. Ein exakter Nachweis kann nur durch Verfahren erfolgen, mit denen das Molekulargewicht bestimmt wird, z.B. der Ausschluss Chromatographie oder der Elektrophorese im Gradientengel. Erste Hinweise liefert die Behandlung des Serums mit Polyäthylenglykol. Siehe auch Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

Stabilität

Serum und Kontrollmaterialien, die nicht innerhalb von 12 h bearbeitet werden, sollten gut verschlossen und dunkel gelagert werden. Dann ändert sich die Aktivität bei 4 °C während 3 Tagen und bei –20 °C während 4 Wochen nicht /14/.

1.8.7 Pathophysiologie

Die Enzyme CK und Adenylatkinase sind zur Synthese von ATP, der unmittelbaren Energiequelle aller Gewebe, von entscheidender Bedeutung.

Bei der Energieversorgung des Muskels ist die CK in zweierlei Weise beteiligt (Abb. 1.8-1 – Beteiligung von CK und Adenylatkinase an der Energiegewinnung im Muskel). In den Mitochondrien, dem Ort der Energieproduktion, katalysiert die mitochondriale CK die Synthese von Creatinphosphat (CrP) aus ATP. Das energiereiche CrP wird dann im CrP-Shuttle aus den Mitochondrien in das Zytoplasma transportiert, wo es an den Stellen des Energieverbrauchs (Kontraktion, Ionenkanäle der Membranen, Synthesen), wieder durch CK in ATP zurückverwandelt wird /15, 16/. Intrazellulär liegt die CK teils in freier Form, teils an entsprechende Zellstrukturen gebunden vor.

Aus humanen Geweben lassen sich drei zytoplasmatische CK-Isoenzyme als Dimere, die aus den Untereinheiten M (M, muscle) und B (B, brain) bestehen können, isolieren. Ihre Genorte liegen auf dem Chromosom 14 (B-Untereinheit) und auf dem langen Arm des Chromosoms 19 (M-Untereinheit) /17/. Die beiden mitochondrialen Isoenzyme der CK werden als S-MTCK (Muskelsarkomer-spezifisch) und U-MTCK (ubiquitär) bezeichnet. Zusätzlich wird die dimere Form noch uneinheitlich als CK-MiMi, mCK, CK-MT oder CKmito abgekürzt. Die Monomere der CK mit einem MG von 40 kD sind aus etwa 360 Aminosäuren aufgebaut und enthalten SH-Gruppen. Während die Hybridisierung zwischen den bereits als Monomeren aktiven M- und B-Untereinheiten zur CK-MB führt, gibt es keine Hybridisierungen mit der Mi-Untereinheit /18/.

Auf Grund ihrer Organverteilung wird die CK-MM als Muskeltyp, die CK-MB als Myokardtyp, die CK-BB als Gehirntyp und die CK-MiMi als Mitochondrientyp bezeichnet. Trotz dieser Bezeichnungen haben diese Isoenzyme keine zu hohen Organspezifitäten. CK-BB kommt in hoher Aktivität nur im Gehirn vor, in geringerer ist dieses Isoenzym ubiquitär vorhanden. Genauso findet sich die überwiegende Menge der CK-MB im Skelettmuskel, nur ihre höchste Konzentration ist im Myokard lokalisiert. Quantitative Angaben zur Organverteilung der CK-Isotypen sind sehr unterschiedlich /19/. Tab. 1.8-8 – Organverteilung der CK-Isoenzyme gibt die ungefähre Verteilung wieder.

Bei Organschädigung tritt die CK in das Blut über, so dass das Isoenzym-Muster des Bluts das des geschädigten Organs widerspiegelt. Diese Feststellung wird durch folgende Fakten relativiert:

• Die CK darf am Eintritt in das Blut nicht gehindert werden (Blut-Liquor-Schranke, Lymphwege).
• Ein Organ muss soviel CK freisetzen können, dass seine Schädigung zu einem messbaren Aktivitätsanstieg führt; ein Anstieg bleibt aus bei akuten Schädigungen von Gallenblase, Lunge, Leber, Prostata, nicht gravidem Uterus und der Venen.
• Ein Aktivitätsanstieg wird nicht erfasst, wenn die CK zu schnell inaktiviert oder aus der Zirkulation entfernt wird. Dies trifft für die Freisetzung der CK-BB bei einer akuten Schädigung meist zu.
• Chronische Muskelerkrankungen können die Isoenzym- Ausstattung der Muskelzelle ändern; neben der Muskel spezifischen M-Untereinheit wird dann zusätzlich, wie in der Fetalzeit, wieder die B-Untereinheit synthetisiert. Ein höherer Anteil an CK-MB und eventuell CK-BB ist die Folge.

Nach der Freisetzung der CK in das Blut unterliegt das Enzym post synthetischen Modifikationen, die zu den Isoformen der CK führen. Isoformen mit einem normalen MG von etwa 80 kD entstehen, wenn Carboxypeptidase das C-terminale Lysin beider M-Ketten sukzessive entfernt.

Isoformen mit erhöhtem MG über 200 kD entstehen, wenn CK durch spezifische Immunglobuline gebunden wird (Makro-CK Typ 1) oder wenn die CK-mito in der bevorzugten Form des Oligomers auftritt (Makro-CK Typ 2).

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1.9 Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT)

Lothar Thomas

Die GGT ist eine Peptidase, die den Transfer von Aminosäuren von einem Peptid zum anderen durchführt und somit als Aminosäuren Transferase wirkt. Die im Blut messbare GGT entstammt primär dem hepatobiliären System und das Enzym ist im Serum bei vielen Erkrankungen der Leber und der Gallenwege erhöht. GGT-Erhöhungen sind primär eine Kenngröße für hepatobiliäre Erkrankungen und den chronischen Alkoholkonsum. Die GGT ist aber ebenfalls ein Prädiktor vaskulärer Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall. Auch ist die GGT mit dem metabolischen Syndrom, dem Diabetes mellitus Typ 2, Bluthochdruck und dem Langzeitüberleben assoziiert.

1.9.1 Indikation

• Screening auf Erkrankungen der Leber und der Gallenwege im Muster mit der ALT und der CHE.
• Differentialdiagnose und Verlaufsbeurteilung von Erkrankungen der Leber und der Gallenwege.
• Kontrolle des chronischen Alkoholismus in Kombination mit anderen Laboruntersuchungen.
• Risikomarker für eine Vielzahl chronischer Erkrankungen.

1.9.2 Bestimmungsmethode

IFCC Primary Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Activity Concentration of γ-Glutamyltransferase at 37 °C /1/

Prinzip: Die GGT (EC 2.3.2.2) katalysiert die Übertragung des Glutamylrests von γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid auf Glycylglycin unter Freisetzung von 5-Amino-2-nitrobenzoat. Die Konzentrationszunahme dieser Substanz, gemessen als Absorptionsänderung bei 405 nm, ist proportional der Enzymaktivität im Ansatz. Siehe Tab. 1.9-1 – Prinzip der GGT-Bestimmung.

1.9.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma (Heparin, EDTA): 1 ml

1.9.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.9-2 – Referenzbereiche der GGT.

1.9.5 Bewertung

Die GGT ist ein Leber- und Gallengang-spezifisches Enzym. Obwohl andere Organe ebenfalls GGT enthalten, sind stärkere GGT-Erhöhungen, die nicht Leber- bzw. Gallenwegs-bedingt sind, selten.

Die GGT ist aber nicht nur ein Biomarker für hepatobiliäre Erkrankungen und den exzessiven Alkoholkonsum, sondern auch ein metabolisch-toxischer Marker und ein Marker und ein Indikator für die Präsenz chronischer Erkrankungen bei asymptomatischen Patienten.

Das Verhalten der GGT bei Erkrankungen ist angegeben in:

• Tab. 1.9-4 – Verhalten der GGT bei Erkrankungen der Leber und der Gallenwege
• Tab. 1.9-5– Erhöhungen der GGT bei unterschiedlichen Ursachen.

1.9.5.0.1 GGT-Erhöhungen /4/

Arzneimittel und Alkohol: Bei beiden Ursachen liegt eine Induktion der GGT-Synthese vor. Beachtet werden muss, dass die interindividuelle Variation der Enzyminduktion groß ist.

Arzneimittel, insbesondere Antikonvulsiva (Phenobarbital, Phenytoin), Psychopharmaka, Steroidhormonen, Antikoagulantien, Streptomycin, Xenobiotika und Karzinogene (Nitrosamine) bewirken einen 1,5–3 fachen Anstieg über den oberen Referenzbereichswert. Erhöhungen durch andere Pharmaka wie Streptokinase und orale Kontrazeptiva sind geringer.

Alkohol kann schon in Dosen von 0,75 g/kg KG innerhalb eines Tages einen Anstieg der GGT bewirken, nach 2,5 Tagen beträgt die GGT etwa 25 % des Ausgangswerts und nach 4 Tagen wird dieser wieder erreicht. Jedoch spielen sich diese Erhöhungen vorwiegend innerhalb des Referenzbereichs ab.

Cholestasesyndrom: Bei Cholestasen liegen strukturelle Veränderungen der Zellmembran vor, die zur Ablösung der oberflächlich gelegenen GGT führen. Zusätzlich wird durch Induktion vermehrt gebildete GGT nicht mehr an die Zellmembran angeheftet und gelangt somit gleich in die Zirkulation. Cholestasen können bei akuter und chronischer Hepatitis und chronischen Lebererkrankungen anderer Ursachen auftreten. Während bei den Cholestasen der GGT-Anstieg das 5 fache des oberen Referenzbereichswerts oft überschreitet, werden bei den akuten und chronischen Hepatitiden viraler Genese GGT-Anstiege um nicht mehr als das 3–5 fache des oberen Referenzbereichswerts gefunden.

Prädiktor für ein Erkrankungsrisiko: Die GGT zeigt eine Assoziation zu Gefäß- und Stoffwechselerkrankungen sowie allgemein zur Morbidität und Mortalität. Diese Assoziation ist unabhängig von einer etwa gleichzeitig vorliegenden Erkrankung der Leber oder einem Alkoholabusus.

Es besteht eine positive Assoziation der GGT /5/:

• Zu kardiovaskulären Risikofaktoren wie Rauchen.
• Zu Merkmalen des metabolischen Syndroms wie Übergewicht, Bluthochdruck, Störungen des Fettstoffwechsels und Diabetes Typ 2.

Die Assoziationen machen die GGT zu einem Prädiktor für kardiovaskuläre Erkrankungen und erhöhte Mortalität. Auch ist der GGT Wert mit der chronischen Nierenerkrankung assoziiert, unabhängig vom Alkoholkonsum. Die GGT Werte sind moderat erhöht oder liegen im oberen Drittel des Referenzbereichs. So waren in einer Studie /6/ GGT Werte über 24 U/l mit einer erhöhten Mortalität für Herzinfarkt verknüpft. In einer anderen Studie /7/ hatten Personen mit einer GGT von 36–50 U/l 3 fach häufiger einen Diabetes mellitus Typ 2 und 4 fach häufiger ein metabolisches Syndrom.

1.9.5.02 Diagnostische Sensitivität und Spezifität für Lebererkrankungen

Da eine Erhöhung der GGT durch eine Vielzahl chronischer Erkrankungen als auch durch eine primäre Schädigung der Leber ausgelöst wird, hat sie bei guter Organspezifität und hoher diagnostischer Sensitivität für Erkrankungen von Leber und Gallenwegen nur eine geringe diagnostische Spezifität. So beträgt die diagnostische Sensitivität für Erkrankungen von Leber und Gallenwegen 95 % bei einer diagnostische Spezifität von 96 % gegenüber Gesunden und 74 % gegenüber nicht hepatobiliär Erkrankten. Die GGT ist mit 14 % (6–20 %) das am häufigsten allein erhöhte Enzym bei Erkrankungen von Leber und Gallenwegen, noch höher ist der Anteil der Personen (22–30 %) mit isolierter GGT-Erhöhung, bei denen klinisch primär keine Erkrankung der Leber oder Gallenwege vorliegt /8/. Allein erhöht hat die GGT nur eine geringe Spezifität für Lebererkrankungen. Diese sowie eine differentialdiagnostische Signifikanz gewinnt sie erst, wenn andere Enzyme wie die ALT und AP ebenfalls bestimmt werden.

Erhöhte Aminotransferasen bei normaler GGT werden bei chronischen Lebererkrankungen gefunden.

1.9.5.0.3 Isolierte Erhöhung der GGT

Ursachen der isolierten Erhöhung können sein /8/:

• Therapie-bedingte Induktion der GGT-Synthese, z.B. bei der Medikation von Antikonvulsiva. Isolierte GGT-Erhöhungen über das 3 fache des oberen Referenzbereichswerts sind nicht mehr Therapie-bedingt.
• Fettleber, subklinische Behinderung des Gallenflusses, Raum fordernde Leberprozesse, chronische Leberstauung bei Herzerkrankung.
• Alkoholische Genese, Adipositas, Diabetes mellitus.

1.9.5.0.4 Differentialdiagnostische Wertigkeit der GGT

Die GGT ist bedeutsam bei folgenden Fragestellungen:

• Abgrenzung der cholestatischen von der parenchymatösen Lebererkrankung.
• Differenzierung der alkoholischen Genese von der entzündlichen Lebererkrankung.
• Hinweis auf eine hepatische Steatose (Fettleber).

Beurteilungskriterien sind:

• Verhalten der GGT im Muster mit den Aminotransferasen, bewertet wird die Höhe des Quotienten GGT/ALT bzw. GGT/AST. Bei Patienten mit Ikterus ist er ein Maßstab für das Ausmaß der Cholestase in Bezug auf den Zellmembranschaden /9/.
• Höhe der GGT-Aktivität.
• Verhalten der GGT zum Cholestaseenzym AP.

1.9.5.1 Abgrenzung der Cholestase von entzündlichen Lebererkrankungen /9/

Bei Vorliegen eines Ikterus und der Fragestellung hepatitische oder cholestatische Ursache kann aus der Höhe der ALT-Aktivität und dem Quotienten GGT/ALT eine grobe Differenzierung erfolgen. So wird bei keinem Patienten mit Verschlussikterus ein ALT-Anstieg über 25 fach des oberen Referenzbereichswerts gefunden und der Wert des Quotienten von GGT/ALT liegt immer über 1, oft sogar über 6. Siehe Tab. 1.9-3 – Quotient GGT/ALT; Höhe und prozentuale Häufigkeit bei Leber- und Gallenwegserkrankungen /9/.

Ein weiteres Kriterium für ein cholestatisches Syndrom, ist ein stärkerer relativer Anstieg der GGT im Vergleich zur AP. Bei intrahepatischer Cholestase können neben der GGT und AP die Aminotransferasen in etwa parallel erhöht sein, so dass der Quotient GGT/ALT nur knapp größer 1 ist.

Die Höhe der GGT hat bei intrahepatischer Cholestase eine gewisse Aussagekraft. So haben /9/:

• Metastasenleber, Cholangitis und primäre biliäre Zirrhose zu über 98 % GGT-Werte über 3 fach des oberen Referenzbereichswerts.
• Toxische Leberschäden zu einem gleichen Anteil darunter oder darüber.
• Die chronische Hepatitis zu 85 % und die alkoholische Fettleber zu 99 % GGT-Werte unter 3 fach des oberen Referenzbereichswerts.

Ist bei Vorliegen eines Ikterus die GGT normal und sind weitere Leberenzyme und die LDH normal, muss an eine Stoffwechselstörung des Bilirubins gedacht werden.

In der pädiatrischen Praxis hat die GGT erhebliche Vorteile gegenüber der AP zur Erkennung eines cholestatischen Syndroms. Bei Kindern ist die AP schwer zu interpretieren auf Grund Alters-bedingter Variation oder eines eventuellen Vitamin D-Mangels /10/.

1.9.5.2 Alkoholverbrauch der Bevölkerung

Die Wirkung von Alkohol auf die Gesundheit der Bevölkerung hat positive und negative Wirkungen. So kann moderates Trinken von Alkohol positive physische, mentale und soziale Effekte haben, während klinisch signifikantes Trinken zu einer Schädigung von Organen, insbesondere der Leber, führt. Häufig ist klinisch primär die Leber betroffen und es werden verschiedene alkoholische Lebererkrankungen unterschieden.

• Das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism der USA definiert den klinisch signifikanten Alkoholgenuss als den Verbrauch von mehr als 14 Standard-Drinks bei Männern und mehr als 7 bei Frauen. Ein Standard-Drink entspricht 14 g Alkohol. Die European Association for the Study of the Liver und die Koreanische Gesellschaft for the Study of the Liver definieren einen wöchentlichen Verbrauch von 210 g Alkohol bei Männern und 140 g bei Frauen als klinisch signifikantes Trinken.
• Moderates Trinken (safe consumption). Das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism der USA, die European Association for the Study of the Liver und die Koreanische Gesellschaft for the Study of the Liver publizierten keine Alkoholwerte für moderates Trinken. Eine Studie /12/ zeigte, dass mehr als 11,5 ± 3,3 Drinks von 80 g Alkohol, entsprechend 92 ± 26,4 g Alkohol/Woche signifikant das Risiko der Ausbildung einer Lebererkrankung erhöhte.

Siehe auch:

• Tab. 1.2-3 – Biomarker bei Lebererkrankungen
• Tab. 1.9-6 – Definition eines Standard-Drinks
• Beitrag 18.6 – Alkohol-Biomarker.

1.9.5.2.1 GGT als Marker des Alkoholismus

GGT-Werte über dem oberen Referenzbereichswert werden bei etwa 75 % der Alkoholabhängigen gemessen /11/. Jedoch besteht keine Korrelation zwischen der über einen Zeitraum aufgenommenen Gesamtmenge, der täglichen Trinkmenge oder der Dauer der Alkoholzufuhr. Personen, die täglich große Mengen Alkohol trinken, aber nicht abhängig sind, zeigen nur zu 20–50 % GGT-Erhöhungen. Die GGT ist ein Marker des chronischen Trinkens größerer Mengen Alkohol und ist nicht erhöht bei Gelegenheitstrinkern nach einem Saufabend, es sei denn, sie haben eine Lebererkrankung /11/.

Der Genuss von täglich über 40 g Alkohol bei Gewohnheitstrinkern und von mindestens 60 g täglich über mindestens 5 Wochen bei Nicht-Gewohnheitstrinkern ist erforderlich, bevor es zum Anstieg der GGT in den pathologischen Bereich kommt /13/. Zur Diagnostik des chronischen Alkoholismus hat die GGT eine diagnostische Sensitivität von 55–100 % bei einer Spezifität von 50–72 % /14/. Selten ist die GGT bei Personen unterhalb des Alters von 30 Jahren Alkohol-bedingt erhöht. Bei Frauen ist sie weniger sensitiv als bei Männern /15/.

Die GGT ist zur Kontrolle der Alkoholabstinenz geeignet. In Abhängigkeit von einer schon bestehenden Lebererkrankung sinkt die GGT mit einer Halbwertszeit von 14–26 Tagen und erreicht nach einer Alkoholabstinenz von 4–5 Wochen den Referenzbereich. Ein guter Marker zur Kontrolle des Alkoholentzugs ist die GLDH. Siehe Beitrag 1.10.5 – Indikator der Alkoholabhängigkeit.

1.9.6 Hinweise und Störungen

Blutentnahme

In Citrat-, Oxalat- oder Fluorid-haltigem Blut ist die GGT niedriger als im Serum.

Bestimmungsmethode

Im Heparinplasma wird mit der IFCC-Methode (Substrat γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid) eine zu niedrige GGT gemessen /45/.

Referenzbereich

Die oberen Referenzbereichswerte Erwachsener sind zu hoch, da sie durch normalen Alkoholkonsum verursacht sind. Mit zunehmendem Alter kommt es, wahrscheinlich Alkohol bedingt, zu einem interindividuellen, aber nicht generell intraindividuellen Anstieg der GGT /48/.

Hämolyse

Führt ab Konzentration des freien Hb von 2 g/l zu erniedrigten Werten /46/.

Halbwertszeit

Ist 7–10 Tage und bei Alkoholikern bis zu 28 Tage/8/.

Makroenzyme

GGT-Makroenzyme treten nur bei hepatobiliären Erkrankungen auf, haben aber diagnostisch und differentialdiagnostisch keine Bedeutung.

Siehe weiterführend Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

Kontrazeptiva

Erhöhungen der GGT treten bei oralen Kontrazeptiva die Norgestrel oder Levonorgestrel als Progestagen enthalten auf /47/.

Stabilität im Serum

1 Woche bei Raumtemperatur (20 °C) /49/.

1.9.7 Pathophysiologie

Die GGT ist ein heterodimeres Protein aus jeweils einer singulären Polypeptidkette. Es ist auf der Zytoplasmamembran vieler Körperzellen lokalisiert, das aktive Zentrum des Enzyms ist nach außen gerichtet. Besonders reich an GGT sind die luminalen Oberflächen von Zellen mit sekretorischer oder absorptiver Funktion, aber auch basolaterale Oberflächen renaler Tubuluszellen enthalten GGT.

Die GGT ist das einzige Enzym, das Glutathion (GSH) und GSH Konjugate in nennenswerten Mengen spaltet. So spaltet es im γ-Glutamatzyklus intrazellulär gebildetes GSH (γ-Glutamylcysteinylglycin), das nach extrazellulär auf die luminale Seite der Zellmembran gelangt, in Cysteinylglycin und den γ-Glutamylrest. Der Transport von GSH in den Extrazellulärraum, die Spaltung in seine Komponenten durch die GGT und deren Resynthese zu GSH wird als γ-Glutamatzyklus bezeichnet (Abb. 1.9-1 – GGT und der Glutamatzyklus). Auf diesem Wege begünstigt die GGT die Versorgung der Gewebe mit GSH, dem wichtigsten Nicht-Protein-Antioxidanz. Der Grund, warum große Mengen an GSH von den Hepatozyten in die Galle, von den proximalen Tubuluszellen in den Urin, von den Typ II-Pneumozyten in die Alveolen und von den Microvilli des Bürstensaums in den Darm sezerniert werden, ist der Schutz von Zellmembranen vor oxidativer Zerstörung. Außerdem ist GSH das Reservoir der relativ toxischen Aminosäure Cystein und deren Transportform im Organismus, die Konzentration von Cystein wird somit niedrig gehalten /50/.

Die GGT spielt ebenfalls eine wichtige Rolle /50/:

• Im Metabolismus von Mediatoren der Entzündung, z.B. von Leukotrienen (LT). So wird das stark pro-inflammatorische und vasokonstriktorische LTC₄ durch Konjugation von GSH mit LTA₄ gebildet.
• In der Metabolisierung von Karzinogen und toxischen Xenobiotika.

Die Degradation von GSH spielt aber unter bestimmten Bedingungen eine Rolle als Prooxidanz. So wird angenommen, dass die Oxidation von Low density lipoprotein (LDL) durch die GSG/GGT abhängige Reduktion von Eisen ein Mechanismus in der Ausbildung der Atherosklerose ist. Die GGT ist in Schaumzellen von atherosklerotischen Läsionen der Gefäßintima nachweisbar. Dort wird von der GGT Cysteinylglycin gebildet. Dieses reduziert Fe (III) und fördert somit die Fe (II)-katalysierte Oxidation von LDL. Durch die vermehrte Synthese von oxidiertem LDL wird die Progression der Atherosklerose begünstigt. Die GGT der atherosklerotisches Plaques soll aus dem Plasma oder aus Makrophagen stammen, deren GGT-Synthese hoch reguliert wurde /51/.

Die Serum-GGT entstammt der Leber und liegt in heterogener Form vor. Der größte Teil ist an Lipoproteine gebunden, insbesondere an HDL, aber auch an LDL. Ein kleinerer Teil ist wasserlöslich, hat ein MG von 84 kD und gleicht der GGT, die durch Proteasen von der Leberzellmembran freigesetzt wird /52/.

Die HDL gebundene GGT dominiert bei nicht ikterischen Lebererkrankungen. Die an Lipoproteine niedriger Dichte gebundene GGT ist erhöht bei Cholestase und die wasserlösliche Form bei den verschiedensten Leberleiden. Letztere überschreitet nie einen Anteil von 20 % an der Gesamtaktivität. Es wird angenommen, dass die an HDL und LDL gebundene GGT auf Grund einer Solubilisierung von Leberzellmembranen durch Galle freigesetzt wird oder als Teil eines Membranfragments nach Zellruptur. Die wasserlösliche Form soll direkt durch Proteasen von der Zellmembran freigesetzt werden. Die Proteasen spalten den hydrophilen, enzymatisch aktiven Teil von der hydrophoben, Membran gebundenen Domäne des Enzyms /53/.

Die Klärung der GGT aus dem Plasma erfolgt überwiegend durch die Leber, die Ausscheidung über die Galle. Die Aktivität ist dort etwa 10 fach höher als im Plasma. Ein kleiner Teil wird von den Nieren katabolisiert, ein Teil mit dem Harn ausgeschieden.

In der fetalen Leber ist die GGT gleichmäßig in den Lobuli verteilt, sie kommt dort im Hepatozyten gelöst und an die Zellmembran gebunden vor. In der Leber des Erwachsenen ist die GGT in der Peripherie der Lobuli gelegen und nur geringe Aktivitäten sind im Hepatozyten gelöst. Der Hauptanteil liegt auf der kanalikulären und sinusoidalen Membran des Hepatozyten sowie der Epithelmembran größerer Gallengänge /54/.

Die Synthese der GGT wird in der Leber durch Cholestase, Alkohol und Pharmaka in therapeutischer Dosierung, z.B. Phenytoin, induziert. Es kommt zu einer Vermehrung der Membran gebundenen GGT. Vorwiegend periportal breitet sich das Enzym von den Kanalikularmembranen auf die weiteren, dem Dissé-Raum zugewandten Anteile der Zellmembran aus.

Die nach Enzyminduktion im Serum erhöht messbare GGT ist von Art und Ausmaß der Noxe abhängig. Bei Anstiegen über 2 fach des oberen Referenzbereichswerts, oder wenn eine Erhöhung mit der Zunahme anderer Leberenzyme gekoppelt ist, muss immer eine Schädigung des Parenchyms in Erwägung gezogen werden.

Der Anstieg der GGT bei Störungen der Galle Ausscheidung kann sowohl auf einer Solubilisierung der GGT durch die Gallensäuren beruhen, als auch auf einer Zunahme der GGT-Bildung des Hepatozyten. Letzteres soll insbesondere die Ursache sein für den GGT-Anstieg in Hepatomzellen, in Zellen, die durch einen Lebertumor komprimiert sind und in regenerierenden Arealen der zirrhotischen Leber /55/. Zur molekularen Pathogenese der Cholestase siehe Tab. 5.2-3 – Extrahepatische Cholestase.

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1.10 Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)

Lothar Thomas

Die GLDH ist ein Leitenzym der Mitochondrien und in allen Geweben vorhanden. Die Aktivität ist in der Leber 10 fach höher als in anderen Geweben, deshalb sind erhöhte Aktivitäten im Serum ausschließlich Leber bedingt. Die GLDH spielt beim Menschen eine überwiegend katabole Rolle, in dem sie über die Freisetzung von Ammoniak aus Glutamat die Entfernung von Stickstoff aus dem Organismus katalysiert. Die Erhöhung von GLDH ist eine Kenngröße für Lebererkrankungen mit Zellnekrose.

1.10.1 Indikation

• Beurteilung von Schwere (Nekrose) und Ausmaß einer akuten Leberparenchym-Schädigung, insbesonders der akuten Stauungsleber.
• Differentialdiagnose der Lebererkrankungen.
• Marker des Alkoholentzugs.

1.10.2 Bestimmungsmethode

Proposal of Standard Method for the Determination of Enzyme Catalytic Concentration of Glutamate Dehydrogenase at 37 °C. German Society for Clinical Chemistry /1/

Prinzip: Die GLDH (EC 1.4.1.3) katalysiert die NADH abhängige Übertragung von Ammoniak auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und NAD. Messgröße ist NADH, dessen Absorptionsabnahme pro Zeiteinheit photometrisch registriert wird. Die Absorptionsänderung, gemessen bei 334, 340 oder 366 nm, verhält sich proportional zur GLDH-Aktivität.

Siehe Tab. 1.10-1 – Prinzip der GLDH Bestimmung.

1.10.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma (Heparin, EDTA, Oxalat, Citrat): 1 ml

1.10.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.10-2 – Referenzbereiche der GLDH.

1.10.5 Bewertung

Die GLDH ist ein Leber-spezifisches Enzym. Als Suchtest auf Erkrankungen der Leber und Gallenwege ist sie jedoch ungeeignet, da die diagnostische Sensitivität nur 47 % beträgt /2/.

Der praktische Wert der GLDH Bestimmung liegt in der Differentialdiagnostik von Lebererkrankungen. Denn die Erhöhung der GLDH im Serum ist der Indikator einer schweren Zellschädigung des Parenchyms der Leber und die Aktivität in Relation zu den leichter freigesetzten zytosolischen Aminotransferasen ein Maßstab für die Schwere des akuten Leberschadens.

Im Vergleich zur ALT, die nur im Zytoplasma vorkommt und der AST, die im Zytoplasma und den Mitochondrien lokalisiert ist, wird die GLDH:

• Kaum freigesetzt bei generalisierten entzündlichen Erkrankungen der Leber, z.B. der Virushepatitis.
• Vermehrt freigesetzt bei Lebererkrankungen, bei denen die Nekrose des Hepatozyten um die Zentralvene des Leberläppchens das vorherrschende Ereignis ist, wie bei der akuten Stauungsleber, der hypoxischen Hepatopathie oder der toxischen Leberschädigung, z.B. durch Alkohol.

Ein differentialdiagnostisches Kriterium ist der Quotient (ALT + AST)/GLDH. Er ist nützlich in den in Tab. 1.10-3 – Differentialdiagnostischer Wert des Quotienten (ALT + AST)/GLDH aufgeführten Situationen.

Differentialdiagnose des Ikterus

Die GLDH hat eine Bedeutung in der Differentialdiagnose des Ikterus, insbesondere beim akuten Abdomen, bei dem die Leber, in Form einer Cholecystitis oder eines akuten Verschlusses der Gallenwege, beteiligt sein kann. Je niedriger der Quotient (ALT + AST)/GLDH, desto wahrscheinlicher ist eine intra- oder extrahepatische Cholestase, je höher, umso mehr ist eine akute Hepatitis zu vermuten. So ist ein extrahepatischer Verschluss des Gallengangs ausgeschlossen bei:

• Einer Erhöhung der ALT über 25 fach des oberen Referenzbereichswerts.
• Einem Quotienten (ALT + AST)/GLDH über 50.
• Einer AP im Referenzbereich.
• Siehe Abb. 1.10-1 – Differentialdiagnose stark erhöhter ALT-Aktivitäten vermittels der GLDH.

Bei einem Quotienten unter 50, insbesondere aber unter 20, bleibt die Differentialdiagnose offen.

Differentialdiagnostik schwerer Leberschäden /3, 4/

Die GLDH ist hilfreich in der Abgrenzung toxischer von hypoxischen Leberschäden und der schweren Verlaufsform der akuten Hepatitis. So hat bei der akuten Durchblutungsstörung der Leber die GLDH vergleichbar hohe Enzymaktivitäten wie die Aminotransferasen.

Bei der akuten endogenen oder exogenen Intoxikation sind die Gipfelwerte der GLDH nur etwa halb so hoch wie die der Amiontransferasen und bei der schweren Verlaufsformen der akuten Virushepatitis geringer als 5 %. Dies ist auch der Fall bei der nekrotisierenden akuten Virushepatitis, die zum akuten Leberversagen führen kann. Nach einer Studie /4/ sind die häufigsten Ursachen der GLDH über 25 fach des oberen Referenzbereichswerts akutes Rechtsherzversagen, die akute Stauungsleber, protrahiert septisch-toxisches Kreislaufversagen und schwere respiratorische Insuffizienz. Die höchste durchschnittliche Aktivität wurde bei Patienten mit Cor pulmonale nach Lungenembolie gefunden. Die Abgrenzung der toxischen und hypoxischen Genese von der hepatitischen ist möglich, da toxische Substanzen, Hypoxie und die akute Stauung die Zentralregion des Leberläppchens schädigen und die GLDH bevorzugt perivenös lokalisiert ist.

Die Differentialdiagnostik der erhöhten GLDH ist aufgezeigt in Tab. 1.10-4 – Verhalten der GLDH im Serum bei Erkrankungen der Leber und Gallenwege.

Indikator der Alkoholabhängigkeit

Alkohol-abhängige Personen haben deutliche eine höhere GLDH als Nicht-Alkoholabhängige. So hatten in einer Studie /5/ gesunde Frauen und Männer jeweils Werte von 0,3 U/l (20 μkatal/l) und 0,6 U/l (40 μkatal/l) im Vergleich zu Alkoholikern mit jeweils 4,9 U/l (296 μkatal/l) und 7,3 U/l (439 μkatal/l). Zur Kontrolle, ob eine Abstinenz bei der Alkoholentzugs-Behandlung besteht, ist die GLDH besser geeignet als andere Parameter. Die GLDH fällt in den ersten 7 Tagen der Abstinenz schneller ab als die AST und GGT, und auch nach 24 h ohne Alkoholkonsum ist schon ein deutlicher Abfall messbar.

1.10.6 Hinweise und Störungen

Bestimmungsmethode

Da die Absorptionsänderung pro Minute für 1 U nur wenige Hundertstel Extinktionseinheiten beträgt, sollten isolierte oder klinisch unklare, leichte Erhöhungen der GLDH kontrolliert werden. Die für 37 °C optimierte Methode ist robuster als die bisherige für 25 °C. Sie kann ohne Vorinkubation mit längerer Zeit linearer Reaktion gemessen werden. Leerwerte entfallen und ein unkontrollierter Verbrauch von NADH wird vermieden /1/.

Hemmung

In Gegenwart von Natriumfluorid werden erniedrigte Werte gemessen.

Stabilität

Bei Raumtemperatur (20 °C) in 24 h Abnahme um 10 %, bei 4 °C innerhalb von 3 Tagen Abnahme von etwa 5 %.

Halbwertszeit

14–18 h.

1.10.7 Pathophysiologie

In Pflanzen und Mikroorganismen wird der vorwiegend nach Aufnahme aus N₂, NO₃^– oder NO₂^– gewonnene oder direkt aufgenommene Ammoniak vorwiegend durch reduktive Aminierung von 2-Oxoglutarat in L-Glutamat eingeschleust. Die GLDH, ein Schlüsselenzym des Stoffwechsels der Aminosäuren, katalysiert diese Reaktion. Koenzyme sind NADPH und NADH. Beim Menschen spielt die GLDH bevorzugt eine katabole Rolle, indem sie über die Freisetzung von NH₃ aus Glutamat die Ausschleusung von Stickstoff, der nicht für die Neusynthese von Aminosäuren benötigt wird, aus dem Organismus katalysiert. Reduziertes NAD und NADP werden durch die Atmungskette regeneriert. Oxalacetat, das als Akzeptor dient, wird katalysiert durch die AST, zu Aspartat transaminiert, dessen Stickstoff in die Harnstoffsynthese eingeschleust wird /6/.

Die GLDH ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Die spezifische Aktivität ist in der Leber etwa 10 fach höher als in Niere, Gehirn und Lunge und etwa 80 fach höher als im Skelettmuskel. In den Leberläppchen ist die GLDH in der zentrilobulären Zone etwa doppelt so hoch wie in der periportalen. Deshalb führen toxische Schädigungen durch Alkohol oder akute Durchblutungsstörung in Relation zur akuten Hepatitis zu einem starken Anstieg der GLDH im Vergleich zu den Aminotransferasen. Aktivitätsanstiege im Plasma entstammen ausschließlich der Leber.

Das Molekulargewicht der GLDH im Serum beträgt 336 kD. Sie besteht aus sechs Untereinheiten. Es werden jedoch auch Polymere mit einer molaren Masse bis 1.000 kD bei Patienten mit Leberschäden gefunden.

Die Bedeutung der GLDH in der Differentialdiagnostik der Lebererkrankungen beruht darauf, dass sie in der zentrilobulären Zone des Leberläppchens in 1,8 fach höherer Konzentration vorhanden ist als peripher /7/. Diese Zone befindet sich am Ende des sinusoidalen Versorgungswegs, ist deshalb am stärksten durch Hypoxie gefährdet und erfährt zuerst eine Zellschädigung bei Durchblutungsstörungen.

Als Ursache des Anstiegs der GLDH beim Verschlussikterus wird der behinderte Abfluss von Gallensäuren vermutet. Er soll über einen Effekt der Detergenzien der Gallensäuren besonders in den Läppchenzentren liegende Mitochondrien schädigen /8/.

Literatur

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1.11 Lactat-Dehydrogenase (LDH)

Lothar Thomas

Die LDH ist eine NAD⁺-Oxidoreduktase und katalysiert die Oxidation von Lactat zu Pyruvat unter Verwendung von NAD⁺ als H⁺-Akzeptor. Die Reaktion ist reversibel und bei physiologischem pH wird die Umsetzung von Pyruvat in Lactat begünstigt.

Die im Serum messbare LDH (EC 1.1.1.27) besteht aus den Aktivitätsanteilen der fünf Isoenzyme LDH 1–5 (Tab. 1.11-1 – Isoenzyme der LDH). Das Isoenzym LDH-1 setzt gegenüber den anderen Isoenzymen das Substrat 2-Oxobutyrat mit hoher Geschwindigkeit zu Hydroxybutyrat um und kann getrennt als Hydroxybutyrat-Dehydrogenase bestimmt werden.

Die LDH ist in unterschiedlicher Aktivität im Zytoplasma der Gewebe vorhanden. Erhöhungen werden deshalb bei vielen Gewebeschäden diagnostiziert, haben aber auf Grund mangelnder Organspezifität eine nur mäßige differentialdiagnostische Aussagekraft. Die weiterführende quantitative Differenzierung der Isoenzyme bei erhöhter LDH erlaubt eine bessere Organ bezogene Diagnostik.

1.11.1 Indikation

• Differenzierung des Ikterus.
• Beurteilung des Ausmaßes der Hämolyse bei hämolytischer und megaloblastärer Anämie.
• Im Muster mit den Aminotransferasen bei Verdacht auf hypoxischen oder toxischen Leberschaden.
• Differenzierung von Organschäden durch Isoenzym-Bestimmung bei erhöhter LDH.
• Monitoring der Krankheitsaktivität bei Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphomen und Leukämien.
• Verlaufs- und Therapiekontrolle beim Dysgerminom des Ovars und Keimzelltumor des Hodens.
• Spätdiagnostik eines Herzinfarktes (über 36–48 h nach dem akuten Ereignis).

1.11.2 Bestimmungsmethode

IFCC Primary Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Activity Concentration of Lactate Dehydrogenase at 37 °C /1/

Prinzip: Die LDH katalysiert in einer Vorwärtsreaktion die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat bei einem pH von 9,4. Die Zunahme der Absorption des entstehenden NADH wird bei 334 nm, 336 nm oder 366 nm gemessen.

Siehe Tab. 1.11-2 – Prinzip der LDH-Bestimmung.

Selektive Bestimmung von LDH-1

Chemische Hemmung der M-Untereinheit:

Prinzip: 1, 6-Hexandiol oder Natriumperchlorat werden als selektive Inhibitoren der Isoenzyme der LDH mit M-Untereinheit dem Reaktionsansatz beigegeben und somit nur die LDH-1, die vier H-Untereinheiten besitzt, bestimmt /2/.

Immunologische Hemmung der M-Untereinheit:

Prinzip: Antikörper gegen die M-Untereinheit werden zur Probe gegeben und bilden Immunkomplexe mit Isoenzymen, die diese Einheit besitzen. Die Immunkomplexe werden abzentrifugiert, die LDH-1 bleibt im Überstand und wird dort bestimmt /3/.

Elektrophoretische Isoenzymdifferenzierung

Prinzip: Elektrophoretische Auftrennung des Serums im Agarosegel oder auf Zelluloseazetatfolie bei alkalischem pH-Wert. Die Wanderungsgeschwindigkeit zur Anode ist abhängig vom Anteil der Isomeren des Isoenzyms. Schnell wandern Isoenzyme mit dem Anteil der Isomeren H, langsam diejenigen mit dem Anteil der Isomeren M, die LDH-1 hat deshalb die größte, die LDH-5 die geringste Wanderungsgeschwindigkeit zur Anode. Die LDH-5 wandert zur Kathode.

Die Darstellung der Isoenzymfraktionen erfolgt in der Zelluloseazetatfolien-Elektrophorese durch Koppelung des enzymatisch gebildeten Pyruvats mit einem Tetrazoliumsalz /4/.

In der Agarosegel-Elektrophorese wird die Trennspur mit einer Lactat- und NAD⁺-haltigen Folie überdeckt und nach Inkubation bei 37 °C die Fluoreszenz des NADH bei 410 nm gemessen, unter Anregung bei 365 nm /2/.

1.11.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma, Ergussflüssigkeit: 1 ml

1.11.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.11-3 – Referenzbereiche der LDH.

1.11.5 Bewertung

Die LDH ist ein zytoplasmatisches Enzym und Bestandteil aller Gewebe. Bei bereits geringen Organschäden tritt sie vermehrt ins Plasma über und ist bei vielen pathologischen Zuständen erhöht. Erkrankungen, die eine LDH-Erhöhung im Serum verursachen, zeigt Tab. 1.11-4 – Erkrankungen, die eine Erhöhung der LDH bewirken können. Diagnostisch ist die LDH vergleichbar unspezifisch wie die Blutsenkungsreaktion, somit von begrenzter Bedeutung und sollte vorwiegend eingesetzt werden /8/:

• In der Kardiologie zur Spätdiagnostik des Herzinfarktes. So beträgt 24 h nach dem akuten Ereignis die diagnostische Sensitivität 95 % bei einer Spezifität unter 90 %. Die Aussagekraft des Quotienten LDH-1/LDH-2 ist besser, die diagnostische Effizienz beträgt 93–98 %. Die Troponinbestimmung hat die LDH und ihre Isoenzyme in der Kardiologie abgelöst.
• In der Hepatologie zur Abgrenzung des schweren toxischen Leberschadens und der akuten Durchblutungsstörung von der akuten Virushepatitis. Bei Auftreten von klinischen Beschwerden ist bei der akuten Durchblutungsstörung oder einer toxischen Störung, z.B. durch Azetaminophen, die LDH oft höher als die Aminotransferasen. Das ist bei der Virushepatitis nicht der Fall /9/. Generell ist in der Leberdiagnostik die LDH das am wenigsten spezifische Enzym /10/.
• Im Monitoring onkologischer Erkrankungen wie malignen Lymphomen, Leukämien und einiger solider Tumoren wie den Keimzelltumoren.
• In der Differentialdiagnostik des Ikterus, insbesondere zur Abgrenzung der hämolytischen von der hepatischen Genese.

Wichtige diagnostische Indikatoren zur Organ-spezifischen Differenzierung einer Erhöhung der LDH sind:

• Die Berechnung des Quotienten LDH/AST.
• Die quantitative Bestimmung der Isoenzyme der LDH (Tab. 1.11-5 – Aussage elektrophoretischer LDH-Muster).

Quotient LDH/AST

Der Quotient wird zur Abgrenzung des prähepatischen, durch Hämolyse- oder Dyserythropoese bedingten, vom hepatischen Ikterus bestimmt. Quotienten über 5 sprechen für die hämolytische Genese, Werte darunter für die hepatische. Bei Metastasenleber und infektiöser Mononukleose können ebenfalls Quotienten über 5 auftreten. Das Bilirubin ist beim prähepatischen Ikterus, außer bei starken hämolytischen Krisen (Sichelzellanämie), unter 6 mg/dl (100 μmol/l) /10/.

Siehe Abb. 1.11-1 – Abgrenzung des prähepatischen vom hepatischen Ikterus.

LDH-Isoenzyme quantitativ

Das LDH Molekül besteht aus vier Polypeptidketten der zwei Typen M und H, die beide unter getrennter genetischer Kontrolle sind. Auf Grund der Zusammensetzung der Untereinheiten werden fünf Isoenzyme unterschieden. Siehe Tab. 1.11-1 – Isoenzyme der LDH.

Drei Muster der LDH werden bei der elektrophoretischen Auswertung differenziert. Siehe Tab. 1.11-5 – Aussage elektrophoretischer LDH-Muster /4/:

• Anodisches Muster; LDH 1 + 2.
• Kathodisches Muster; LDH 4 + 5.
• Intermediäre Gruppe; LDH-3 dominiert.

1.11.6 Hinweise und Störungen

Probenvorbereitung

Plasma sollte hochtourig zentrifugiert werden (10 min bei 3.000 × g) da es sonst noch Thrombozyten enthält; diese haben eine hohe Konzentration an LDH.

Referenzbereich

Erfolgt die Blutentnahme nach körperlicher Belastung (Muskelaktivität), so können die LDH über dem oberen Referenzbereichswert liegen. Kapillar entnommenes Serum und Plasma hat höhere Werte der LDH. Auf Grund der Hämolyse während des Gerinnungsvorganges sind die Werte im Serum höher als im Plasma.

Hämolyse

Verursacht erhöhte Werte, da die LDH im Erythrozyten 360 fach höher ist als im Plasma. Bei einer mittleren Aktivität von 165 U/l verursacht eine Hämolyse von 0,8 g Hb/l einen Anstieg der LDH von 58 % /38/. Das Serum muss innerhalb von 2 h vom Blutkuchen getrennt sein.

Thrombozyten-Interferenz

Serum und Thrombozyten-freies Plasma haben die gleiche LDH Aktivität. Die Störung der LDH einer Plasmaprobe durch Kontamination mit Thrombozyten ist bei der Bestimmung von den Reaktionsbedingungen abhängig. Wird die Probe in ein relativ großes Volumen an hypotonem Reagenz pipettiert, resultiert durch Lyse eine LDH Erhöhung. Erfolgt die Zugabe in isotones Reagenz, kommt es nicht zur Lyse, es resultiert aber eine optische Interferenz. Es werden falsch-niedrige LDH-Werte gemessen, da der NADH bedingte Extinktionsabfall während der Bestimmung maskiert wird durch eine Extinktionszunahme in der Reaktionszeit, bedingt durch die Lichtabsorption der Thrombozyten /39/.

Eine stärkere Kontamination von Thrombozyten im Heparinplasma durch unzureichende Zentrifugation führt bei der IFCC-Methode nur zu einer geringen Erhöhung der Impräzision /40/.

Stabilität

Im Serum bei Raumtemperatur (20 °C) bis zu 7 Tage stabil /2/. Die Lagerung des Serums zur Routineanalytik sollte bei Raumtemperatur erfolgen, auf Grund der Kältelabilität von LDH-4 und LDH-5.

Medikamente

Eine in vivo-Erhöhung der LDH kann erfolgen durch Allopurinol, Amiodaron, Androgene/anabole Steroide, Aspirin/Salizylate, Captopril, Carbamazepin, Chlorpromazin, Cisplatin, Clozapin, Cumarine, Dacarbazin, Diltiazem, Erythromycin, Fluphenazin, Goldsalze, α-Methyldopa, Naproxen, Paracetamol, Papaverin, Penicillamin, Perhexillin, Phenytoin, Phenylbutazon, Propylthiouracil, Ranitidin, Sulfasalazin, Tienilinsäure, Valproinsäure, Verapamil /41/.

Halbwertszeit

LDH-1, 4–5 Tage, LDH-5, 10 h.

Makro-LDH

Siehe weiterführend Tab. 1.1-2 – Makroenzyme: Charakterisierung, klinische Bedeutung und Labordiagnostik.

1.11.7 Pathophysiologie

Die LDH ist ein Wasserstoff übertragendes Enzym, das die Oxidation von L-Lactat zu Pyruvat katalysiert unter Inanspruchnahme des Hilfsenzyms NAD⁺ als Wasserstoffakzeptor. Die Reaktion ist reversibel und bei physiologischem pH wird die Reduktion von Pyruvat zu Lactat stark begünstigt.

Jedes Molekül LDH besteht aus 4 Untereinheiten vom MG 34 kD. Es gibt zwei Typen von Untereinheiten, den Herz (H)- und den Muskel (M)-Typ, sie werden von unterschiedlichen Genloci determiniert. H- und M-Typ sind in den Geweben zu fünf Isoenzymen (LDH 1–5) kombiniert. Der H-Typ herrscht in Geweben mit hohem O₂-Verbrauch vor, der M-Typ in Geweben mit starker glykolytischer Aktivität.

Die LDH ist in allen Körperzellen vorhanden. Sie liegt dort zytoplasmatisch gelöst vor und wird bei Zellschädigung freigesetzt. Die Enzymaktivität der einzelnen Gewebe ist unterschiedlich und beträgt im Skelettmuskel 147 U/g, im Herzmuskel 124 U/g, in der Leber 145 U/g und in der Niere 106 U/g. Die Erythrozyten enthalten 31 U/g Hämoglobin. Die Aktivität in den Geweben ist im Mittel 500 fach höher als im Serum und schon kleine Gewebeschäden können zur Erhöhung der LDH führen. Zusätzlich haben viele Gewebe eine unterschiedliche Ausstattung mit Isoenzymen. Im Herzmuskel und den Erythrozyten dominieren LDH-1 und LDH-2, in der Leber LDH-5. Die LDH-3 und LDH-4 kommen in Lunge, lymphatischen System, Milz, in endokrinen Drüsen und den Thrombozyten vor.

Die Aktivität der LDH im Serum ist bei Krankheiten abhängig von den Isoenzymen, die aus den Geweben in das Plasma übertreten, der Geschwindigkeit der Elimination der Isoenzyme und ihren Untereinheiten. So beträgt die Halbwertszeit der Leber-spezifischen LDH-5 (M4) mit 8–12 h nur etwa 1/10 der Herz- und Erythrozyten-spezifischen LDH-1 (H4). Ein Leber-typisches LDH Muster wird deshalb häufig nur kurzfristig, ein durch Herzmuskelschaden oder Hämolyse bedingtes demgegenüber längerzeitig gemessen /11/.

Die bei progressiver Muskeldystrophie Typ Duchenne im Serum nachweisbare LDH entspricht vorwiegend den Isoenzymen LDH-1–3 und nicht der LDH-4 des gesunden Skelettmuskels. Da diese Abnormität auch bei den Konduktorinnen gefunden wird, dürfte bei diesen eine genetisch bedingte Unfähigkeit bestehen, die M-Untereinheit ausreichend zu bilden /19/.

Die Begleithepatitis bei infektiöser Mononukleose (IM) ist von den anderen Virushepatitiden auf Grund der hohen Aktivität der LDH in Relation zu den Aminotransferasen abgrenzbar. Pathologisch erhöht ist nicht das Leberisoenzym (LDH-5), sondern die LDH-3 und LDH-4, deren Ursprungsort bei der IM das lymphatische System ist.

Die Erhöhung derLDH bei megaloblastärer Anämie beruht auf einer ineffektiven Erythropoese, da auf Grund eines Vitamin B₁₂- oder Folsäure-Mangels erythroide Vorläuferzellen im Mark nicht ausreifen und der Apoptose anheim fallen.

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1.12 Lipase

Klaus Lorentz

Im Serum messbare Lipase wird in den azinären Zellen des Pankreas synthetisiert, in deren Granula gespeichert und zu über 99 % über den apikalen Pol der Zellen in das Gangsystem des Pankreas sezerniert. Bei akuter Pankreatitis gelangt das Enzym durch erhöhte Permeabilität am basalen Zellpol vermehrt in das Blut.

1.12.1 Indikation

• Nachweis und Ausschluss der akuten Pankreatitis (bei akutem Oberbauchschmerz).
• Nachweis der chronischen Pankreatitis (im Rezidiv).
• Ausschluss einer Pankreas Beteiligung bei abdominalen Erkrankungen und chirurgischen Eingriffen.
• Verlaufskontrolle nach endoskopisch retrograder Choledochopankreatographie (ERCP).

1.12.2 Bestimmungsmethode

Grundlage aller Bestimmungen ist die Hydrolyse von Triglyceriden, Diglyceriden oder Monoglyceriden. Die Lipase ist nur aktiv, wenn das Substrat in emulgierter Form in der Zwischenphase vorliegt. Die Anwesenheit von Gallensalzen und einem Protein (Colipase) ist notwendig. Nur folgende Methoden sind, da mechanisierbar kommerziell verfügbar /1/:

• Der kinetisch enzymatische Diglycerid-Test, der eine Folge von Indikator und Hilfsenzymen anwendet
• Der 1,2-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester (DGMRE)-Test.

Titrimetrische Tests

Es wird die Freisetzung von Fettsäure am C-Atom 1 oder 3 von Glycerin gemessen. Mehrstufige photometrische Methoden beruhen auf der Bestimmung von Glycerin nach enzymatischer Abspaltung restlicher Acylreste. Ein einstufiges photometrisches Verfahren benutzt ein Triglycerid Analog als Substrat /1/. Die analytische Spezifität aller Verfahren ist begrenzt, da selbst in Gegenwart von Gallensäuren lösliche oder durch Detergenz gelöste Substrate einen Abbau durch Esterasen zulassen.

Autotitration /2/: Sie ist die Methode höchster analytischer Spezifität. Man titriert die aus einer Emulsion von Triolein oder Olivenöl freigesetzte Ölsäure mit Lauge während der enzymatischen Hydrolyse kontinuierlich auf pH 9,0 (pH-Stat). Da pro gespaltene Esterbindung ein Proton neutralisiert wird, handelt es sich um ein direkt messendes Verfahren, das sich wegen seiner technischen Ansprüche nicht zur Routineanalytik eignet. Es ist gut standardisiert, alle photometrischen Methoden werden auf die Autotitration bezogen /2, 3/.

Turbidimetrischer Test /4/: Die Bedingungen ähneln denen der Autotitration, zeigen mit Anstieg von Lipase nach Gabe von Heparin aber bereits eine Mitreaktion von Lipoproteinlipase an. Gemessen wird photometrisch nahe 550 nm mit Bezug auf titrimetrisch kalibrierte Standards. Dabei werden Beginn und Dauer der Messintervalle von Analysatoren so gewählt, dass zeit lineare Reaktionsraten anzunehmen sind und Messbereiche vom 5–10 fachen des oberen des Referenzbereichswerts erreicht werden. Eine analytische Schwäche ist die positive Interferenz durch Esterasen, obwohl alle Methoden im Ansatz Esterasen enthalten.

DGMRE-Methode /1/: Es handelt sich um ein einstufiges Verfahren, das als Triglycerid Analog das Substrat 1,2-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester (DGMRE) benutzt. In diesem Triglycerid Analog sind zwei Ester durch Hydrolyse-resistente Äther ersetzt. Lipase spaltet daher nur am C-Atom 1 einen farblosen Acylrest ab, der spontan in Glutarsäure und rotes Methylresorufin zerfällt.

Diglycerid-Methode /4/: Bei diesem Farbtest setzt Lipase aus einem 1,2-Diglycerid ein 2-Monoglycerid frei, das durch Monoglyceridlipase zu Glycerin abgebaut wird. Dies wird nach drei weiteren Reaktionen (Phosphorylierung, Oxidation, oxidative Kupplung) als Benzochinondiimin Farbstoff gemessen. Neben Lipoproteinlipase und Cholesterinesterase reagieren wahrscheinlich auch intestinale Lipase und Carboxyl­esterase.

Reagenzträger-Test (Vitros-Methode) /5/: Das Verfahren benutzt 1-Oleoyl-2,3-diacetylglycerin als Substrat. Lipase spaltet es in Ölsäure und 2,3-Diacetylglycerin, aus dem Diacetinase Glycerin freisetzt, das als Farbstoff nach obiger Reaktionskette gemessen wird. Da Dodecylbenzolsulfonat dabei Gallensäuren als Lösungsvermittler ersetzt, stören neben Glycerin /6/ alle genannten Enzyme /7/, so dass dem Verfahren eine bevorzugte Messung von gastrointestinalen Lipasen zugeschrieben wird /8/.

1.12.3 Untersuchungsmaterial

• Serum, Heparinplasma: 1 ml
• Pleuraerguss, Aszites, Drainagesekret, Peritonealspülflüssigkeit: 1 ml

1.12.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.12-1 – Referenzbereiche der Lipase.

1.12.5 Bewertung

Die diagnostische Beurteilung der Lipase im Serum hängt von der gewählten Methode und der klinischen Fragestellung ab. Für Verlaufskontrollen einer akuten oder einer chronisch rezidivierenden Pankreatitis ohne Beteiligung anderer Organe im Abdomen eignen sich alle Methoden, für den Ausschluss dieser Erkrankungen nur Bestimmungen, die eine Emulsion von Triglyceriden einsetzen.

Beachtet man diese Voraussetzungen, so gilt:

• Lipase ist sensitiver für die Erkennung einer Pankreatitis als die α-Amylase, da ihr synchron verlaufender Anstieg nicht früher, aber höher und länger den Referenzbereich verlässt. Siehe Beitrag 1.4.5 – Bewertung.
• Je niedriger die Trennschwelle zwischen unauffälligem und pathologischem Wert gesetzt wird, desto häufiger werden extra pankreatische Erkrankungen bei erhöhter Lipase diagnostiziert.
• Wird die Obergrenze des Referenzbereichs zur Entscheidungsgrenze, so haben alle Methoden bei akuter Pankreatitis oder Exazerbation einer chronischen Entzündung eine diagnostische Sensitivität von 90–100 % bei einer Spezifität von 60–97 %.
• Keine der unter Bestimmungsmethode genannten Verfahren erreicht unter Routinebedingungen die biochemische Selektivität und analytische Güte der Messung der Pankreasamylase.
• Siehe Tab. 1.12-2 – Diagnostische Sensitivität und Spezifität einer Erhöhung der Lipase in Abhängigkeit von der Trennschwelle bei akuter Pankreatitis am Tag der Erkrankung.

Im Unterschied zur Bestimmung der α-Amylase können mit dem immunologischen Test /2/ bei exkretorischer Pankreasinsuffizienz vereinzelt subnormale Lipasewerte gemessen werden /15/. Im Zeitprofil von Entzündungen des Pan­kreas­ und nach endoskopisch retrograder Choledochopankreatographie (ERCP) verhält sich Lipase wie α-Amylase und deren nicht saliväre Fraktion. Die ursprüngliche Annahme unterschiedlicher Lipase/α-Amylase Quotienten bei Alkohol-induzierten und biliär bedingten Pankreatitiden hielt einer kritischen Prüfung nicht stand. Auch der Nachweis von Isolipasen mit dem Reagenzträger-Test hat keinen Eingang in die klinische Diagnostik gefunden, da die Bedeutung dieser (möglichen) Isoenzyme im Vergleich zu Isoamylasen weitgehend unbekannt ist.

Hyperlipasämien verursachen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen diagnostische Probleme. Erhöhungen von α-Amylase oder Lipase bezeichnen nicht obligat eine Beteiligung des Pankreas oder seine Schädigung durch Azathioprin und Salazosulfapyridin /16/.

Bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa werden zu 14–21 % eine erhöhte Lipase gefunden, wobei auch ohne Vorliegen einer Pankreatitis dieLipase den Referenzbereich etwas häufiger verlässt als die α-Amylase /17/.

Während Karzinome des Pankreas nur selten (durch Verschluss des Ductus pancreaticus) eine Erhöhung der Lipase verursachen, werden normale α-Amylase-, aber deutlich erhöhte Lipasewerte im Serum beim undiffenzierten Malignom sowie hepatozellulären und Adenokarzinomen ohne autoptisch erkennbare Pankreasbeteiligung beobachtet /18/. Sicher pankreatogener Herkunft sind immunologisch gemessene Lipasewerte bis zum 20 fachen oberen Referenzbereichswert bei diabetischer Ketoazidose, die bei 50 % der Patienten auftreten mit Anstieg von Trypsin und α-Amylase aber ohne klinische Zeichen einer Pankreatitis /19/. Die Ursachen der Lipaseerhöhung zeigt Tab. 1.12-3 – Ursachen einer Erhöhung der Lipase im Serum.

1.12.6 Hinweise und Störungen

Antikoagulantien

Die Probe darf wegen der Komplexierung von Ca²⁺ kein EDTA, Oxalat, Fluorid oder Citrat enthalten.

Bestimmungsmethode

Vom Reagenzträger Test abgesehen, sollten Seren mit Triglyceridämie über 870 mg/dl (10 mmol/l) verdünnt werden. Hämoglobin über 5 g/l und Bilirubin über 47 mg dl (800 μmol/l) erniedrigen die Messwerte. Medikamente haben in üblicher Dosierung keinen Einfluss.

Bei Einsatz des Tests mit 1,2-Diglycerid darf in Analysen- systemen keine Esterase aus der Bestimmung von Cholesterin in die Ansätze gelangen. Glycerin stört im Reagenzträger Test.

Der enzymatische Diglycerid-Test und der DGMRE-Test haben eine vergleichbare analytisch Spezifität /1/.

Makrolipasämie

Siehe Tab. 1.1-1 – Halbwertszeiten von Serumenzymen.

Stabilität

Im Serum mindestens 1 Woche bei 4 °C oder 25 °C, 1 Jahr bei –28 °C.

1.12.7 Pathophysiologie

Humane Pankreaslipase (Triacylglycerol Acylhydrolase, EC 3.1.1.3) ist ein monomeres Glykoprotein aus 449 Aminosäuren in zwei Domänen mit einem MG von 47 kD. Typischerweise hydrolysiert sie unlösliche Triglyceridester langkettiger Fettsäuren an der Grenzfläche Wasser-Substrat bei pH 8,8–9,2 nur, wenn das Substrat mit Gallensäuren in mizellaren Komplexen vorliegt. Kolipase (MG 9,9 kD) aktiviert das katalytische Zentrum durch Öffnen eines darüber liegenden Deckels aus 12 Aminosäuren, verankert es an der hydrophoben Grenzfläche und schützt das Enzym gegen eine Inaktivierung durch Gallensäuren.

Lipase wird in den Acinuszellen des Pankreas produziert und zu über 99 % über den apikalen Zellpol in das Gangsystem der Drüse abgegeben. Weniger als 1 % treten am basalen Pol in Lymph- und Blutkapillaren über (exogen-endogene Partition), so dass ein Konzentrationsgradient von 1 : 500 bis 1 : 800 zwischen Serum und Duodenalsekret besteht.

Bei der akuten Pankreatitis liegt eine abnorme Permeabilität des basalen Zellpols mit gesteigertem Übertritt des Enzyms in den Kreislauf vor. Bei der hämorrhagischen Form treten Zellnekrosen hinzu. Wird der normale Abfluss, durch narbige Strikturen bei chronischer Entzündung, Sialolithiasis, Obstruktion durch Papillentumor oder -ödem gestört, kommt es durch den Sekretdruck zu Dehiszenzen der Isthmen mit Abfluss in perikapilläre Räume.

Bei chronischer Pankreatitis ist dieser Prozess mit weiterem Schwund des Parenchyms verbunden, der wegen der geringen endogenen Enzym Fraktion nicht durch einen Abfall der Aktivität im Serum zu erkennen ist. Vielmehr steigt beim Rezidiv, wie bei akuter Entzündung einer chronischen Pankreatitis, mit Schmerz verbunden durch die Abflussstörung des gestauten Organs, die Konzentration im Serum an. Eine funktionelle Insuffizienz ist daher nicht durch Bestimmung im Serum, auch nicht nach Sekretin-Pankreozymin Stimulation, zu erkennen, sondern nur durch Messung der Lipasewirkung intraduodenal.

Lipase steigt mit zunehmendem Alter an. Im Serum der Nabelschnur werden nur 12 % der Konzentration gemessen, die zwischen den Lj. 3–50 vorliegt und dann bis zum 70. Lj. auf 112 % zunimmt /2/. Das Enzym besitzt eine Halbwertzeit von 6,9–13,7 Stunden und wird mit einer Clearance von 6 ml/min glomerulär filtriert, vollständig tubulär reabsorbiert und abgebaut, so dass Lipase im Urin nur bei ausgeprägter Proteinurie nachzuweisen ist.

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1.13 Saure Phosphatase (SP)

Lothar Thomas

1.13.1 Indikation

• Verdacht auf Knochentumoren bzw. Knochenmetastasen.
• Morbus Gaucher.

1.13.2 Bestimmungsmethode

Prinzip: Die SP setzt im pH-Bereich 4,5–6,0 Substrate wie α-Naphthylphosphat oder p-Nitrophenylphosphat unter Abspaltung von anorganischem Phosphat um. Gemessen wird entweder freigesetztes α-Naphthol nach Kupplung mit farbigem Azoreagenz, z.B. Fast-Red TR-Salz oder das freigesetzte Nitrophenol nach Alkalisierung des Ansatzes /1/.

1.13.3 Untersuchungsmaterial

Serum, Plasma (kein Heparin und Oxalat): 1 ml

1.13.4 Referenzbereich

Siehe Tab. 1.13-1 – Referenzbereich der sauren Phosphatase

1.13.5 Bewertung

Unter dem Begriff saure Phosphatase werden alle Phosphatasen zusammen gefasst, die ihre maximale enzymatische Aktivität bei einem pH unter 7,0 haben. Die im Serum messbare SP (EC 3.1.3.2) ist deshalb ein Gemisch vieler Enzyme, die vorwiegend aus Thrombozyten, Erythrozyten, Knochen, Zellen des retikulo-endothelialen Systems und der Prostata stammen. Durch Tartrat hemmbar sind besonders die Aktivitäten aus der Prostata und den Thrombozyten. Erhöhte Werte der SP können Indikatoren des Prostatakarzinoms, von Erkrankungen des Skelett­s und des retikulo-endothelialen Systems sein.

Siehe Tab. 1.13-2 – Erkrankungen, die mit einer Erhöhung der SP im Serum einhergehen können.

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